维拉帕米在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途

本发明属于生物制药领域，具体涉及维拉帕米制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途。

背景技术：

1、下腰痛作为骨科门诊最常见主诉之一，是影响伤残调整生命年(disability-adjusted life-years,dalys)的十大疾病原因之一。椎间盘退变(intervertebral discdegeneration,ivdd)作为公认引起下腰痛的重要风险因素，现阶段针对退变后所引起疼痛的保守治疗效果并不理想，多数患者最终仍需手术治疗，因此带来的经济、潜在医源性损伤和心理问题不可避免。因此如何针对ivdd防治下腰痛是目前脊柱外科领域的重难点研究。在患者椎间盘退变临床病理标本及基础研究中发现髓核组织的异常改变显著，因此关于髓核细胞代谢、命运及细胞外基质分泌的研究是防止ivdd的关键。基于这些，研究干预椎间盘退变、保护髓核细胞的药物应用具有极其重要的临床意义及科研价值。

2、维拉帕米(verapamil)是一种钙通道阻滞剂，临床应用已有五十余年历史。其广泛应用于高血压，心绞痛、肥厚型心肌病和快速性心律失常等心内科疾病。此外，近年来还有将维拉帕米应用于治疗神经内科疾病如脑血管病、偏头痛，血管外科疾病如血管痉挛，普外科疾病如腹痛、食道失驰缓症，心内科疾病如肺动脉高压和产科如早产情况等。然而，维拉帕米是否可以延缓椎间盘退变，目前尚无有关报道，本发明由此而来。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品的用途。本发明公开了维拉帕米作为药物的新用途，说明维拉帕米对治疗椎间盘退行性病变有良好效果。

2、发明人经过研究发现geo数据库中椎间盘退变相关人类髓核样本和叔丁基过氧化氢(tbhp)刺激的大鼠髓核细胞中硫氧还蛋白互作蛋白(txnip)表达异常增加，且病灶粘附、细胞外基质受体相互作用和凋亡通路在髓核退变时表达变化显著。并且进行了rna和蛋白质水平的实验，结果显示在氧化应激失衡条件下，髓核细胞中txnip显著上调。

3、基于此，本发明技术方案首先采取叔丁基过氧化氢(tbhp)诱导大鼠髓核细胞产生氧化应激，应用维拉帕米干预来观察是否其能延缓髓核细胞的退变，应用rt-qpcr、westernblotting、细胞免疫荧光、流式细胞技术等手段测定：活性氧簇(ros)、基质金属蛋白酶3(mmp-3)、基质金属蛋白酶9(mmp-9)、基质金属蛋白酶13(mmp-13)、adamts5、sox9和txnip等的水平，评估维拉帕米对椎间盘退变的影响及其作用机制。经过实验证明维拉帕米抑制tbhp诱导下的细胞凋亡(通过bax和cleaved caspase-3测量)、氧化应激介质(ros)和与ecm降解相关的分解代谢因子(mmp3、mmp9、mmp13、adamts5)。此外，验证了维拉帕米对细胞存活促进因子(bcl-2)和ecm合成代谢因子(sox9)上调的髓核细胞保护作用。还发现验证了维拉帕米可上调nrf2和相应的下游途径，如tbhp刺激的np中的ho-1和nqo1，从而抑制txnip/nlrp3轴的激活，以此进一步抑制炎性细胞因子如il-1β的产生。

4、本发明第一方面提供维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品的用途。

5、在一些实施方式中，所述用途制备下列产品中的一项或多项：

6、1)用于挽救髓核细胞外基质异常降解的产品；2)用于保护髓核细胞、抑制髓核细胞凋亡和/或焦亡的产品；3)用于降低氧化应激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品；4)用于减少细胞内txnip表达水平的产品；5)用于调节txnip的上游和/或下游信号通路的产品；6)用于降低炎症刺激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品；7)用于维持椎间隙高度，延缓椎间盘退变的发展的产品；8)用于提高椎间盘的应激与修复能力的产品；9)用于预防、减轻或延缓由氧化应激引起的椎间盘退变产品。

7、具体的，1a)所述挽救髓核细胞外基质异常降解的产品为下调mmp3基因表达、和/或下调mmp9基因表达、和/或下调mmp13基因表达、和/或下调adamts5基因表达、和/或上调ecm合成代谢因子sox9的产品；2a)所述保护髓核细胞的产品为上调bcl-2基因表达、和/或下调bax基因表达、和/或下调cleaved caspase-3基因表达的产品；3a)所述降低氧化应激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品为抑制ros氧化应激介质表达的产品；4a)所述减少细胞内txnip表达水平的产品为激活nrf2并抑制txnip降低nlrp3炎症小体的形成产品；5a)所述调节txnip的上游信号通路的产品为调节nrf2基因表达的产品，所述调节txnip的下游信号通路的产品为调节nlpr3基因表达的产品；6a)所述降低炎症刺激对髓核细胞的损伤或改善髓核细胞的生理状态的产品为上调nrf2和相应的下游途径，从而抑制txnip/nlrp3轴的激活，从而抑制炎性细胞因子如il-1β基因表达的产品。

8、在一些实施方式中，所述产品的活性成分选自维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。

9、在一些实施方式中，所述产品中活性成分的含量为0.001-99wt％，根据活性成分的含量根据具体需求进行选择，例如0.001-1wt％，1-10wt％，10-20wt％，20-30wt％，30-40wt％，40-50wt％，50-60wt％，60-70wt％，70-80wt％，80-90wt％或90-99wt％。对于预防性保护椎间盘退变，促进椎间盘的干细胞龛内细胞有效向髓核细胞分化中的用途中，只要添加0.001wt％；对于有临床症状的椎间盘退变，为改善椎间盘内髓核的增殖代谢以及细胞外基质表达的用途中，需要添加99wt％，该用途中一般予以局部椎间盘内单药注射，无需联合其它药物。

10、在一些实施方式中，所述产品选自组合物或制剂；优选的，所述组合物自药物组合物、化妆品组合物、膳食补充剂、食品组合物或保健品组合物；再优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；更优选的，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。临床工作中对于严重椎间盘退变一般选用脊柱微创手术、脊柱内固定融合术，手术中通过内固定、融合邻近节段椎体以保护神经免遭压迫。含有维拉帕米的产品可以通过各种方式向需要的对象施用，使用方便。

11、本发明第二方面提供一种组合物，包括维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。所述组合物为药物组合物。优选的，所述药物组合物的主要活性成分为维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。更优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

12、本发明第三方面提供上述组合物在制备预防、减轻或延缓椎间盘退变产品中的用途。

13、本发明第四方面提供一种体外筛选预防或减轻椎间盘退变药物的方法，所述方法包括：1)以txnip为药物靶点，寻找能够抑制或阻断txnip的表达或功能的物质作为候选药物；2)向体外细胞培养体系中施加待选药物，共培养检测细胞中的txnip含量；3)与对照组相比，txnip含量降低，判定为目标药物。

14、本发明第五方面提供一种体外抑制txnip表达量的方法，所述方法包括：将维拉帕米或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物与细胞培养体系混合培养。

15、具体的，体外减少txnip蛋白表达量中的方法中所述培养体系中至少包括如下技术特征中的至少一项；维拉帕米的浓度为0.01-100μm；所述细胞来源于哺乳动物；优选的，所述细胞选自人细胞；所述细胞为体细胞；所述细胞选自骨髓间充质干细胞、骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、软骨祖细胞、软骨细胞或其组合。

16、本发明的有益效果在于：

17、1)本发明发现椎间盘退变中，txnip表达异常增加，因此将维拉帕米应用到制备预防、减轻或延缓椎间盘退变的产品中。并证实了维拉帕米可以减轻和延缓椎间盘退变。具体的，维拉帕米可以有效地降低髓核细胞内txnip水平，挽救退变下细胞外基质降解，维持椎间盘细胞外基质稳定，从而减轻椎间盘退变。

18、2)维拉帕米作为一种已上市的老药，具有较高的使用安全性，临床工作中维拉帕米一般是作为治疗高血压、心绞痛或抗心律失常等心血管疾病用药，本发明首次发现活性成分维拉帕米(或含维拉帕米的组合物和产品)可应用于保护髓核细胞，延缓椎间盘退变疾病。

19、3)根据椎间盘退变的严重程度，控制组合物或制剂中的维拉帕米的含量为0.001～99wt％，对于预防性保护椎间盘退变，促进椎间盘的干细胞龛内细胞有效向髓核细胞分化中，只要添加0.001wt％即可，对于有临床症状的椎间盘退变，为改善椎间盘内髓核的增殖代谢以及细胞外基质表达需要添加99wt％，一般予以局部椎间盘内单药注射，无需联合其它药物。

20、4)通过椎间盘内局部给药的方式，维拉帕米展现出保护髓核细胞减轻椎间盘退变作用，避免全身给药造成的系统性影响。