一种增强肿瘤免疫原性的原位纳米纤维材料及其制备方法和应用

本发明属于生物医用高分子材料，具体涉及一种增强肿瘤免疫原性的原位纳米纤维材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肝细胞癌(hcc)是世界上第五大常见恶性肿瘤。目前，由于hcc的诊断延迟和缺乏有效的治疗策略，大多数hcc患者在诊断为hcc时已处于晚期，预后有限，hcc患者的生存和预后仍然处于中等水平。而且与其他癌症相比，hcc对大多数化疗药物的敏感性较低，根治性手术切除仍是治疗hcc的首选和最有效的方法。然而，术后残留微肿瘤和免疫抑制肿瘤微环境(tme)是肿瘤复发和转移的主要原因，其治疗效果常受到挑战。目前，多种治疗策略如化疗、分子靶向治疗、放射治疗、光热治疗和免疫治疗被用于抑制肿瘤复发，但通常反应率较低。

2、分子靶向治疗(molecular targeted therapy, mtt)是一种通过干预肿瘤细胞中的特定分子或信号通路来抑制肿瘤生长和扩散的新型治疗方法，与传统化疗不同，其作用机制更精确，毒副作用更小。因此，在临床实践中得到了广泛的应用。由于hcc的高血管结构，多种血管靶向抑制剂包括anlotinib、sorafenib、sunitinib和pazopanib可以通过破坏已建立的肿瘤血管来减轻肿瘤负担。anlotinib(al)作为一种多激酶抑制剂，对vegfr2具有较强的特异性抑制作用，对hcc具有明显的凋亡和抗增殖活性。su等报道al可有效抑制肿瘤组织血管生成，使残余血管正常化，增加效应t细胞、巨噬细胞和抗原提呈细胞的浸润，从而改善tme。al虽然在肿瘤治疗中取得了积极的效果，它仍处于初级发展阶段，面临一些困难。首先，al直接应用于残余肿瘤可能导致渗透性差；其次，它导致药物可得性低和额外的毒性负担。

3、为了满足mtt的需求，光热疗法(ptt)因其精确的温度控制、无创和局部治疗而被引入。ptt主要依靠光热转导剂(ptas)将近红外光(nir)能量转化为热能来消融肿瘤细胞，热损伤肿瘤细胞释放抗原，触发肿瘤特异性细胞毒性t细胞(ctl)的激活，消除残留肿瘤。基于二维纳米材料的nir pta，如过渡金属碳化物、氮化物(mxenes)、黑磷(bp)和锗磷(gep)等，由于其光热特性和作为纳米载体实现大比表面积的高效药物递送而受到广泛关注。gep是一种间接窄带半导体，具有光热转换效率高、载药量大、生物相容性好等优点。ren等人制备了nh2-peg-fa修饰的gep-dox杂合物，表现出热刺激、药物持续释放和显著的肿瘤消融能力。尽管gep具有独特的优势和临床潜力，但2dgep在癌症纳米医学中的应用仍有待探索。

4、理论上，ptt治疗所施加的温和加热(～45℃)被认为是有利于免疫反应的关键变量。然而，如此小的温度升高可以刺激肿瘤细胞产生热应激抗性，如热休克蛋白、双加氧酶和程序性细胞死亡配体1(pd-l1)的表达上调。特别是，pd-l1可以与ctl表面的程序性细胞死亡1(pd-1)相互作用，使它们“失能”。在这种情况下，它激发了我们的建议，轻度ptt联合免疫检查点阻断(icb)将是一种有效的治疗方法。icb旨在逆转来自tme的信号，被推广为一种主要的治疗方式。重要的是，在pd-l1抗体(apd-l1)的阻断下，t细胞增殖和分化，产生长期的免疫记忆效应。fda批准的二线疗法atezolizumab和avelumab与肿瘤表面的pd-l1相互作用，在晚期hcc患者中显示出有希望的临床结果，但单独使用时仅略微有效。

5、因此，迫切需要开发一种安全有效的肝癌术后多策略治疗方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种增强肿瘤免疫原性的原位纳米纤维材料及其制备方法和应用。

2、基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种增强肿瘤免疫原性的原位纳米纤维材料的制备方法，包括如下步骤：将分子靶向药物anlotinib溶液和gep纳米片分散液混合均匀后得到混合液；将混合液加入载体溶液中，搅拌均匀后得到纺丝液；将纺丝液进行纺丝处理得到原位纳米纤维材料。

4、优选地，所述混合液中，分子靶向药物anlotinib和gep纳米片的质量比为（1-9）∶（9-1）。

5、优选地，所述分子靶向药物anlotinib溶液由anlotinib溶于溶剂中制备而成；所述分子靶向药物anlotinib溶液中anlotinib的质量浓度为0.1-2.5mg/ml；所述溶剂为六氟异丙醇、二氯甲烷或三氯甲烷中的任意一种。

6、优选地，所述gep纳米片为二维薄片；所述gep纳米片的尺寸为：长200nm-1μm，宽200nm-1μm，厚度3-4nm。进一步地，所述gep纳米片的制备方法为：将锗单质、磷粉和助熔剂加入瓷舟内混匀，将该瓷舟放入石英管内，并将石英管抽真空后高温封管，其中，所述锗单质和红磷的摩尔比为1∶2；将石英管加热至900-960℃并保温，再以2℃/h的速度降温至600℃，高温离心得到gep单晶块体；对gep单晶块体进行机械剥离得到gep纳米片。

7、优选地，所述gep纳米片分散液由gep纳米片分散于分散试剂中制备而成；所述gep纳米片分散液中gep纳米片的质量浓度为0.1-3mg/ml；所述分散试剂为六氟异丙醇、二氯甲烷或三氯甲烷中的任意一种。

8、优选地，所述分子靶向药物anlotinib溶液和gep纳米片分散液混合均匀的具体步骤为：将分子靶向药物anlotinib溶液和gep纳米片分散液超声处理5-10min后于黑暗条件下搅拌6-12h。

9、优选地，所述载体溶液是将可降解载体溶于载体溶剂中制备而成；所述载体溶液中可降解载体的质量分数为7wt%-15wt%；所述可降解载体为聚乳酸（包括左旋聚乳酸plla）、聚己内酯或聚羟基乙酸中的至少一种；所述载体溶剂为六氟异丙醇、二氯甲烷或三氯甲烷中的任意一种。更加优选地，当载体为plla时，所述plla溶液中plla的质量分数为7wt%-15wt%。

10、优选地，所述分子靶向药物anlotinib溶液和gep纳米片分散液的体积比为（1-9）∶（9-1）；所述混合液和载体溶液的体积比为（1-20）∶（99-80）。

11、优选地，所述纺丝处理的工艺参数为：接收器转速为0-3000rpm，接收距离10-20cm，喷射速率为0.5-1ml/h，电压为15-20kv。

12、本发明第二方面提供了上述第一方面所述的制备方法制备的原位纳米纤维材料。

13、本发明第三方面提供了上述第二方面所述的原位纳米纤维材料在肿瘤治疗药物中的应用。

14、优选地，所述肿瘤治疗药物为分子靶向治疗药物。

15、优选地，所述分子靶向治疗药物包括上述第二方面所述的原位纳米纤维材料和抑制性免疫检查点配体的抗体。

16、优选地，所述抑制性免疫检查点为pd-1；所述抑制性免疫检查点配体为pd-l1；所述抑制性免疫检查点配体的抗体为apd-l1。

17、优选地，所述原位纳米纤维材料通过植药针经皮穿刺或手术植入肿瘤病灶施用；所述抑制性免疫检查点配体的抗体通过静脉注射施用。进一步地，所述原位纳米纤维材料存在于所述肿瘤病灶的同时，用近红外光（nir）照射所述肿瘤病灶，以停止或抑制肿瘤的生长。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

19、（1）本发明构建了可降解载体负载分子靶向药物anlotinib和gep纳米片的原位纳米纤维，然后将该原位纳米纤维制成贴片直接敷于肿瘤病灶处，同时联合nir辅助照射，提高用药效率。进一步地，本发明构建的原位纳米纤维贴片在nir的辅助照射下还可联合apd-l1处理，首次以抑制hcc血管过度生长为出发点，结合ptt和icb治疗，以多功能平台实现了三种治疗策略之间的协同增强效应。这种三模式联合治疗级联增强了术后残余肿瘤的免疫原性，促进了dcs的成熟和肿瘤抗原的提呈，进而激活效应t细胞产生强大的肿瘤杀伤作用，同时产生持久的抗肿瘤免疫记忆，也即增强了免疫反应的三个阶段，包括免疫启动、免疫激活和免疫疗效，有助于重塑“冷”tme。

20、（2）本发明以plla为载体制备的纳米纤维，即al和gep的“药库”，从根本上解决了局部游离药物的快速扩散和代谢问题。而且通过调节al/gep质量比、静电纺丝参数(如电压、注射速度、距离)、辐照强度等参数，可以达到理想的药物释放行为和抗肿瘤效果。因此，本发明制备的pag原位纳米纤维贴片可以根据癌症类型、分期、大小和微环境进行个性化治疗。综上，本发明构建的原位纳米纤维贴片成分简单，而且具有灵活的配方，通过简单易操作的绿色静电纺丝技术即可制备。而且plla作为人体微量元素之一，具有可生物降解性，对人体具有重要的健康意义。

21、（3）本发明通过局部给药提高了al的输送效率，克服了通过纳米载体全身给药效率低下的问题，以及生物利用度低、靶向性差和临床转化困难等问题。

22、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。