一种正气片及其制备工艺与其中多成分定量定性的测定方法与流程

本发明属于中药制备及其中药成分检测的，涉及一种正气片及其制备工艺与其中多成分定量定性的测定方法。

背景技术：

1、正气片为传统中成药，主要用于治疗伤风感冒、头痛胸闷、吐泻腹胀等，其可以解暑祛湿，多用于外感暑湿引起的发热、胸闷、腹胀、吐泻。亦可和胃止呕，多用于湿浊过盛引起的恶心呕吐，同时可芳香化浊，常用于脾湿胃浊引起的食欲不振、舌苔厚腻、腹泻等症。其属于藿香正气系列产品，但正气片与藿香正气片(丸、滴)的处方、处方量和工艺上有显著性差异，两者物质基础差异性较大，属于不同的中成药。因此，对于正气片的组成、制备及所含成分的定量定性检测，无法借鉴藿香正气片。

2、目前，正气片正开展各类研究。中药指纹图谱具有整体、宏观、模糊分析等特点，可通过对中药整体特征的描述，采用适当模糊处理方式，达到整体质量控制的目的，因此成为中药质量控制的有效手段。其中色谱指纹图谱分析可以使中药所含多种化学组分的整体特征可视化，从而披露出常规检验难以发现的质量问题。但中药指纹图谱并不能够对中药中的众多成分进行定量定性测定。中国专利2018109246518中建立了正气片的高效液相指纹图谱，但未对正气片中所含成分进行定量定性测定。中国专利2020113871985中建立了正气片的气相指纹图谱，仅仅指出了3种指标成分，但也未对正气片中所含成分进行定量定性测定。同时，中国专利2022110331062仅对作为正气片中间体的正气片浸膏中4种成分进行定量测定。可见，针对正气片的研究不全面，缺乏对正气片中众多成分进行快速定量定性的测定。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种正气片及其制备工艺与其中多成分定量定性的测定方法，能够提供质量稳定、不合格率低的正气片，并通过可靠的制备方法及正气片中10种成分的定量定性测定，解决现有技术中缺乏通过对正气片中多种成分进行定量定性测定，可以客观、全面、准确的评价正气片的质量，对控制正气片的质量和保证临床疗效具有重要意义。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种正气片，按质量份计，包括如下组分：

3、广藿香油0.5-1.5份；具体如0.5-0.8份，0.8-1.2份，1.2-1.5份；紫苏叶油0.1-1份；具体如0.1-0.4份，0.4-0.8份，0.8-1份；

4、木香150-250份；具体如150-180份，180-220份，220-250份；苍术100-150份；具体如100-130份，130-140份，140-150份；甘草10-100份；具体如10-60份，60-70份，70-100份；

5、茯苓150-250份；具体如150-180份，180-220份，220-250份；陈皮100-150份；具体如100-130份，130-140份，140-150份；制半夏100-150份；具体如100-130份，130-140份，140-150份；姜厚朴100-150份；具体如100-130份，130-140份，140-150份；生姜100-150份；具体如100-130份，130-140份，140-150份。较佳地，所述正气片按质量份计，包括如下组分：

6、广藿香油0.8-1.2份；

7、紫苏叶油0.4-0.8份；

8、木香180-220份；

9、苍术130-140份；

10、甘草60-70份；

11、茯苓180-220份；

12、陈皮130-140份；

13、制半夏130-140份；

14、姜厚朴130-140份；

15、生姜130-140份。

16、优选地，所述正气片按质量份计，包括如下组分：

17、广藿香油1.0份；

18、紫苏叶油0.6份；

19、木香200份；

20、苍术133份；

21、甘草67份；

22、茯苓200份；

23、陈皮133份；

24、制半夏133份；

25、姜厚朴133份；

26、生姜133份。

27、较佳地，所述广藿香油(patchouli oil)、紫苏叶油(perilla oil)应当精密称取。

28、较佳地，所述木香(aucklandiae radix)、苍术(atractylodis rhizoma)、甘草(glycyrrhizae radix et rhizoma)、茯苓(poria)、陈皮(citri reticulataepericarpium)、半夏(pinelliae rhizoma)、厚朴(magnoliae officinalis cortex)、生姜(zingiberis rhizoma recens)，应当精密称取后粉碎成粉。所述半夏为制半夏，厚朴为姜厚朴。所述生姜为鲜生姜。

29、所述广藿香油为是唇形科刺蕊草属植物的提取油。所述紫苏叶油为唇形科塔花族双子叶植物纲一年生直立草本的紫苏叶的提取油。所述木香为菊科植物木香的干燥根。苍术为菊科植物茅苍术或北苍术的干燥根茎。甘草为豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根和根茎。茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮。半夏为天南星科植物半夏的干燥块茎。厚朴为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮。生姜是姜科多年生草本植物姜的新鲜根茎。

30、本发明第二方面提供一种正气片的制备工艺，包括如下步骤：

31、1)按配比将木香、苍术、甘草的第一部分混合后粉碎成粉末，过筛，获得料粉；

32、2)按配比将茯苓、陈皮、制半夏、姜厚朴、生姜、甘草的第二部分加水煎煮，取煎液滤过后浓缩，获得料膏；

33、3)将料膏与料粉混合后制粒，再按配比加入广藿香油、紫苏叶油，压制成片。

34、较佳地，步骤1)或2)中，所述甘草的第一部分与甘草的第二部分的质量之比为55-65:35-45，具体如55-60:40-45、60-65:35-40，优选为60:40。

35、较佳地，步骤1)中，所述混合时还加入庶糖。

36、优选地，所述庶糖与木香加入的质量之比为25-30:150-250，具体如25-30:150-180、25-30:180-220、25-30:220-250，优选为27:180-220，更优选为27:200。

37、较佳地，步骤1)中，所述过筛的筛网网孔目数为80-120目，优选为100目。

38、较佳地，步骤2)中，所述煎煮至沸。

39、较佳地，步骤2)中，所述煎煮的次数为至少2次，优选为2次。

40、优选地，当所述煎煮的次数为2次时，所述煎煮的第1次煎煮时间为2-4小时，优选为3小时；所述煎煮的第2次煎煮时间为1-3小时，优选为2小时。

41、优选地，当所述煎煮的次数为2次时，所述煎煮的第1次煎煮的加水量为7.5-8.5倍量，优选为8倍量；所述煎煮的第2次煎煮的加水量为5.5-6.5倍量，优选为6倍量。

42、上述煎液为至少2次煎煮后合并获得。

43、较佳地，步骤2)中，所述滤过采用蓝式过滤器进行。所述蓝式过滤器为常规使用的蓝式过滤器。

44、较佳地，步骤2)中，所述浓缩的温度为50-70℃。

45、较佳地，步骤2)中，所述浓缩至相对密度在1.03-1.05。从而获得稠密的料膏。

46、较佳地，步骤3)中，所述料膏与料粉混合时，所述料膏中适量加水。所述加水的适量是指加水至料膏可流动即可。

47、较佳地，步骤3)中，所述制粒为常规使用的制粒工序。具体来说，所述制粒按制粒配料的分割锅次，将料粉作为底料放入流动床制粒机内，喷入料膏进行制粒而成。

48、较佳地，步骤3)中，所述广藿香油、紫苏叶油加入时，还加入润滑剂。

49、优选地，所述润滑剂为滑石粉。

50、优选地，所述润滑剂加入量为颗粒重量的1.5-2.5％，优选为2％。

51、较佳地，步骤3)中，所述压制成片为常规使用的中药片剂的压片工艺。

52、本发明第三方面提供一种正气片，由上述工艺制备获得。

53、本发明第四方面提供一种正气片中多成分定量定性的测定方法，包括：将正气片加入甲醇溶解后超声提取、放冷，取上清液过滤，获得的供试品溶液采用超高效液相色谱法(uplc)进行检测，定性确定供试品溶液中10种成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素、紫苏酮、川陈皮素和橘皮素，定量确定供试品溶液中7种成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的含量。

54、较佳地，所述甘草苷的cas号为551-15-5，橙皮苷的cas号为520-26-3，和厚朴酚的cas号为35354-74-6，木香烃内酯的cas号为553-21-9，去氢木香内酯的cas号为74299-48-2，厚朴酚的cas号为528-43-8，苍术素的cas号为55290-63-6，紫苏酮的cas号为142546-15-4，川陈皮素的cas号为478-01-3，橘皮素的cas号为481-53-8。

55、较佳地，所述正气片加入的质量g与甲醇加入的体积ml之比为0.3:15-25，优选为0.3:20。

56、较佳地，所述超声提取的时间为30-60分钟，优选为40-50分钟，更优选为45分钟。

57、较佳地，所述超声提取的功率为200-350w，优选为250w；所述超声提取的频率为40-60khz，优选为40khz。

58、较佳地，所述放冷冷却至室温，所述室温为20-30℃。

59、较佳地，所述过滤为取上清液过滤膜。

60、优选地，所述滤膜为0.22μm滤膜。

61、较佳地，所述采用超高效液相色谱法(uplc)进行检测，包括以下步骤：

62、a1)配制对照品溶液：将甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素、紫苏酮、川陈皮素和橘皮素的对照品，加入甲醇溶解并定容，配成对照品溶液；

63、a2)样品检测：采用超高效液相色谱法(uplc)分别检测供试品溶液和步骤a1)中的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，定性确定供试品溶液中10种成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素、紫苏酮、川陈皮素和橘皮素，定量确定供试品溶液中7种成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的含量。

64、上述超高效液相色谱(ultra performance chromatography，uplc)与传统高效液相色谱(hplc)不同，其涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术、增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。相比hplc方法检测时间过长、色谱峰复杂、影响分离度等问题，uplc的检测速度、灵敏度及分离度是hplc无法比拟的，uplc的速度、灵敏度及分离度分别为hplc的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间、同时减少了溶剂用量、减低了分析成本。

65、优选地，步骤a1)中，所述对照品溶液要摇匀、滤过，取续滤液。

66、优选地，步骤a1)中，所述对照品溶液采用逐级稀释制得。具体来说，是先制备储备液后将储备液用甲醇稀释成对照品溶液。所述储备液置于4℃冰箱避光保存。

67、优选地，步骤a1)中，所述对照品溶液中甘草苷的含量范围为4.52-45.22μg/ml，优选为10μg/ml；橙皮苷的含量范围为9.50-237.61μg/ml，优选为50μg/ml；和厚朴酚的含量范围为1.98-49.50μg/ml，优选为10μg/ml；木香烃内酯的含量范围为10.44-261.14μg/ml，优选为50μg/ml；去氢木香内酯的含量范围为21.49-531.30μg/ml，优选为100μg/ml；厚朴酚的含量范围为1.79-44.86μg/ml，优选为10μg/ml；苍术素的含量范围为1.92-47.96μg/ml，优选为10μg/ml；紫苏酮的含量范围为15-25μg/ml，优选为20μg/ml；川陈皮素的含量范围为40-60μg/ml，优选为50μg/ml；橘皮素的含量范围为15-25μg/ml，优选为20μg/ml。

68、优选地，步骤a2)中，所述超高效液相色谱法(uplc)中，检测器为二极管阵列检测器(dad)。

69、优选地，步骤a2)中，所述超高效液相色谱法中的色谱柱为t3色谱柱。

70、更优选地，所述超高效液相色谱法中的色谱柱为waters acquity uplc hss t3色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.8μm)。

71、优选地，步骤a2)中，所述超高效液相色谱法中的检测波长为224～226nm。更优选地，所述检测波长为225nm。

72、优选地，步骤a2)中，所述超高效液相色谱法中柱温为30～45℃，具体如30～35℃、35～45℃、32～38℃，优选35℃。

73、优选地，步骤a2)中，所述超高效液相色谱法中的流速为0.1～0.3ml/min。更优选地，所述超高效液相色谱法中的流速为0.2ml/min。

74、优选地，步骤a2)中，所述超高效液相色谱法中的进样量为0.5～5μl。更优选地，所述超高效液相色谱法中的进样量为1μl。

75、优选地，步骤a2)中，所述超高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.05～0.15％甲酸水溶液，其中，a相为乙腈，b相为0.05～0.15％甲酸水溶液；分析时间为19min；梯度洗脱。

76、更优选地，所述超高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.10％甲酸水溶液，其中，a相为乙腈，b相为0.10％甲酸水溶液；分析时间为19min；梯度洗脱。

77、上述0.05～0.15％甲酸水溶液为体积百分数为0.05～0.15％的甲酸水溶液。上述0.10％甲酸水溶液为体积百分数为0.10的甲酸水溶液。

78、更优选地，所述梯度洗脱的具体程序见表1，为：

79、0～4min，a相：b相体积比为20：80-35：65；

80、4～5min，a相：b相体积比为35：65-40：60；

81、5～6min，a相：b相体积比为40：60-55：45；

82、6～15min，a相：b相体积比为55：45-60：40；

83、15～16min，a相：b相体积比为60：40-90：10；

84、16～19min，a相：b相体积比为90：10-90：10。

85、本测定方法的分析时间仅为19min，能够在短时间内快速测定正气片中的10种成分，不仅节约了试剂，还可以大大减少了qc日常检测工作。

86、表1

87、

88、优选地，步骤a2)中，所述外标法包括以下步骤：

89、a)按步骤a1)制备一系列不同浓度的对照品溶液，分别进行uplc检测，获得甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的色谱峰面积与对应甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的含量之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的标准工作曲线的回归方程；

90、b)将供试品溶液进行uplc检测，将获得的甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的色谱峰面积，代入步骤a)中相应的甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的含量。

91、更优选地，所述标准工作曲线中，以甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的色谱峰面积为纵坐标(y轴)，其相应甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚、苍术素的含量(即浓度)为横坐标(x轴)。

92、上述紫苏酮、川陈皮素和橘皮素在超高效液相色谱法(uplc)检测中，由于紫苏酮和橘皮素峰面积太小，含量太低，不满足一般含量要求(≥0.02％)不适合作为定量指标，同时根据《中国药典》规定，定量时，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5，紫苏酮、川陈皮素和橘皮素均未满足此要求，故只能定性。

93、如上所述，本发明提供的一种正气片及其制备工艺与其中多成分定量定性的测定方法，确定了正气片的组成成分及其制备，并采用优化条件的前处理和uplc仪器检测方法，可以在极短的时间内如19min，就能够快速定性了正气片中10个成分，并对其中7种成分(甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯和苍术素)进行了快速定量。此方法操作简单，重复性强，便于控制；此方法前处理简单，改进了以往橙皮苷前处理繁杂，平行性欠佳等问题；此方法可同时检测多种成分，另外还大大缩短了检测时间；此方法有利于前端药材控制，甘草苷为甘草的主要成分、橙皮苷为陈皮的主要成分，和厚朴酚及厚朴酚为姜厚朴的主要成分、木香烃内酯和去氢木香内酯为木香的主要成分、苍术素为苍术的主要成分，因此控制复方质量的同时可对5味药材进行控制，包括甘草、陈皮、姜厚朴、木香和苍术，保证生产稳定和临床疗效。该种方法所测定的7种成分的标准曲线在各自范围内线性关系良好，重复性良好、精密度良好、准确度高、稳定性好，可用于多批次样品数据积累，制定合理的含量限度，保证生产稳定和临床疗效。

94、本发明与现有技术相比，具有明显的检测优势。例如，且中国专利2018109246518仅仅提供了分析时间为115min的梯度洗脱程序所获得的正气片hplc指纹图谱，并未对正气片中的任何成分进行定量定性分析。再例如，中国专利2020113871985仅仅提供了通过升温程序所获得的正气片gc指纹图谱，并未对正气片中的任何成分进行定量定性分析。更例如，中国专利2022110331062虽然进行了成分的定量定性分析，但其分析对象为正气片浸膏，并仅通过了分析时间为34min的梯度洗脱程序所获得的正气片浸膏中4种成分的定量定性分析。

95、与中国专利2018109246518相比，本发明采用的检测仪器uplc优于其采用的检测仪器hplc；与中国专利2020113871985相比，本发明采用的检测仪器uplc完全不同于其采用的检测仪器gc；与中国专利2022110331062相比，本发明的分析对象为正气片。与其作为正气片中间体的正气片浸膏不同。特别需要指出的是，本发明仅提供分析时间为19min的梯度洗脱程序，其检测时间远远小于上述现有技术，就能够同时对10个成分进行定性，并同时对7个成分进行定量，大幅度节省了溶剂量，缩减了成本。