金属-多酚复合物颗粒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种金属-多酚复合物颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、核酸药物是指通过结合、裂解、敲除、插入等方式特异性地对致病基因或蛋白进行编辑的功能性dna或rna。这类核酸的发现不仅冲破了核酸只携带遗传信息的传统思想，更为生物医学和生物传感提供了强有力的分子工具。

2、核酸药物存在易被体内的核酸酶快速降解、跨膜能力弱、血液循环中半衰期短等缺点，严重限制了它的临床应用。所以，安全、有效的核酸药物递送系统是核酸药物开发的热点之一。目前，能递送核酸药物的载体主要可以分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体(包括腺病毒、逆转录病毒和慢病毒载体)进入人体后会引起免疫反应，现使用较少；非病毒载体中较为常用的主要是纳米颗粒和小分子缀合物，与直接与核酸药物缀合的小分子缀合物相比，纳米颗粒能更有效地将核酸药物包裹起来，防止其在体内被核酸酶快速降解，从而延长其体内循环时间。纳米颗粒包裹核酸的机制是靠带有正电荷的阳离子脂质吸附带负电荷的核酸。

3、阳离子脂质体通常是阳离子类脂与助类脂如二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、胆固醇等按照一定的比例混合而成。阳离子脂质体可用来运输基因或药物分子进入靶细胞，然而在其转染等过程中阳离子脂质体仍然含有一定的细胞毒性，其在运载药物治疗癌细胞的同时对正常细胞会产生一定的毒性作用，因而对其临床应用研究有一定的限制。阳离子脂质体引起的级联反应包括活性氧的产生、酶激活反应、线粒体膜电位变化、细胞色素c及半胱天冬酶释放引起的细胞凋亡等。

4、此外，可电离脂质是一种含有带正电荷的可电离胺基团的脂质，其在生理条件下(ph＝7.4)不带电，但在较低ph值时会被质子化而带上正电荷。因此，可电离的脂质可被用来部分或完全替代阳离子脂质作为纳米颗粒的主要成分，负责吸附核酸。当包含可电离脂质的纳米颗粒进入生物细胞溶酶体后，在溶酶体内的低ph值(ph＝4.0-6.5)环境中，可电离的脂质变为带正电的脂质。虽然可电离脂质降低了一些永久带正电荷的阳离子脂质的细胞毒性作用和高致炎症作用，但其细胞毒性及免疫原性依然较高。基于阳离子脂质和/或可电离脂质的脂质纳米粒(lipidnanoparticle,lnp)是目前可用于临床的纳米颗粒核酸药物递送系统，其中，阳离子脂质和/或可电离脂质作为lnp的主要成分，负责吸附核酸，同时阳离子脂质和/或可电离脂质介导的细胞毒性及免疫原性依然是lnp毒性较大的重要原因之一。

5、因此，用递送系统递送带负电荷的药物(例如核酸药物、蛋白药物、多肽药物、小分子药物等)时，依赖阳离子脂质和/或可电离脂质开发的纳米颗粒递送系统均不能从根本上解决纳米颗粒递送系统的毒性问题，急需一种不使用阳离子脂质和/或可电离脂质的、毒性低的脂质体递送系统。

6、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供金属-多酚复合物颗粒及其制备方法，以至少缓解一个现有技术中存在的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供金属-多酚复合物颗粒，其中，该金属-多酚复合物颗粒含有：

4、(i)金属-多酚复合物，其由多酚分子部分和金属离子部分反应组成，该多酚分子部分和该金属离子部分通过配位键连接；

5、(ii)抑制颗粒聚集的缀合的脂质，其中该抑制颗粒聚集的缀合的脂质不是阳离子脂质或可电离脂质；以及

6、(iii)除抑制颗粒聚集的缀合的脂质以外的非阳离子脂质或非可电离脂质。

7、在一些实施方式中，该多酚分子部分选自姜黄素、槲皮素、山奈酚、芸香苷、橙皮素、柚皮素、圣草酚、木犀草素、芹菜素、紫衫叶素、褐藻多酚、聚黄烷醇多酚、儿茶素、鞣花酸、没食子酸、双没食子酸、没食子酸丙酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酰葡萄糖、羟基氢醌、桑色素、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯，及其衍生物中一种或多种的组合。

8、其中，“及其衍生物”中“其”是指“姜黄素、槲皮素、山奈酚、芸香苷、橙皮素、柚皮素、圣草酚、木犀草素、芹菜素、紫衫叶素、褐藻多酚、聚黄烷醇多酚、儿茶素、鞣花酸、没食子酸、双没食子酸、没食子酸丙酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酰葡萄糖、羟基氢醌、桑色素、表儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯或没食子儿茶素没食子酸酯”。该多酚分子部分，例如可以但不限于为姜黄素，姜黄素衍生物，橙皮素，橙皮素衍生物，儿茶素，儿茶素衍生物，姜黄素和儿茶素，儿茶素和儿茶素衍生物，等。本发明中，“及其衍生物”均为类似的含义。

9、进一步地，该多酚分子部分选自姜黄素(式1)、槲皮素(式2)、山奈酚(式3)、芸香苷(式4)、橙皮素(式5)、柚皮素(式6)、圣草酚(式7)、木犀草素(式8)、芹菜素(式9)、紫衫叶素(式10)、褐藻多酚(式11)、聚黄烷醇多酚(式12)、儿茶素(式13)、鞣花酸(式14)、没食子酸(式15)、双没食子酸(式16)、没食子酸丙酯(式17)、表没食子儿茶素没食子酸酯(式18)、没食子酰葡萄糖(式19)、羟基氢醌(式20)、桑色素(式21)、表儿茶素没食子酸酯(式22)、儿茶素没食子酸酯(式23)、没食子儿茶素没食子酸酯(式24)，及其衍生物中一种或多种的组合。

10、

11、

12、

13、

14、进一步地，该多酚分子部分选自姜黄素(式1)、二氢姜黄素(式25)、六氢姜黄素(式26)、硫酸姜黄素(式27)、双去甲氧基姜黄素(式28)中一种或多种的组合。

15、

16、进一步地，该多酚分子部分选自姜黄素(式1)、橙皮素(式5)或儿茶素(式13)，及其衍生物中的一种或多种组合。

17、进一步地，该多酚分子部分选自姜黄素(式1)、橙皮素(式5)或儿茶素(式13)。

18、在一些实施方式中，该金属离子部分选自fe3+、ag+、ba2+、ca2+、cd2+、cu2+、fe2+、mn2+、mg2+、mo2+、zn2+、pt2+、au2+、al3+、ce3+、co3+、cr3+、eu3+、gd3+、ni3+、w3+、v3+、zr3+中一种或多种的组合。

19、进一步地，该金属离子部分选自fe3+、ca2+、al3+中一种或多种的组合。

20、进一步地，该金属离子部分选自fe3+、ca2+或al3+。

21、在一些实施方式中，该金属-多酚复合物颗粒的(ii)中该抑制颗粒聚集的缀合的脂质包括聚乙二醇(peg)-脂质缀合物和/或peg-二烷氧基丙基(daa)。

22、进一步地，该peg-脂质缀合物选自磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(式47)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇700(式48)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000(式49)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(式50)，及其衍生物中一种或多种的组合。其中，r1，r2均独立地为：

23、葵酰基月桂酰基

24、肉豆蔻酰基

25、棕榈酰基

26、硬脂酰基

27、油酰基

28、亚油酰基

29、芥酰基

30、花生酰基或

31、植烷酰基

32、

33、进一步地，该peg-脂质缀合物选自dspe-peg2000、dspe-peg700、dspe-peg1000或dspe-peg5000中一种或多种的组合。

34、进一步地，该peg-脂质缀合物选自dspe-peg2000(式58)、dspe-peg700(式55)、dspe-peg1000(式56)或dspe-peg5000(式57)。

35、

36、

37、在一些实施方式中，该金属-多酚复合物颗粒的(iii)中该非阳离子脂质或非可电离脂质选自卵磷脂(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酸(pa)、磷脂酰甘油(pg)、1-磷酸神经酰胺(sp)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰苏氨酸(pt)、鞘磷脂(sm)、溶血卵磷脂(lpc)、溶血磷酸酰乙醇胺(lpe)、溶血磷脂酰丝氨酸(lps)、溶血磷脂酸(lpa)、溶血磷脂酰甘油(lpg)、溶血磷脂酰肌醇(lpi)、溶血磷脂酰苏氨酸(lpt)、溶血鞘磷脂(lsm)、1-磷酸鞘氨醇(s1p)，及其衍生物中一种或多种的组合。

38、进一步地，(iii)中该非阳离子脂质或非可电离脂质选自卵磷脂(pc)(式29)、磷脂酰乙醇胺(pe)(式30)、磷脂酰丝氨酸(ps)(式31)、磷脂酸(pa)(式32)、磷脂酰甘油(pg)(式33)、1-磷酸神经酰胺(sp)(式34)、磷脂酰肌醇(pi)(式35)、磷脂酰苏氨酸(pt)(式36)、鞘磷脂(sm)(式37)、溶血卵磷脂(lpc)(式38)、溶血磷酸酰乙醇胺(lpe)(式39)、溶血磷脂酰丝氨酸(lps)(式40)、溶血磷脂酸(lpa)(式41)、溶血磷脂酰甘油(lpg)(式42)、溶血磷脂酰肌醇(lpi)(式43)、溶血磷脂酰苏氨酸(lpt)(式44)、溶血鞘磷脂(lsm)(式45)、1-磷酸鞘氨醇(s1p)(式46)，及其衍生物中一种或多种的组合；其中，r1，r2均独立地为葵酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基、亚油酰基、芥酰基、花生酰基或植烷酰基。

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40、

41、

42、需要说明的是，在本发明中，所用组分的顺反异构体均不会对本发明保护内容所要达到的技术效果产生影响。

43、进一步地，(iii)中该非阳离子脂质或非可电离脂质还包括胆固醇及其衍生物中的至少一种。

44、在一些实施方式中，(iii)中该非阳离子脂质或非可电离脂质包括胆固醇，以及选自dspc、dspe、dspa或dspg中一种或多种的组合。

45、优选地，胆固醇结构式为(式59)

46、在一个实施方式中，(iii)中该非阳离子脂质或非可电离脂质包括胆固醇(式59)，以及选自dspc(式51)、dspe(式52)、dspa(式53)或dspg(式54)中一种或多种的组合；

47、

48、在一些实施方式中，(iii)中该非阳离子脂质或非可电离脂质包括胆固醇(式59)和dspc(式51)。

49、在一些实施方式中，本发明的金属-多酚复合物由多酚分子部分和金属离子部分反应组成，该多酚分子部分选自姜黄素、橙皮素或儿茶素，该金属离子部分选自fe3+、ca2+或al3+。

50、进一步地，该金属-多酚复合物由多酚分子部分和金属离子部分反应组成，该多酚分子部分选自姜黄素(式1)、橙皮素(式5)或儿茶素(式13)，该金属离子部分选自fe3+、ca2+或al3+。

51、进一步地，该多酚分子部分和该金属离子部分的摩尔比为1:(0.5～2)。

52、进一步地，该多酚分子部分为姜黄素(式1)，该金属离子部分为fe3+。

53、进一步地，姜黄素(式1)和fe3+的摩尔比为1:1。

54、进一步地，橙皮素(式5)和fe3+的摩尔比为1:1。

55、进一步地，儿茶素(式13)和fe3+的摩尔比为1:2。

56、进一步地，该多酚分子部分为姜黄素(式1)，该金属离子部分为al3+。

57、进一步地，姜黄素(式1)和al3+的摩尔比为1:1。

58、在一些实施方式中，该金属-多酚复合物颗粒由(i)金属-多酚复合物、(ii)抑制颗粒聚集的缀合的脂质和(iii)非阳离子脂质或非可电离脂质制成(包括胆固醇和除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质)，该金属-多酚复合物在原料中摩尔占比为10％～20％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为2％～10％，该胆固醇在原料中摩尔占比为0％～48％，该除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为40％～75％。

59、在一些实施方式中，该金属-多酚复合物颗粒由(i)金属-多酚复合物、(ii)抑制颗粒聚集的缀合的脂质和(iii)非阳离子脂质或非可电离脂质制成，该金属-多酚复合物在原料中摩尔占比为5％～小于10％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为2％～10％，该胆固醇在原料中摩尔占比为0％～48％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为30％～小于40％或40％～75％；或

60、在一些实施方式中，该金属-多酚复合物颗粒由(i)金属-多酚复合物、(ii)抑制颗粒聚集的缀合的脂质和(iii)非阳离子脂质或非可电离脂质制成，该金属-多酚复合物在原料中摩尔占比为10％～20％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为2％～10％，该胆固醇在原料中摩尔占比为0％～48％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为30％～小于40％。

61、进一步地，该金属-多酚复合物在原料中摩尔占比为5％～小于10％、10％～15％或15％～20％，优选为5％、10％或15％。

62、进一步地，抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为3％～5％或5％～10％，优选为3％、5％或10％。

63、进一步地，该胆固醇在原料中的摩尔占比为10％～30％、30％～47％或10％～20％，优选为10％、30％或47％。

64、进一步地，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为45％～55％、60％～65％或50％～65％，优选为45％、55％、60％或65％。

65、在一些实施方式中，该金属-多酚复合物(金属离子部分选自fe3+)在原料中摩尔占比5％～小于10％或10％～15％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为5％～10％，该胆固醇在原料中摩尔占比为10％～30％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为60％～65％。优选地，多酚分子部分选自姜黄素(式1)，抑制颗粒聚集的缀合的脂质为dspe-peg2000，非阳离子脂质或非可电离脂质为胆固醇和dspc。

66、在一个实施方式中，该金属-多酚复合物(金属离子部分选自fe3+)在原料中摩尔占比为15％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为10％，该胆固醇在原料中摩尔占比为10％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质(例如dspc、dspa、dspe或dspg)在原料中摩尔占比为65％。

67、在一个实施方式中，该金属-多酚复合物(金属离子部分选自fe3+)在原料中摩尔占比为5％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为5％，该胆固醇在原料中摩尔占比为30％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为60％。

68、在一些实施方式中，该金属-多酚复合物(金属离子部分选自al3+)在原料中摩尔占比5％～小于10％或10％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为3％～5％，该胆固醇在原料中摩尔占比为30％～47％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为45％～55％。优选地，多酚分子部分选自姜黄素(式1)，抑制颗粒聚集的缀合的脂质为dspe-peg2000，非阳离子脂质或非可电离脂质为胆固醇和dspc。

69、在一个实施方式中，该金属-多酚复合物(金属离子部分选自al3+)在原料中摩尔占比5％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为3％，该胆固醇在原料中摩尔占比为47％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为45％。

70、在一个实施方式中，该金属-多酚复合物(金属离子部分选自al3+)在原料中摩尔占比10％，该抑制颗粒聚集的缀合的脂质在原料中摩尔占比为5％，该胆固醇在原料中摩尔占比为30％，除胆固醇以外的非阳离子脂质或非可电离脂质在原料中摩尔占比为55％。

71、本发明提供一种该金属-多酚复合物颗粒的制备方法，将(i)金属-多酚复合物、(ii)抑制颗粒聚集的缀合的脂质和(iii)非阳离子脂质或非可电离脂质混合，得到该金属-多酚复合物颗粒。

72、在一些实施方式中，该制备方法包括以下步骤：

73、步骤一：将多酚分子部分与金属离子部分通过配位键反应形成金属-多酚复合物；

74、步骤二：将步骤一中制备的金属-多酚复合物、抑制颗粒聚集的缀合的脂质、非阳离子脂质或非可电离脂质混合制备得到该金属-多酚复合物颗粒。

75、进一步地，多酚分子溶于乙醇，再加入金属离子反应；多酚分子与金属离子的摩尔比为1：(1～2)；反应的条件包括60℃反应1小时。

76、本发明提供上述金属-多酚复合物颗粒在药物-脂质颗粒中的应用，所述药物-脂质颗粒由药物和金属-多酚复合物颗粒制成。

77、进一步地，该药物包封在该金属-多酚复合物颗粒中。

78、进一步地，该药物选自核酸、蛋白、多肽、小分子、核酸类似物、蛋白类似物和多肽类似物中一种或多种的组合。

79、在一些实施方式中，该核酸选自mrna、sirna、sgrna、aso、circrna、microrna、dna、ecdna、人工核酸中一种或多种的组合。

80、进一步地，该核酸为seq id no.1所示的编码egfp(增强绿色荧光蛋白，enhancedgreen fluorescent protein)的mrna序列、seq id no.2所示的编码新型冠状病毒s1亚基的受体结合域rbd的mrna序列、seq id no.3所示的编码ny-eso-1(纽约食管鳞状细胞1，newyork esophageal squamous cell carcinoma 1)的mrna序列、反义链为seq id no.4和正义链为seq id no.21所示的bcl-2基因(b细胞淋巴瘤/白血病-2基因，b-cell lymphoma/leukemia-2)的sirna序列、反义链为seq id no.6和正义链为seq id no.23所示的plk1基因(polo样激酶1，polo-like kinase 1)的sirna序列、seq id no.8所示的gal-1基因的sirna序列、seq id no.10所示的stat-3基因的aso序列、seq id no.12所示的α-syn基因(α-突触核蛋白，α-synuclein)的aso序列、seq id no.14所示的bcl-2基因的aso序列、seqid no.16所示的编码野生型新型冠状病毒s蛋白的mrna序列、反义链为seq id no.17和正义链为seq id no.25所示的双链dna序列、seq id no.18所示的单链dna、或正义链为seqid no.19和反义链为seq id no.26所示的b7-h4基因的sirna序列。

81、本发明提供上述药物-脂质颗粒的制备方法，其中，将药物包载于金属-多酚复合物颗粒中，得到该药物-脂质颗粒。

82、在一个实施方式中，将(i)金属-多酚复合物、(ii)抑制颗粒聚集的缀合的脂质和(iii)非阳离子脂质或非可电离脂质混合，得到该金属-多酚复合物颗粒。

83、在一个实施方式中，将(a)药物、(i)金属-多酚复合物、(ii)抑制颗粒聚集的缀合的脂质和(iii)非阳离子脂质或非可电离脂质混合，得到该药物-脂质颗粒。

84、在一个实施方式中，金属-多酚复合物、抑制颗粒聚集的缀合的脂质，以及非阳离子脂质或非可电离脂质溶于有机化合物中形成有机相，药物溶于缓冲液中形成水相，将有机相与水相混匀得到药物-脂质颗粒。优选地，有机化合物为乙醇；缓冲液为无酶tris-hcl缓冲液；有机相与水相的混匀方式包含微流控芯片或超声。

85、本发明提供该金属-多酚复合物颗粒在组合物中的应用，该组合物用于药物的递送。

86、进一步地，组合物用于将药物引入细胞。

87、进一步地，组合物为药剂。

88、进一步地，该药剂用于在哺乳动物受试者中使靶序列的表达沉默。

89、进一步地，该药剂用于在哺乳动物体内传递药物。

90、进一步地，该药剂用于将药物从体内传递到哺乳动物细胞。

91、进一步地，该药剂用于治疗哺乳动物的疾病或病症。

92、进一步地，该哺乳动物为人。

93、进一步地，该疾病或病症与基因的表达相关，该基因包含药物的靶序列。

94、进一步地，该疾病或病症包括癌症、病毒感染、自身免疫性疾病、糖尿病或阿尔兹海默症。

95、进一步地，该病毒感染包括甲肝、乙肝、丙肝、sars-cov-2(2019新型冠状病毒)、hiv(艾滋病病毒)、hpv(人乳头瘤病毒)、流感、天花或梅毒。

96、进一步地，该癌症包括肝癌、胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌或乳腺癌。

97、进一步地，该药剂为疫苗。

98、进一步地，该药剂的给药途径包括鞘内注射、肌肉给药、颅内注射、静脉注射或瘤内注射。

99、本发明提供一种含有该金属-多酚复合物颗粒的药剂。

100、进一步地，该药剂为疫苗。

101、进一步地，该疫苗为新型冠状病毒疫苗。

102、与现有技术相比，本发明的技术效果为：

103、现有技术中，金属离子与多酚分子(例如姜黄素等)的复合物多作为有效成分用于抗氧化、抗炎症、抗病毒等领域，然而，公开人经实验研究发现，本发明提供的金属-多酚复合物可用于组合物或药剂，其主要作为药物的载体用于药物的稳定性、传递运输等，与其他载体共同作用实现带有负电荷的药物的有效施用。

104、本发明提供的金属-多酚复合物颗粒，具有适合于全身传递的小直径，在保证了不低于lnp的有效性情况下，未使用阳离子脂质或可电离脂质，因此药物-脂质颗粒较lnp，毒性大幅度降低，生物安全性显著提升，更利于在生物体内进行负电荷药物的运载。