一种中国地鼠的超数排卵方法

本发明属于实验动物生产领域，涉及一种中国地鼠的超数排卵方法。

背景技术：

1、超数排卵，简称“超排”，是一种应用外源性促性腺激素诱发卵巢多个卵泡发育，获得较多胚胎的技术。“超排”是建立转基因动物模型中较为重要的一个环节，增加可获的胚胎数量、提高胚胎发育质量成为了后续研究中的前提条件。超数排卵技术充分挖掘了雌性动物的繁殖潜力，减少了动物使用量，是获得大量整齐、优质的卵子或胚胎的一种有效方法，为胚胎移植、克隆和转基因动物生产等提供了卵子和胚胎来源，为获得大量胚胎来源提供了技术支撑和保证。

2、超数排卵存在的主要问题有供体的选择、超数排卵药物和生产应用方案的研究以及操作水平等几个方面。对于常用啮齿类动物大、小鼠超数排卵一般采用孕马血清促性腺激素(pmsg)配合人绒毛膜促性腺激素(hcg)激素。但是对于激素自身而言，pmsg在动物体内半衰期长，使用后易引发卵巢囊肿，卵巢易出现大量不排卵卵泡，黄体早期退化，胚胎发育不正常，季节性超数排卵变异范围大等异常现象。因此在使用此激素时，用量和注射时机就显得至关重要，这就需要研究人员针对各个鼠种摸索出一套最适方案，最大程度上避免激素对动物自身产生不良副作用。在超数排卵激素处理时，供体的性周期阶段、同期发情的处理方法与时间、供体营养状况、超数排卵季节、环境条件、遗传性状等因素，不但独立影响卵巢对超数排卵的反应，还会协同影响卵巢对超数排卵的反应。因此，在超数排卵方法研究上应综合考虑多因素相互协同作用对超数排卵效果的影响性。

3、中国地鼠作为我国特色的实验动物资源，在生物医学领域中发挥重要作用。中国地鼠于20世纪20年代被引进实验室后，研究人员逐渐认识到其用于实验研究具有多种优势，表现在：独特的颊囊结构，存在多条血管，且极易翻出，黏膜上覆盖一层角化分层鳞状上皮，其组织及周围微环境与人类口腔颊部组织相似，是进行微循环的理想材料，在肿瘤学研究领域具有很高的应用价值；大而下垂的睾丸，容易受多种病原体感染，是接种后研究病原体的极佳器官；染色体较大且数目少，容易识别，特别适合进行遗传研究；中国地鼠卵巢细胞(cho细胞)等组织细胞在体外培养方面应用范围广泛。基于以上优势，中国地鼠因其具有极大科学价值愈发受到医学界重视。海内外学者已成功构建自发性ⅱ型糖尿病、口腔黏膜鳞状细胞癌、脂类代谢、微生物及寄生虫等多种中国地鼠人类疾病动物模型，并广泛应用于临床前研究。在人类疾病模拟性表现上，利用地鼠制备疾病动物模型在部分疾病中优于大、小鼠，可能是由于地鼠在遗传特性方面与人类的相似度更高。尤其利用中国地鼠诱导的口腔黏膜癌模型很大程度上呈现出与人类口腔癌相似的发病历程与病理学特征。随着对病因学的深入研究，研究者发现大多数疾病都与基因密切相关。目前，利用中国地鼠制备人类疾病动物模型涉及的疾病种类众多，但均未深入基因工程层面，基因编辑中国地鼠的研究在国内外仍处于空白状态，这极大地影响了中国地鼠特色实验动物资源开展更深层面的研究以及推广与应用。然而，由于物种差异，中国地鼠与大、小鼠等常见实验动物资源的基因编辑程序相比大相径庭，研究人员需针对中国地鼠独特生理学特性从零摸索出一套适用于中国地鼠的基因编辑方案，实现从基因水平制备中国地鼠人类疾病动物模型，为创制各类疾病基因编辑中国地鼠动物模型奠定基础。综上所述，构建基因编辑中国地鼠平台，制备基因编辑中国地鼠迫在眉睫，构建这一平台的前提是需建立在有成熟且稳定的中国地鼠超数排卵方案基础上，因此，建立高效稳定的中国地鼠超数排卵方案至关重要。

4、常见的大、小鼠超数排卵程序十分成熟，可稳定获得大量的卵细胞来源。在已知的超数排卵程序中，pmsg和hcg这两种超排激素应用范围十分广泛。pmsg同时具有促卵泡生长激素(fsh)和促黄体生成素(lh)的生物学性质，对卵泡的生长发育有显著的促进作用，伴有一定的促排卵、促黄体生成作用。hcg具有类似于lh的生物学性质，促进成熟卵泡排出卵巢。使用超排激素组合pmsg+hcg对小鼠进行超排可稳定获得卵子来源，但有研究发现pmsg+hcg激素组合会降低小鼠超排及妊娠率，并可能影响着床期小鼠卵巢和子宫的基因表达导致妊娠失败。发明人在研究中发现，对于中国地鼠，hcg诱导超数排卵的效果不稳定，且其诱导雌鼠超数排卵后卵巢中含有许多但未破裂的卵泡，这些卵泡中含有大量成熟卵母细胞(mⅱ细胞)，大多数卵子在成熟的早期阶段就被阻滞。排卵失败也有可能是由于hcg水平不足，伴随着内源性lh释放不足从而导致卵泡壁过早黄体化，因此既不允许卵母细胞完全成熟，也不允许卵泡壁破裂。目前中国地鼠还没有成熟统一的超数排卵程序，这严重影响了其胚胎生物学的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种中国地鼠的超数排卵方法。

2、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

3、一种中国地鼠的超数排卵方法，挑选9-14周，体重27-35g且具有4d稳定发情周期成熟雌性中国地鼠，将发情后期视为发情周期第一天，于当天进行超数排卵，程序如下：发情周期第一天下午19:00腹腔注射第一针孕马血清pmsg，剂量为0.3iu/g；间隔60h后腹腔注射第二针孕马血清pmsg，剂量为0.4iu/g；7h后于发情前期腹腔注射第三针促黄体生成激素释放激素lhrh，剂量为0.016μg/g，于当天19:30将已注射促排卵激素且处于发情期的雌性中国地鼠与单笼饲养的雄鼠进行交配。交配结束后通过阴道栓或阴道涂片中的精子来确认交配。

4、其中，所述的发情后期可通过阴道涂片确定，发情后期阴道涂片特征：细胞类型种类增多，出现有核上皮细胞和白细胞，无核角化细胞数量大幅减少，整体着色深，如图2所示。

5、作为本发明的一种优选，第一针孕马血清pmsg，剂量为0.3iu/g。

6、作为本发明的进一步优选，发情周期第一天下午19:00腹腔注射第一针孕马血清pmsg。

7、作为本发明的一种优选，第一针注射pmsg间隔60h后腹腔注射第二针孕马血清pmsg，剂量为0.4iu/g。

8、作为本发明的一种优选，于发情前期腹腔注射第三针促黄体生成激素释放激素lhrh，剂量为0.016μg/g。

9、作为本发明的更进一步优选，所述的中国地鼠的超数排卵方法包括，挑选9-14周，体重27-35g且具有4d稳定发情周期成熟雌性中国地鼠，将发情后期视为发情周期第一天，于当天进行超数排卵，程序如下：发情周期第一天下午19:00腹腔注射第一针孕马血清pmsg，剂量为0.3iu/g；间隔60h后腹腔注射第二针孕马血清pmsg，剂量为0.4iu/g；7h后于发情前期腹腔注射第三针促黄体生成激素释放激素lhrh，剂量为0.016μg/g，于当天19:30将已注射促排卵激素且处于发情期的雌性中国地鼠与单笼饲养的雄鼠进行交配。交配结束后通过阴道栓或阴道涂片中的精子来确认交配。

10、本发明详述

11、中国地鼠在恒定实验室条件下，黄体生成素高峰出现在发情前期14:00-15:00，排卵发生在次日凌晨3:30-4:30。正常交配的雌鼠卵子在排卵后约2-3h开始受精，并在接下来的4-5h内完成。受精卵于第5d子宫着床，相比于小鼠晚一天(小鼠囊胚于e 4.0-e 4.5子宫着床)，其原因可能是中国地鼠输卵管较长，延长了胚胎着床时间。我们在实验过程中发现，中国地鼠超排程序需要配合雌鼠的排卵规律进行。未成熟雌鼠经过超数排卵处理后与正常雄性合笼交配，50h后按程序取卵，我们发现几乎没有卵细胞受精，即处于单细胞期。可能是由于未成熟雌鼠(周龄小于9周)卵巢并未发育完全，排出的卵子有异常，并且体内未见有精子运输和适合受精的环境，为保障后期显微注射成功率，因而选择成熟期雌鼠进行超数排卵。成熟雌鼠(周龄大于9周)的发情周期为4-6d，不同窝雌鼠的发育过程具有不同步性，在超排程序之前应监测每只雌鼠的发情周期，严格挑选具有稳定4d发情周期的雌鼠用于超排处理。

12、pmsg注射时间为注射当日的19:00，这是根据中国地鼠体内激素水平的波动规律选择的，中国地鼠一般从早晨8:00-10:00进行交配活动，处于发情期阶段，此阶段体内激素水平相应升高，因此选择在发情后期19:00注射pmsg。第一针pmsg和lhrh之间间隔时间为67h，lhrh注射时间为发情前期当天14:00，lhrh注射后，20h后从输卵管中取卵。

13、有益效果：

14、本发明通过研究中国地鼠特有的排卵周期，对不同条件下的超排效果和所得到的胚胎状态进行对比，对超排的条件进行优选，从而构建出一套适用于中国地鼠的有效而又稳定的超数排卵方法，每只实验动物都对超排程序有反应，平均排卵数12-15枚，大约为自然排卵的2.7-3.4倍。本发明方法大大提高了中国地鼠超数排卵效率，可稳定获得大量卵子，为获得高品质植入前胚胎以及显微注射和胚胎移植操作提供保障，满足后续进行胚胎工程、基因工程研究的需要，填补了国内中国地鼠引种之后再没有制定超数排卵的空白，为中国地鼠的胚胎生物技术研究奠定基础。