铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统及其在结肠癌治疗中的应用

本发明属于医药，涉及包含蔗糖铁和工程化溶瘤细菌的口服施用组合，具体涉及铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统及其在结肠癌治疗中的应用。

背景技术：

1、结肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁着人类健康。尽管我国在结肠癌治疗领域取得了一定进展，但其死亡率却连年攀升。究其原因，一方面由于结肠癌病灶分布范围广、解剖结构复杂，单纯手术治疗难以实现根治性切除；另一方面实体瘤乏氧、高压、免疫抑制的微环境严重阻碍了化疗在内的多种治疗手段的疗效。此外，结肠癌患者失衡的肠道微生态极易触发肿瘤的复发及转移。因此亟需开发新的治疗方案以提高患者的生活质量、延长生存期。

2、口服细菌介导的溶瘤细菌疗法为结肠癌的治疗提供了独特的解决方案。近年来，基于溶瘤细菌的生物疗法在恶性肿瘤治疗领域获得了广泛关注。兼性或专性厌氧细菌能够突破实体瘤高间质压力、血运不佳的屏障，主动靶向并定植在肿瘤部位，定植在肿瘤组织的细菌能够触发机体的固有免疫和适应性免疫，进而逆转肿瘤免疫抑制微环境。此外，经口服、直肠给药定植在肠道的细菌也可调节肠道微生态系统，促进身体的恢复。粪菌移植疗法在临床治疗中的成功应用证实了细菌介导的生物疗法的有效性，然而尚不明确的细菌组成，潜在的细菌感染的风险，以及结肠给药带来的不适感，限制了该种疗法的应用。因此，构建机制明确、递送方便的细菌递送系统极具应用价值。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明设计并制备了包含工程化大肠杆菌、奥奈达湖希瓦氏菌和蔗糖铁的口服施用组合物，用于结肠癌的治疗。如图1所示，首先，将高表达吡喃糖氧化酶的大肠杆菌(e.coli-p2o)与具有还原性质的奥奈达湖希瓦氏菌(mr-1)表面进行透明质酸修饰以屏蔽胃肠道恶劣环境的影响，利用透明质酸与结肠癌细胞表面过表达的cd44受体高亲和性，口服给药后实现两菌同步靶向定植于结肠癌患处。随后，口服给与蔗糖铁溶液剂(is)，通过级联催化产生高毒性羟基自由基(·oh)，触发原位结肠肿瘤的焦亡。此外，细菌组合物可以作为免疫激活佐剂，能够协同焦亡反应重塑肿瘤部位免疫抑制微环境，达到清除远端肿瘤转移的目的。

2、本发明通过以下技术方案实现上述目的：

3、本发明所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，由一种口服施用组合物构成，具体包含蔗糖铁、铁还原菌和高表达氧化酶的工程化细菌。

4、进一步地，为了保护细菌免受胃肠道恶劣环境的侵害，提高细菌对结肠癌病灶的靶向性。本发明在生物相容条件下，通过酰胺化反应将透明质酸(分子量90k)共价偶联至细菌表面，构建透明质酸包衣的溶瘤细菌，以增强溶瘤细菌对肿瘤的靶向性、维持溶瘤细菌在胃肠道内的存活力。

5、进一步地，所述工程化细菌为e.coli-bl21、e.coli-1917、e.coli-k12、e.coli-mg1655、e.coli-top10中的一种或多种；表达的蛋白为葡萄糖氧化酶或吡喃糖氧化酶中的一种或多种。所述铁还原菌为shewanella oneidensis(奥奈达湖希瓦氏菌)mr-1、shewanella oneidensis mr-4、geobacter sulfurreducens中的一种或多种。

6、本发明所述的透明质酸包衣的溶瘤细菌，包括如下方法制备：

7、(1)工程化大肠杆菌的构建与确证

8、①将编码氧化酶(包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖氧化酶)的质粒导入至大肠杆菌感受态细胞(包括e.coli-bl21、e.coli-1917)中，得到高表达氧化酶的大肠杆菌。将工程化大肠杆菌重悬至细菌冻存液中，-80℃冷冻保存。

9、②挑取大小适中的冻存菌重悬于4ml抗性lb培养基中，37℃过夜培养。次日取1ml菌液重悬于100ml抗性lb培养基中，37℃再次培养3h。向菌液内加入1％体积的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，15℃下低温振摇15h，诱导氧化酶的表达。

10、③取2×108cfu大肠杆菌，3000rpm 4℃条件下低温离心10min，去掉上清。用2ml5％葡萄糖注射液重悬菌体，37℃下振摇孵育1h。向菌液内分别加入100μl 1mg/ml辣根过氧化物酶和100μl 1mg/ml 2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(abts)，充分混匀，室温静置10min。此时溶液由无色转变为蓝色，证明氧化酶的成功表达。

11、(2)透明质酸包衣的溶瘤细菌的构建与确证

12、①取2×109cfu大肠杆菌或mr-1，3000rpm 4℃条件下低温离心10min，去掉上清，用1-2ml 10-50mg/ml透明质酸溶液重悬菌体，向菌液内分别加入500μl 10-30mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和500μl 5-20mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温搅拌4h。利用细菌表面的羧基与透明质酸羟基的聚合作用，将透明质酸包裹在细菌表面。10000～12000rpm 4℃条件下低温离心10～15min，弃掉上清，用1ml pbs重悬菌体，获得透明质酸包衣的溶瘤细菌。

13、②采用动态光散射、透射电镜、接触角测定等方法对透明质酸包衣的溶瘤细菌进行表征。

14、口服工程化溶瘤细菌后，次序给与蔗糖铁溶液剂，蔗糖铁能够与工程化溶瘤细菌发生级联催化反应产生高毒性的羟基自由基，触发原位结肠肿瘤的焦亡。

15、本发明还提供所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用和在结肠癌治疗中的应用。

16、本发明的有益效果：

17、本发明提供的口服施用组合物机制明确，给药方式便捷，具有显著的抗结肠癌协同效应，在原位结肠癌动物模型中表现出良好的治疗效果，抑瘤率达到80％以上。

18、本发明将为浸润型结肠癌的治疗提供重要的理论基础和崭新的解决策略，同时为拓展新型高效低毒细菌递送系统的设计提供科学依据，具有重要研究价值。

技术特征：

1.一种铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，其特征在于，所述系统由口服施用组合物构成，具体包括：蔗糖铁、工程化细菌和铁还原菌；其中，对所述的工程化细菌及铁还原菌进行透明质酸包衣。

2.如权利要求1所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，其特征在于，对所述的工程化细菌及铁还原菌进行透明质酸包衣，包括以下步骤：将工程化细菌或铁还原菌与透明质酸溶液混合得到细菌悬液，向菌液内分别加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌4h，4℃离心，收集沉淀，得到获得透明质酸包衣的溶瘤细菌。

3.如权利要求2所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，其特征在于，所述透明质酸浓度为10-50mg/ml，所述细菌与透明质酸用量比例为2×109cfu：1-2ml。

4.如权利要求2所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，其特征在于，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐浓度为10-30mg/ml，所述n-羟基琥珀酰亚胺浓度为5-20mg/ml。

5.如权利要求2所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，其特征在于，所述离心转速为10000～12000rpm，离心时间为10～15min。

6.如权利要求1所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，其特征在于，所述工程化细菌为e.coli-bl21、e.coli-1917、e.coli-k12、e.coli-mg1655、e.coli-top10中的一种或多种；表达的蛋白为葡萄糖氧化酶或吡喃糖氧化酶中的一种或多种。

7.如权利要求1所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统，其特征在于，所述铁还原菌为shewanella oneidensis mr-1、shewanella oneidensis mr-4、geobactersulfurreducens中的一种或多种。

8.权利要求1～7任何一项所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求1～7任何一项所述的铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统在结肠癌治疗中的应用。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，口服工程化溶瘤细菌后，次序给与蔗糖铁溶液剂，通过级联催化产生高毒性羟基自由基，触发原位结肠肿瘤的焦亡。

技术总结
铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统及其在结肠癌治疗中的应用，属于医药技术领域，具体涉及铁剂级联触发的口服溶瘤细菌递送系统及其在结肠癌治疗中的应用，工程化溶瘤细菌由透明质酸修饰，透明质酸涂层能够保护口服细菌免受胃肠道恶劣环境侵害，提高细菌对结肠肿瘤的靶向性。口服工程化溶瘤细菌后，次序给与蔗糖铁溶液剂，蔗糖铁能够与工程化溶瘤细菌发生级联催化反应产生高毒性的羟基自由基，触发原位结肠肿瘤的焦亡。此外，该细菌组合物也可以作为免疫激活佐剂，能够协同焦亡反应重塑机体免疫抑制微环境，实现清除远端肿瘤转移的目的。本发明将为浸润型结肠癌的治疗提供重要的理论基础和崭新的解决策略，具有重要研究价值。

技术研发人员：孙进,孙孟驰,娄新宇
受保护的技术使用者：沈阳药科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16