一种能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体及其制备方法与流程

本发明涉及纳米材料领域，具体涉及一种能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体及其制备方法。

背景技术：

1、在恶性肿瘤的治疗中，由于肿瘤血管异常及肿瘤内的乏氧状态，导致药物或免疫细胞难以抵达肿瘤局部，从而削弱了放疗、化疗或免疫治疗的疗效。

2、肿瘤相关巨噬细胞是浸润在肿瘤间质的巨噬细胞。恶性黑色素瘤瘤体脉管系统的结构和功能异常会导致高度异质和缺氧的肿瘤微环境，可将tam极化为免疫抑制的m2表型，并阻碍t细胞的肿瘤浸润，从而抑制抗肿瘤免疫反应。因此，促进肿瘤区域血管正常化，将tam诱导为免疫活化的m1表型，有望增强抗黑色素瘤免疫效应。研究表明，no分子可通过调节血管生成并维持血管稳态实现肿瘤血管系统正常化，促进tam由m2型向m1型转化，增强抗肿瘤免疫浸润。因此，结合纳米脂质体的渗透和保留效应，通过纳米脂质体封装no分子供体，实现no分子向黑色素瘤瘤体高效且稳定的靶向递送是一种极具潜力的黑色素瘤治疗策略。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体及其制备方法，能够靶向穿透肿瘤、并在肿瘤局部微环境中释放一氧化氮(no)。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

3、一种能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)制备dspe-peg2000-irgd：

5、按比例分别称取c-irgd、dspe-peg2000-mal，混合，用第一溶剂溶解、搅拌，得到第一混合溶液；其中，c-irgd、dspe-peg2000-mal摩尔比为1:0.9-1.1；

6、将第一混合溶液置于水中进行透析，收集透析袋中液体，冻干，得到dspe-peg2000-irgd；

7、(2)制备irgd-no-np：

8、按比例分别称取dspe-peg2000-irgd、阳离子脂质体dotap和中性脂质体dmpc，混合，用第二溶剂溶解，得到第二混合溶液；其中，dspe-peg2000-irgd、阳离子脂质体dotap和中性脂质体dmpc摩尔比为8：23-24：67-70；

9、将第二混合溶液置于干燥的蒸发烧瓶中，3-5℃旋转蒸干，在蒸发烧瓶壁形成一层均匀的脂质薄膜，加入deta nonoate溶液将脂质薄膜水合，冰浴超声处理；挤出，得到irgd-no-np膜融合纳米脂质体。

10、为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

11、步骤(1)中，第一溶剂为ph＝6.5的hepes溶液，溶解于棕色玻璃瓶中。

12、步骤(1)中，c-irgd、dspe-peg2000-mal的总量与第一溶剂的质量/体积比例为13-16：20g/l。

13、步骤(1)中，所述搅拌为于磁力搅拌器上室温搅拌24h。

14、步骤(1)中，透析采用2000da透析袋，夹紧透析袋的一端加入第一混合溶液后夹紧透析袋另一端，将透析袋置于双蒸水中透析48h；透析过程中更换透析液5-10次。

15、步骤(2)中，第二溶剂为三氯甲烷；dspe-peg2000-irgd、阳离子脂质体dotap和中性脂质体dmpc的总量与第二溶剂的质量/体积比为17-19：3g/l。

16、步骤(2)中，所述脂质薄膜与deta nonoate溶液的质量/体积比为3-4：1g/l。

17、步骤(2)中，所述冰浴超声处理为，4℃，37hz，70％冰浴超声处理40min。

18、步骤(2)中，irgd-no-np膜融合纳米脂质体用脂质体挤出器及玻璃针筒挤出，脂质体挤出器的两个膜载体之间装载0.1μm滤膜，用1ml玻璃针筒推挤。

19、本发明还保护所述方法制备的膜融合纳米脂质体，该膜融合纳米脂质体能够靶向调节肿瘤免疫微环境。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、本发明提供一种能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体及其制备方法，形成一种脂质体递送系统，利用具有良好生物相容性的聚乙二醇-磷脂衍生物dspe-peg2000为载体，通过化学偶联法在其末端修饰肿瘤靶向肽irgd，通过薄膜分散法，将一氧化氮(no)供体包封至的膜融合纳米脂质体，制备膜融合纳米脂质体irgd-no-np。

22、该膜融合纳米脂质体末端修饰了肿瘤靶向肽irgd，可以实现肿瘤靶向性；该膜融合纳米脂质体与细胞膜之间有很强的亲合力，通过与生物膜相融合，释放活性成分进入细胞内；该膜融合纳米脂质体将水溶性成分deta nonoate(no供体)包封至脂质体内腔，可以控制no的定量释放。

23、本发明制备的膜融合纳米脂质体兼具肿瘤靶向性、no的定点靶向传输、no定量可控释放的特点，通过纳米载体运送一定浓度的no至肿瘤微环境中，改善肿瘤微环境局部缺氧及免疫抑制状态，促使肿瘤血管系统正常化，促进肿瘤相关巨噬细胞(tam)由m2型转化为m1型，从而有望用于临床，增进免疫活性细胞的浸润和化疗药物的进入，协同免疫、化疗、放疗等治疗技术用于抗肿瘤治疗。

技术特征：

1.一种能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，第一溶剂为ph＝6.5的hepes溶液，溶解于棕色玻璃瓶中。

3.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，c-irgd、dspe-peg2000-mal的总量与第一溶剂的质量/体积比例为13-16：20g/l。

4.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述搅拌为于磁力搅拌器上室温搅拌24h。

5.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，透析采用2000da透析袋，夹紧透析袋的一端加入第一混合溶液后夹紧透析袋另一端，将透析袋置于双蒸水中透析48h；透析过程中更换透析液5-10次。

6.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，第二溶剂为三氯甲烷；dspe-peg2000-irgd、阳离子脂质体dotap和中性脂质体dmpc的总量与第二溶剂的质量/体积比为17-19：3g/l。

7.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述脂质薄膜与deta nonoate溶液的质量/体积比为3-4：1g/l。

8.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述冰浴超声处理为，4℃，37hz，70％冰浴超声处理40min。

9.根据权利要求1所述的能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，irgd-no-np膜融合纳米脂质体用脂质体挤出器及玻璃针筒挤出，脂质体挤出器的两个膜载体之间装载0.1μm滤膜，用1ml玻璃针筒推挤。

10.权利要求1-9任一项所述方法制备的膜融合纳米脂质体，其特征在于：该膜融合纳米脂质体能够靶向调节肿瘤免疫微环境。

技术总结
本发明涉及一种能够靶向调节肿瘤免疫微环境的膜融合纳米脂质体的制备方法，包括步骤：称取C‑iRGD、DSPE‑PEG<subgt;2000</subgt;‑Mal，混合、溶解、搅拌，然后置于水中进行透析，收集透析袋中液体，冻干，得到DSPE‑PEG<subgt;2000</subgt;‑iRGD；称取DSPE‑PEG<subgt;2000</subgt;‑iRGD、阳离子脂质体DOTAP和中性脂质体DMPC，混合、溶解，旋转蒸干形成脂质薄膜，经水合、冰浴超声处理，挤出，得到膜融合纳米脂质体。该膜融合纳米脂质体通过纳米载体运送NO至肿瘤微环境中，实现NO的定点靶向传输和定量可控释放，改善肿瘤局部缺氧及免疫抑制微环境，促使肿瘤血管系统正常化，促进肿瘤相关巨噬细胞由M2型转化为M1型。

技术研发人员：邹征云,杨曰玲
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16