一种用癌胚抗原刺激胚胎干细胞制备抗结肠癌药物的方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种用癌胚抗原刺激胚胎干细胞制备抗结肠癌药物的方法。

背景技术：

1、长期以来，肿瘤严重地危害着人类的健康，因此肿瘤的治疗一直都是医学研究的热点。结直肠癌(colorectal cancer(crc))是目前发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。在全球范围内，crc是第三大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡地第二大原因。根据全球癌症统计，一年估计有超过8万例新的crc病例和881000例死亡。crc的发病率在富裕的西方国家最高，但随着世界其他地区经济的发展，crc的发病率正在迅速增加。由于人口结构和饮食习惯的改变，crc在我国的发病率也呈逐年上升趋势。其临床表现与疾病的进程及发病的解剖部位有关，在疾病的早期可以无明显症状。随着疾病的进展，一般右侧临床表现为贫血和肿块，左侧是腹痛，大便习惯改变，严重的有肠梗阻的表现。如肿瘤发生转移，可能引起转移器官的功能障碍，如肝功能受损、黄疸、呼吸困难、头晕头痛或骨转移部位的疼痛等。

2、crc是一种病因异质性疾病，已知该癌症有三种主要的致病途径，包括传统胰瘤癌途径、锯齿状瘤变途径和炎症途径。由于其侵袭性和对化疗反应差，crc仍然是一种具有挑战性的治疗疾病。crc传统治疗方法主要包括手术、化疗和靶向治疗。在这些治疗方法中，手术适用于病变且主要应用于早期结肠癌患者，大约20％的结肠癌患者在诊断时已经发生转移所以不适用手术治疗。化疗是转移性结肠癌患者的主要治疗选择，在过去几十年里，研究利用化疗药物、分子靶向治疗和免疫疗法治疗结肠癌颇有成效，例如5-fu、奥沙利铂、贝伐单抗等。但是crc的预后效果较差，发生远端转移的患者近十年生存率不到15％。癌胚抗原是一种单体糖蛋白，属于在胚胎期产生的胎儿癌性抗原组，文献报道癌胚抗原在结肠癌中水平会升高。在结直肠癌中对结肠癌的诊断，病情检测及预后评估等有一定价值。结肠癌患者和结肠良性病变患者血清癌胚抗原水平相比明显升高，凝血/纤溶系统的激活、慢性炎症状态、营养状况对结肠癌的发生都有一定作用。结肠癌肿瘤患者体内普遍存在凝血功能障碍。结肠癌肿瘤细胞自身可分泌促凝因子、组织因子等激活凝血系统。癌胚抗原水平还与tnm分期、淋巴结转移有关，所以癌胚抗原等结肠癌标志物是目前治疗结肠癌的重要靶点。

3、当今全球医疗界还未有一种药物能够单独治愈结肠癌。随着新辅助治疗在结直肠癌中取得巨大成功以及术前治疗对可切除肝转移性结肠癌病人带来好处，术前治疗在局部进展期结肠癌中的应用受到重视。近年来foxtrot和optical等临床实验证明新辅助治疗可以一定程度提高结肠癌存活率。新辅助治疗可缩小病人肿瘤体积，降低术中肿瘤细胞脱落转移风险，进而提高切除率且降低术后风险。但当前关于结肠癌新辅助治疗临床试验较少，主要是因为：1.肿瘤可能对新辅助治疗不敏感，导致肿瘤早期进展，错过最佳手术时间；2.术前影响学对结肠癌进程分期不明确，易引起过度治疗或延误手术时机。如何精确筛选新辅助治疗的最佳患者，需要制定个体化方案，重视免疫组化及基因检测结果，还有待进一步研究。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种用癌胚抗原刺激胚胎干细胞制备抗结肠癌药物的方法。

2、为了解决现有的结肠癌治疗的技术问题，本发明提供一种用癌胚抗原刺激胚胎干细胞制备抗结肠癌药物的方法。发明人发现，将癌胚抗原加入胚胎干细胞培养环境中，人胚胎干细胞会受到癌胚抗原的刺激，向环境中分泌“抗结肠癌分子”，再提取其上清运用到结肠癌的治疗中。本发明在刺激胚胎干细胞过程中会使用专一的干细胞培养基尽可能保持胚胎干细胞处于未分化状态。利用合适的癌胚抗原浓度刺激胚胎干细胞，体系中如果癌胚抗原的浓度不合适，加入时间点不合适，都会使胚胎干细胞不能充分的产生抑癌因子从而达到抗肿瘤特性。

3、除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。

4、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

5、一种用癌胚抗原刺激胚胎干细胞制备抗结肠癌药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6、(1)预包被人多潜能干细胞铺底基质胶，制备人胚胎干细胞专用培养板；

7、(2)人胚胎干细胞进行复苏、传代；

8、(3)接种人胚胎干细胞于步骤(1)预包被的培养板中；

9、(4)当人胚胎干细胞处于对数生长期后，吸弃旧培养基加入dpbs缓冲液清洗细胞两遍，加入含有适宜浓度癌胚抗原的人胚胎干细胞培养基，将细胞放入37℃恒温培养箱中培养；

10、(5)培养24-72h后收取细胞上清液。

11、本发明所述人胚胎干细胞为已建立的干细胞系。

12、在研究过程中，发明人发现，将结肠癌细胞hct116加入到人胚胎干细胞中，虽然会产生一定的抑癌效应，但是细胞间相互作用会导致人胚胎干细胞发生一定程度的分化，进而会导致一定程度上促进癌细胞生长。经过大量实验后，发明人围绕胚胎微环境受到结直肠癌标志物癌胚抗原刺激后产生的“抑癌因子”其抗结肠癌的生物学效应展开研究。提高人胚胎干细胞在抗肿瘤方面的应用率，并提取癌胚抗原刺激后的人胚胎干细胞上清液后发现其抗结肠癌特性。

13、上述培养基包括人多潜能干细胞培养基、mtesrplus培养基、tesrtm-e8tm培养基、xeno-free human pluripotent干细胞培养基的一种或两种。所述人多潜能干细胞铺底基质胶包括人多潜能干细胞铺底基质胶、hesc-qualified matrix(货号：354277)、vitronectin xftm(货号：07180)的一种或两种。

14、所述癌胚抗原刺激后人胚胎干细胞上清液优选适宜浓度刺激后的人胚胎干细胞上清液。

15、所述预包被人多潜能干细胞铺底基质胶制备人胚胎干细胞专用培养板的方法为将人多潜能干细胞铺底工作液稀释后包被培养板，在37℃恒温5％ co2细胞培养箱中放置过夜后，4℃冰箱备用。

16、人多潜能干细胞铺底工作液稀释为人多潜能干细胞铺底基础液稀释，其中工作液：稀释液＝1：5-1：9。

17、人胚胎干细胞复苏传代方法为将预先包被的人胚胎干细胞专用培养板用dpbs缓冲液清洗两遍，每孔加入人胚胎干细胞培养基1ml后，放于37℃恒温培养箱中预热5min。取15ml离心管，预加3ml人胚胎干细胞培养基备用。从液氮罐中取出人胚胎干细胞，37℃水浴融化直至只剩黄豆大小冰晶后，将细胞加入预先准备含人胚胎干细胞培养基的15ml离心管中，1000rpm，5min离心。离心结束后1ml人胚胎干细胞培养基重悬细胞沉淀，均匀接种在人胚胎干细胞专用培养板中，每天换液。

18、人胚胎干细胞进行消化传代的方法为，取步骤(1)的孔板，吸弃工作液，加入dpbs缓冲液清洗制备好的基质胶，选取对数生长期的人胚胎干细胞，吸弃培养基后加入dpbs缓冲液清洗细胞，加入人胚胎干细胞消化液，放入培养箱中孵育8min，镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿底，克隆内部大部分细胞间出现较为明显的间隙，肉眼可观察到细胞集落变得不透明且发白，表达达到消化终点，吸弃消化液，加入适量人胚胎干细胞培养基停止消化，移液器扇形吹打细胞，使大部分细胞脱落，均匀接种在新包被的培养板中。

19、选取传代培养中的人胚胎干细胞，是选取密度为80％-90％、克隆边缘平滑，相对圆形的细胞集落，中心非常密集，且传代在2-15代。

20、癌胚抗原刺激胚胎干细胞的方法为：待人胚胎干细胞集落成熟后，加入dpbs缓冲液清洗细胞一遍，换为含癌胚抗原的干细胞培养基，在37℃，含5％ co2恒温培养箱中培养。

21、人胚胎干细胞集落成熟状态为人胚胎干细胞汇合率达60％-70％，细胞集落边界完整，相对较圆，细胞间隙小，紧密堆积，集落中心非常密集，在相差显微镜下可能表现为中心发亮。

22、收取细胞培养上清液为癌胚抗原刺激胚胎干细胞24-72h后，吸取细胞培养液，3000rpm*10min，再用0.22μm微孔滤膜过滤，收集上清液。

23、有益效果

24、人胚胎干细胞是一种特殊的多能细胞，能够高表达端粒酶活性，具有无限增殖及自我更新的能力。癌胚抗原(cea)是临床广泛应用的消化道肿瘤标志物，在结直肠癌中过表达，临床已经有研究使用基于cea的疫苗来激发对含有cea的肿瘤细胞的免疫反应。发明人意外发现，将外源cea加入到人胚胎干细胞培养中，胚胎干细胞微环境受到cea的刺激，会产生抑癌因子，因此提取其上清液并运用到结肠癌的治疗。

25、本发明的人胚胎干细胞上清液在抑制结肠癌细胞的增殖，促进其凋亡方面表现出显著的治疗效果；具有制备成抗结肠癌药物的潜力。