含核酸类分子的美白祛斑成分组合物及其可溶性微针贴片的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种美白祛斑组合物的成分及其微针贴片。

背景技术：

1、祛除色斑是人类治疗皮肤色素沉着永恒的美好愿景，这需要充分理解色斑生成及降解的全过程，包括1）皮下色素细胞在紫外线等诱导下高水平表达更多的mitf mrna，从而诱导生成更多的络氨酸酶；2）色素细胞中已经存在的高活性络氨酸酶可诱导产生更多的色素；3）皮下色素细胞已经生成的色素必须转运至皮肤表面才产生色斑；4）已经生成的色素斑的降解。

2、在充分理解该过程的基础上，如要快速、彻底及长久地祛除色斑，可在以上生成及降解色斑的四个过程阶段同时予以干扰。

3、1）色斑类型：

4、包括雀斑、黑斑、黄褐斑、日晒斑、辐射斑和老年斑等，是由于皮肤黑色素的增加而形成的一种常见面部呈褐色或黑色素沉着性、损容性的皮肤疾病，多发于面颊和前额部位。

5、晒太阳是造成黑斑形成的头号诱因。组织细胞间的微细循环受淤阻，细胞溶解死亡，黑色素增多形成色斑沉着造成黄褐斑。妊娠色斑其实和妊娠纹出现的原理一样，都是由于孕期的特殊生理状况，怀孕期间荷尔蒙的变化会促使体内黑色素暂时增加。

6、2）色斑生成的过程机制：

7、 黑色素生成是一个多步骤的生理过程，生成一种黑色聚合物类型的 “黑色素”。黑色素是黑色素细胞内、类似溶酶体的亚细胞器-黑色素小体合成，正常生理状态下，帮助保护阳光、有毒药物和化学物质对皮肤的伤害。（lin jy, fisher de. melanocytebiology and skin pigmentation. nature 2007; 445: 843–850.）

8、 研究发现，小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associatedtranscription factor，mitf)参与色素沉着过程，直接作用色素生成相关基因的转录调节。mitf主要在色素细胞中表达，抑制mitf的表达，具有抑制皮肤色素沉着使皮肤增白的功效。（kumari s, tien guan thng s, kumar verma n, gautam hk.melanogenesisinhibitors. acta derm venereol. 2018 nov 5;98(10):924-931.） 。

9、3）核酸抑制色素生成的机制：

10、小核酸通常是由20个-30个以内短链核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）组成，可以通过watson-crick碱基互补配对原理与dna、mrna或者pre-mrna配对而实现非常高的选择性，精准地抑制某些基因，让编码异常的基因保持“沉默”，从而阻止许多“错误”的蛋白质表达。

11、目前在研的寡核苷酸药物种类很多，包括反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，aso）、小干扰核糖核酸（small interfering rna，sirna）、微小核糖核酸（microrna，mirna）、核酸适配体（aptamer）等。其中，小干扰rna（sirna）可特异性沉默靶标mrna表达水平（2006年诺贝尔生理医学奖），具有治疗基因过表达及基因突变引起的疾病的应用前景 （science,2016,352(6292):1417-1420；nat chem biol,2006,2(12):689-700.）。

12、因此，在mrna水平上，采用小核酸调控及沉默黑色素生成信号通路中关键细胞因子（如mitf） mrna的表达，有可能实现彻底、持久地祛除色斑的目的。

13、4）常用色斑治疗方法：

14、使用软化剂，化学换肤剂，激光治疗，冷冻疗法和表面磨皮是目前治疗局部色素减退或皮肤病变的常规方法。同时认为，组合方法是治疗色素沉着障碍的最佳方案。包括常用的三种药物联用，如对苯二酚、维甲酸和氟西诺酮，是治疗黑斑病的金标准。这个三联疗法可以显著降低太阳光引起的黑色素水平和黑斑数量。然而，这些治疗方案并不能完全根除皮肤色素。因此，越来越有必要开发替代的、更具体和更有效的治疗方案。

15、申请号：2018103807504的发明涉及医疗美容领域，且特别涉及一种微针美容贴片以及其制备方法。微针美容贴片包括可穿刺皮肤角质层的微针阵列和阵列基座，微针阵列和阵列基座连接，微针阵列是由微针原料液制成的矩阵，微针原料液包括功效剂和可降解材料液。其可以刺穿皮肤的角质层，使有效成分能避开角质层屏障直达活性表皮，从而发挥功效，能够有效的除去皱纹、除去黑眼圈、消除浮肿和淡化细纹。

16、申请号：2022107925332的发明涉及一种多功能美容微针贴片批量化制备方法，包括如下步骤：将微针针尖溶液灌注在模板上，置于真空条件，刮去多余溶液后干燥；将配对掩模板放置在模板上，将微针上层溶液灌注在模板上，置于真空条件，用刮板刮去多余溶液，干燥后得到微针主体结构；去除掩模板，用粘有粘性抗菌基底的底板取下干燥后的微针贴片。

17、这两专利可以给本发明制作方法的借鉴。

技术实现思路

1、发明目的：

2、提供一种从分子层面、从源头上阻断色素生成，实现持续彻底的美白祛斑效果的含核酸类分子的美白祛斑成分组合物及其可溶性微针贴片。

3、技术方案：

4、本发明首先提供的一种含核酸类分子的美白祛斑成分组合物，具有组份1、或及组份2。

5、组份1为可特异性调控小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associatedtranscription factor，mitf)的表达与功能，特异性沉默人mitf mrna表达的小干扰核糖核酸sirna（small interference rna, sirna)、反义寡核苷酸aso（antisenseoligonucleotide）、或微小核糖核酸（microrna，mirna）中的一种或几种核酸类结构分子。

6、组份2中含有维生素c或其衍生物，另或有熊果苷、果酸、烟酰胺、鞣花酸、谷胱甘肽、大豆异黄酮、氧化白藜芦、白藜芦醇、硫辛酸、肌肽、凝血酸、芦荟苦素、曲酸、壬二酸、肉桂酸中的一种或几种。

7、本发明利用小核酸分子（组份1）沉默mitf mrna表达，从源头上阻断生成新的络氨酸酶，从而避免生成新的色素；利用组份2，抑制已经生成的络氨酸酶的活性、阻断已经生成的色素转运至皮肤表层及加速降解已经生成的色素，从而可实现快速持久甚至彻底地祛斑的目的。

8、组合物中组份1与组份2的质量比优选为1：0～1：1000之间（优选为1：60～1：300）。对所有获得的核酸序列在制备可溶性微针之前，进行结构改造与修饰，以便核酸分子在体内使用保证原有生物学活性的同时，具有稳定性及无免疫原性，具有美白祛斑的功效。

9、本发明提供的组份2，由化合物属性的一类分子组成，具有降低络氨酸酶活性的还原剂性能、抑制色素转运功能、促进微血管循环促进已生成黑色素分解等功能。组份2中的化合物分子常规市售可及，易于获取，且不影响核酸分子的物理化学性质和生物学功能，与核酸分子组合后易于溶解，方便制备成可溶性微针。

10、在本发明中，组份1的核酸分子选自人工合成的核酸，优先选自国家发明专利申请号201910642310.6中公开的，用于抑制小眼畸形转录因子mrna表达的sirna分子序列。所述的核酸类结构分子优选为simitf-m-5，其核苷酸序列如下：

11、正义链：5’-ccuagaaucaaguuauaaudtdt-3’；

12、反义链：5’-auuauaacuugauucuaggdtdt-3’。

13、本发明提供的组合物，包括利用小核酸分子沉默促黑色素生成关键调控因子（如mitf mrna）表达以免产生新的络氨酸酶、最大限度降低已经存在的络氨酸酶的活性、阻断已经生成的黑色素从黑色素细胞迁移至皮肤角质层、加速分解已转运至角质层表面的黑色素、及促进微血管循环加速沉着色素代谢。在充分理解色素生成机制的基础上，该组合物可靶向色素生成全过程中的所有靶点，多靶点、不同环节及不同水平联合治疗，有可能快速、彻底及长久地祛除色斑。

14、所述的核酸类结构分子还可以优选为aso2，其核苷酸序列的正义链如下：

15、正义链：5’-uuauguuaaaucuucuucuucguuc-3’。

16、所述的核酸类结构分子也可以优选为mir-340，其核苷酸序列的正义链如下：

17、正义链：5’-uuauaaagcaaugagacugauu-3’。

18、在本发明还提供了一种可溶性微针贴片的制备方法。

19、所述的可溶性微针贴片由针尖和基底组成；含核酸类分子的美白祛斑组合物为制备可溶性微针针尖部分的主要材料；选用透明质酸钠（ha）或羟丙基纤维素为制备基底的主要成分。

20、在实际使用过程中，由组份1和组份2成分组成的组合物，不能充分透过皮肤角质层屏障，实现祛斑疗效的最大化；如要产生更好的祛斑效果，势必加大给药剂量，增加了成本及不良反应风险。

21、因此在本发明中，将由组份1和组份2成分组成的祛斑组合物，制备成可溶性微针剂型；本发明制备的可溶性微针贴片，用于人体必需首先具有足够的机械硬度穿过角质层，确保针尖材料穿过角质层后遇到细胞间液体后溶解释放，进入附近的色素细胞内，细胞间液迅速溶解微针释放出祛斑组合物，后者进入色素细胞内发挥祛斑功效。可采用更小的剂量，更低的不良反应及更清洁的使用方法，实现祛斑疗效的最大化。

22、上述组合物具有美白祛斑的作用，优选的方法是色斑位置局部给药，避免全身给药造成的浪费和不良反应；然而，色斑位置局部给药最大的障碍为角质层和色素细胞膜，这些祛斑功效组合物成分必须穿过角质层才能达到角质层下的色素细胞层，尤其是组合物中的核酸分子结构，分子量大约5-15kd，无法主动穿过角质层到达色素细胞层。

23、可溶性微针贴片剂型为核酸分子主动穿过角质层到达色素细胞层进入细胞内提供了可能，也为组合物中其它成分更低剂量和高效地发挥祛斑作用提供了载体。微针是指直径小于几十微米、长度为 25 ~ 2 000微米的针状结构；可溶性微针由水溶性材料制备而成，将药物分散于针体中，使用时微针根据“戳和释放”原理进行给药，即给药时微针插入皮肤，针体与皮肤间质液接触后溶解，药物在局部释放。采用常温水溶解各种组份，无有机溶剂，制备得到的微针长度优选300微米以内，避免针尖进入真皮层内血管；视基底面积均匀分布微针针尖密度。

24、有益效果：

25、本发明在了解色斑生成机制基础上，提供的祛斑组合物及其可溶性微针剂型多靶点、不同环节及不同水平联合使用，可快速、彻底及长久地祛除色斑。

26、本发明从微观的分子层面，尤其是细胞内部核酸成分的改变，从源头上阻断生成新的络氨酸酶，从而避免生成新的色素；实现祛斑美容，治疗彻底，不会反复。

27、与其他类型的微针相比，本发明采用常规的微模塑法制备可溶性微针贴片。可溶性微针的制备工艺简单、制备材料丰富、交叉感染风险低、无尖锐废弃物残留，解决了硅、玻璃等微针针头断裂滞留于皮肤内难以处理的问题，且在一定程度上提高了微针的载药量，扩大了微针的应用范围。

28、本发明制备的可溶性微针贴片，机械性能良好，可满足人体使用的要求。本发明祛斑组合物的可溶性微针剂型，使用方便、减少给药剂量和不良反应、祛斑效果彻底。