一种同位素示踪与宏基因组相结合的解析氮限制生态系统的方法

文档序号:36222069发布日期:2023-11-30 11:15阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种同位素示踪与宏基因组相结合的解析氮限制生态系统的方法,具体步骤如下:

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤二中,采用冷冻研磨和十二烷基硫酸钠sds裂解法进行样品dna的初始提取,得到粗dna之后,进一步使用power soil dna纯化试剂盒进行dna的纯化,从而得到更高质量的dna;之后通过nanodrop评估dna的质量,使得260/280和260/230比例分别为1.8-1.9和1.7以上,并使用荧光法测定dna的浓度。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤三中,将1.0g环境样品与6.0ml无菌水混合在一个12.0ml的顶空进样瓶内,然后用99.99%的高纯度氦气通气30分钟,创造一个无氧的环境;并将该体系在没有任何外源底物的情况下摇床预培养72小时,以完全消耗体系中的no3-和no2-,同时为了抑制硝化作用,使用进样针向系统中加入50ul浓度为18.0g/l的烯丙基硫脲;之后,使用进样针向瓶内中添加100ul浓度为10mm的na15no3,将加入完同位素的泥浆混合体系在25℃以及200rpm的摇床速度下孵育,通过在0、6、12和24小时时注入100ul浓度为7mol/l的氯化锌来终止反应;使用gasbench-irms在不同的时间点测量29n2和30n2的产生量,由此得到反硝化和厌氧氨氧化的速率,计算公式如下:

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤三中,测定完反硝化和厌氧氨氧化速率后剩下的泥浆混合液进行重新的30min氦气曝气,然后加入200ul的次溴酸碘溶液使dnra过程产生的15nh4+转化为n2时进行第二次的测定,计算公式如下:

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤四中,将宏基因组测序得到的原始数据使用metawrap流程中read_qc功能进行了原始序列的质量过滤,获得高质量的双端序列;

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤五中,通过对组装得到的contigs的orfs使用diamond与kegg以及ncycdb数据库进行比对,并结合salmon计算得到的结果,获得n转化相关基因的丰度;对于氮转化相关功能基因的物种起源,使用pear工具将原始的序列进行双端的合并,合并后的序列使用diamond与kegg以及ncycdb数据库进行比对,使用seqtk提取与反硝化,dnra和anammox相关的功能基因序列,并通过kraken2对这些基因序列进行分类注释。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述反硝化相关功能基因为nirs,nirk,norb,norc和nosz;所述dnra相关功能基因为nrfa;所述anammox相关功能基因为hzsa。

8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤六中,结合氮转化相关功能基因和mags的丰度,氮转化速率以及一系列物理化学指标进行mantel test以及spearman相关性分析,得到可能影响到氮转化过程的相关因子。

9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤七中,通过步骤六得到的相关因子,寻找相应的数据库进行mags功能代谢的注释,或者是按照kass注释得到结果进行进一步的探究,最后使用diamond makedb功能,在ncbi上下载需要研究的相关功能的蛋白序列集合,构成一个独特的数据库,再进行其功能的比对,得到需要的氮转化相关mags的功能代谢特征,以解释其对氮转化过程的影响。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法在红树林生态系统研究中的应用。


技术总结
本发明公开了一种同位素示踪与宏基因组相结合的解析氮限制生态系统的方法。该方法首先利用同位素示踪技术,通过标记氮同位素探究氮元素在生态系统中潜在的流动和转化过程。然后,通过宏基因组测序与分析的方法,获取大量的微生物基因组信息,包括功能基因、微生物组成以及相关的生长代谢功能。通过对两部分数据的综合分析,可以深入了解氮限制生态系统中不同微生物群落的功能和相互作用。本发明的方法相较于传统单一的研究,具有高通量、高分辨率和全面性的优势,能够为氮限制生态系统的研究提供新的视角和深入理解,进一步推动氮循环的科学认知和可持续生态系统管理的发展。

技术研发人员:王成,范义俊
受保护的技术使用者:中山大学
技术研发日:
技术公布日:2024/1/16
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