一种新型抗菌海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料的制备方法与应用

本发明属于生物医用和功能材料，具体涉及一种新型抗菌海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料制备方法。

背景技术：

1、皮肤作为人体重要的器官，它具有感应外界刺激、调节体温和保护内部器官等作用。但由于皮肤需要与外界环境的频繁接触，它也成为最易受损伤的器官之一。皮肤创伤对人类的生命健康安全造成了严重的威胁，全球每年用于慢性伤口护理费用约为28.1-96.8亿美元。促进伤口愈合成为当今医药界亟待解决的关键科学问题。伤口敷料可以给伤口提供一个临时屏障，避免受到二次损伤和感染，同时也可以实现有效的药物递送。近年来，生物伤口敷料相比于合成的聚合物材料，具有良好的生物相容性、可降解性和抗炎抗菌性能，因而越来越受到人们的关注。

2、透明质酸广泛分布于脊椎动物结缔组织细胞外基质中，具有加速伤口愈合和促进血管新生的作用，同时还有无致免疫性和一定的生物黏附性，是目前发现的天然物质中保湿性最好的生物多糖，广泛用于医疗、制药和化妆品行业。海藻酸钠是一种天然的阴离子聚合物，通常从褐藻中提取获得，价格低廉，毒性低，具有很好的生物相容性，可以对细胞进行包封运载。现有的敷料往往难以满足复杂形状伤口的护理需求例如烧伤，化学交联往往需要交联剂的参与，对于天然大分子形成水凝胶比较常用的交联剂有戊二醛和环氧氯丙烷等小分子，这些小分子虽然能够使体系快速形成致密的交联结构但这些交联剂往往带有一定的生物毒性，这极大地限制了水凝胶在生物医药领域的应用。

3、皮肤受伤后，伤口通常会失去角质层的保护，不可避免地受到细菌感染，细菌可能会在感染部位引起持续的炎症反应，导致伤口延迟愈合，甚至导致一系列的并发症。因为水凝胶自身缺乏抗菌性能，所以在体系中装载抗生素药物。四环素药物因其水溶性低，生物利用度低，因此使用其盐酸盐作为模型药物。四环素对多数革兰氏阳性和阴性菌有抑制作用，主要通过阻止氨酰基与核糖体结合，阻止肽链的增长和蛋白质的合成，抑制细菌生长。目前的水凝胶敷料由于只是单纯的依靠水凝胶孔道实现载药和释放，药物往往难以实现长时间释放，而物理交联的水凝胶由于网孔直径更大，药物突释的现象更加严重。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种简单易行、生物相容性良好、具有注射性能和自愈合性能的海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料的制备方法。

2、本发明的另一个目的是提供一种新型抗菌海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料在皮肤创伤修复、细菌抑制和伤口保护中的应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)氧化海藻酸钠的制备：将海藻酸钠溶于去离子水中，加入高碘酸钠反应，再加入乙二醇终止反应，透析后冷冻干燥，即得到氧化海藻酸钠。

5、(2)乙二胺修饰的透明质酸的制备：将透明质酸溶于去离子水中，加入乙二胺，调节溶液至酸性，加入催化剂反应，所得产物透析后冷冻干燥，即得到乙二胺修饰的透明质酸。

6、(3)负载抗生素的海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料的制备：将氧化海藻酸钠和抗生素溶于磷酸缓冲溶液中，再与乙二胺修饰的透明质酸溶液混合，交联固化后即得到抗菌海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料。

7、进一步地，所述步骤(1)高碘酸钠与海藻酸钠的质量比为0.54-1.08:1，以合成具有低、中、高氧化度的氧化海藻酸钠。

8、进一步地，所述步骤(1)和(2)中所述透析提纯使用截留分子量8～14kda。

9、进一步地，所述步骤(2)中催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺(edc)。

10、进一步地，所述步骤(2)中，乙二胺与透明质酸的质量比为3～5:1。

11、进一步地，所述步骤(2)中透明质酸的分子量为200～400kda。

12、进一步地，所述步骤(3)中，氧化海藻酸钠与乙二胺修饰的透明质酸的质量比为2.5～5.5:1。

13、进一步地于，所述步骤(3)中，抗生素的加入量为0.5％～3％wt％水凝胶(水凝胶质量为氧化海藻酸钠与乙二胺修饰的透明质酸质量之和)。

14、进一步地，所述步骤(3)中抗生素为含有氨基的抗生素。

15、进一步地，所述含有氨基的抗生素为盐酸四环素、阿莫西林和万古霉素任意一种。

16、本发明所述的新型抗菌海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料在伤口愈合、长效抑菌和伤口保护中的应用。

17、其中，本发明制备得到海藻酸钠/透明质酸水凝胶敷料负载含氨类抗生素药物盐酸四环素，用于皮肤损伤伤口的长效抗菌治疗，促进伤口愈合。

18、海藻酸钠/透明质酸水凝胶形成和载药机理：在酸性条件下，edc的碳氮双键打开与透明质酸的羧基发生加成反应将其活化，活化后的羧基与乙二胺的氨基反应生成酰胺键接枝氨基，获得ha-eda。海藻酸钠与高碘酸钠发生氧化反应，高碘酸钠能够将邻二醇氧化成邻二醛。由含醛基的氧化海藻酸钠和氨基修饰的透明质酸可以进行亲核加成反应，带有孤对电子的氨基氮原子会进攻羰基上带有正电荷的碳原子，亲核加成反应完成后会形成中间产物α-羟基胺类化合物，脱去水形成亚胺键，构建出凝胶网络。盐酸四环素本身带有氨基同样可以和氧化海藻酸上的醛基发生反应形成亚胺键。在酸性条件下亚胺键会分解，一方面凝胶网络会瓦解，促进药物向外界渗透释放，另一方面药物也会发生可逆反应从凝胶基体上脱落释放。

19、利用高碘酸钠氧化海藻酸钠中邻二醇，得到带有醛基的氧化海藻酸钠；通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺引发乙二胺与透明质酸主链上的羧基反应，接枝氨基。最后通过氨基和醛基生成亚胺键形成凝胶网络，具有一定的可注射性和自愈合性能，能够实现盐酸四环素的ph响应性释放，对细菌具有长效的抑制作用。

20、本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

21、1、本发明制备方法通过参数优化和控制，极大地提高了海藻酸钠/透明质酸水凝胶的储能模量。储能模量在54000pa左右，高于皮肤的储能模量200pa～2000pa，表明水凝胶拥有着比皮肤更好的耐变形性能，可以起到保护皮肤避免二次伤害的作用。同时，从流变测试可以看出水凝胶可以在882％应变下结构不损坏。

22、2、水凝胶有着更好的压缩性能，海藻酸钠/透明质酸水凝胶可以在90％的压缩形变下不会损坏，同时水凝胶在进行50次60％压缩后压缩曲线基本没有变化，可以维持原本的压缩性能，具有比较好的耐受性。

23、3、通过流变测试结果可以看出水凝胶具有剪切变稀的性质，在注射的高剪切力推动下，水凝胶的黏度会显著降低，大幅增加其流动性，具有一定的可注射性。同时，由于亚胺键是一种动态的共价键，在水凝胶结构被大应变破坏时可以迅速重建结构，具有自愈合性能，可以在注射后维持相似的性能。同时，水凝胶有很好的生物相容性，它也可以吸收自身质量20～30倍的水，对伤口渗出物有很好的吸收效果，保持伤口的湿润状态，给伤口愈合提供良好的环境。

24、4、通过本发明利用含氨基的抗生素和水凝胶之间的形成化学键实现药物装载和长效药物释药。水凝胶装载水溶性的盐酸四环素可以实现长达5天的长效缓释效果，达到长期抑制细菌生长，并且可以实现ph响应，在酸性条件下释放速度加快同时释放出更多药物。对于长期处于碱性环境下的慢性伤口，水凝胶可以有效降低药物的释放速度，实现更长效的抗菌治疗，促进伤口愈合，并且可以在伤口逐渐愈合转变成酸性时水凝胶结构自然瓦解，容易去除，避免对伤口造成二次伤害。