一种灵芝多糖硒纳米颗粒及其制备方法

本发明涉及生物新材料领域，特别涉及一种灵芝多糖硒纳米颗粒及其制备方法。

背景技术：

1、灵芝在中国已有2000多年的药用历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。孢子粉可以迅速提高人体免疫能力、降低血压、降低血糖、降低胆固醇、改善微循环、避免心脑血管病、宁心安神、促进睡眠、健脾开胃、镇咳平喘、养颜美容、延年益寿、消除疲劳以及扶正固本的功效。特别是孢子粉中的三萜类、核苷类化合物可以破坏恶性肿瘤细胞特有的端粒酶，抑制其无限增殖及变异细胞生长，切断肿瘤细胞的dna链，使其失去生长能力，直至凋亡。孢子粉还具有抗放射功能，能减轻或消除放化疗引起的白细胞减少，阻止癌细胞转移，消除癌症特有的剧痛、提高治疗的耐受性，增进食欲、使肿瘤缩小，预防癌症术后复发。

2、多糖是由10多种单糖通过一种或多种糖苷键连接而成的天然聚合物。天然或修饰的多糖含有高含量的官能团，包括羟基、氨基、硫酸盐和羧酸基，有利于沿着聚合物链形成分子间和分子内氢键。将纳米技术应用于食品工业，在防止污染、改善风味和质地、延长食品的保质期和提高食品质量方面显示出巨大的潜力。基于生物相容性和生物可降解性聚合物的聚合物纳米颗粒近年来吸引了人们的兴趣。在这些生物激发的纳米复合材料中，多糖被认为是最有希望的纳米颗粒生产来源，因为它们相对稳定和成本效益高。因此，多糖可以作为利用现代纳米技术合成纳米颗粒的理想模板。

3、硒是人体所必需的微量营养元素之一，合理摄入硒元素对保持健康、预防疾病具有重要作用。研究表明，硒进入人体可以参与体内抗氧化酶体系的合成(例如谷胱甘肽过氧化氢酶的合成)，可迅速清除体内的自由基，从而可有效防御自由基对细胞的损害。缺硒会引发比如癌症、心脏病、克山病、免疫系统功能紊乱等多种病症，而硒元素在癌症药物预防上属于强效药物，补硒可有效降低癌症发病率，有“抗癌之王”之称。目前，硒的补充常以亚硒酸钠、硒酸钠、硒代蛋氨酸的形式添加于许多食品补充剂中。但是大量研究表明，硒的有效剂量和毒性剂量之间范围极窄，这极大的限制了硒在食品补充剂中的应用。纳米硒(senps)具有生物利用度高的特点，且其急性、亚慢性、长期毒性均低于无机硒和有机硒。senps已被证实能够发挥抗癌、抗氧化等功效，但其功效的发挥基于模板的稳定作用，也就是说，未添加模板的senps极易聚集钝化而无法发挥活性，这已成为限制senps应用的瓶颈。而添加具有生物活性的模板既能稳定senps，又可协同增强senps的健康功效。国内外研究发现，多糖可作为模板稳定senps。灵芝多糖作为灵芝主要的活性成分之一，已被证实具有抗癌、抗氧化、保肝护肝、调节免疫等多种生物活性，除了对senps的稳定作用，还具有协同增强senps功能活性的潜力。因此，寻找具有生物活性的模板，开发活性强、毒性低、稳定性好的纳米硒制剂是国内外相关领域的重点研究方向。已有文献报导分子量高的多糖为模板构建纳米颗粒，但以分子量较低的多糖构建的纳米颗粒由于结构相对简单，稳定性较差，生物利用率较低，一直困扰着灵芝多糖的进一步利用。

4、几种制备纳米硒的方法已获国家发明专利(授权公告号cn 101544359 a；cn102228469 b；cn 103420344 a)。研究表明硒的生物利用度、抗肿瘤活性随其纳米尺度的改变而相差很大，通常合成的表面没有功能化的senps极易聚集沉淀，这已成为限制senps应用的瓶颈。因此，制备粒径小、分布窄的senps，并利用多糖对其表面进行功能化修饰，以期获得稳定性好的硒纳米粒子，成为当下研究的热点。

5、因此，本发明设计了一种开发活性强、毒性低、稳定性好的灵芝多糖纳米颗粒及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种灵芝多糖硒纳米颗粒及其制备方法，其目的是为了解决背景技术存在的上述问题。

2、为了达到上述目的，本发明的实施例提供了一种灵芝多糖硒纳米颗粒及其制备方法，该方法为将灵芝孢子粉用95％乙醇脱脂脱色素，挥干；挥干后的灵芝孢子粉按一定料液比加入蒸馏水，进行超声提取，再将提取液在水浴中提取，重复提取后，合并滤液并浓缩，得到浓缩液；再在浓缩液中依次加入脱水吡啶和β-半乳糖苷酶溶液，进行反应，反应完取上清液冻干，得到小分子量灵芝多糖；然后将小分子量灵芝多糖加入氯氧化硒溶液中，低速振荡至产生淡红色；再快速振荡，直至红色消失，形成稳定的灵芝多糖硒纳米颗粒溶液，冻干，得到灵芝多糖硒纳米颗粒。本发明得到的灵芝多糖纳米颗粒具有良好的稳定性，且具有较强的抗氧化能力及对hepg2细胞和a549细胞具有显著的抑制活性。

3、本发明的一方面提供了一种灵芝多糖硒纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

4、s1：灵芝孢子粉预处理:

5、灵芝孢子粉用95％乙醇脱脂脱色素，挥干；挥干后的灵芝孢子粉按一定料液比加入蒸馏水，进行超声提取，再将提取液在水浴中提取，重复提取后，合并滤液并浓缩，得到浓缩液；

6、s2：小分子量灵芝多糖的制备:

7、在所述浓缩液中依次加入脱水吡啶和β-半乳糖苷酶溶液，进行反应，反应完取上清液冻干，得到小分子量灵芝多糖；

8、s3：将所述小分子量灵芝多糖加入氯氧化硒溶液中，低速振荡至产生淡红色；再快速振荡，直至红色消失，形成稳定的灵芝多糖硒纳米颗粒溶液，冻干，得到灵芝多糖硒纳米颗粒。

9、优选地，所述灵芝孢子粉按1:15～25g/ml料液比加入蒸馏水。

10、优选地，步骤s1中设置超声功率为100～200w、温度为45～55℃进行超声提取；水浴温度为75～85℃；滤液浓缩至1:5，浓缩温度为60～65℃，压力为0.08-0.09mpa。

11、优选地，步骤s1中脱脂脱色素温度为70～80℃，时间为3h，重复次数为2次；提取时间均为30min，重复次数为2次。

12、优选地，步骤s2中脱水吡啶与β-半乳糖苷酶溶液比值为1:1～3；所述脱水吡啶和β-半乳糖苷酶溶液的浓度为1～2％。

13、优选地，步骤s2中反应温度为4℃，反应时间为24～30h；所述小分子量灵芝多糖为10～12k dal。

14、优选地，步骤s3中氯氧化硒溶液含量为1l 0.1％。更优选地，灵芝多糖硒纳米颗粒中硒与小分子量灵芝多糖比为1:3。

15、优选地，步骤s3中低速振荡条件为4℃、20～40rpm、3h；快速振荡为25℃、160～200rpm、7h。更优选地，在温度为25℃摇床转速为130rpm时震荡4h可以反应彻底。

16、优选地，步骤s2和s3中以低温摇床代替传统的磁力搅拌振荡。

17、基于一个发明总的构思，本发明还提供了上述的制备方法制得的灵芝多糖硒纳米颗粒，所述灵芝多糖硒纳米颗粒粒径为140～150nm。更优选地，颗粒粒径为146nm。

18、反应机理

19、β-半乳糖苷酶可以定向酶解灵芝多糖的β-糖苷键，减少灵芝多糖的支链，从而定向降低产物分子量，但由于β-半乳糖苷酶的高效性，过快的酶解速度容易破坏灵芝多糖的空间结构，形成直链的结构较多。脱水吡啶能减少反应体系中的有效水分，降低酶解速度，形成慢反应体系，在适当的时候终止反应可以获得较多的小分子量多糖，氯氧化硒加入后可以适时释放出硒颗粒，适时进入灵芝多糖的空间位点，在保护β-糖苷键的同时稳定了小分子量灵芝多糖的空间结构，转化为灵芝多糖纳米硒颗粒。

20、本发明的上述方案有如下的有益效果：

21、(1)相较于传统制备的多糖纳米颗粒，本发明的灵芝多糖硒纳米颗粒具有粒径更小且易吸收的优点，这得益于较高羟基比率的低分子灵芝多糖，使得灵芝多糖硒纳米颗粒粒径较小且更易吸收。

22、(2)本发明的灵芝多糖硒纳米颗粒，促进抗癌活性和抗氧化活性；利用低分子灵芝多糖羟基数量多的优势稳定硒纳米颗粒，促使游羟基与纳米颗粒结合形成氢键，从而使纳米颗粒具有良好的稳定性与分散性，二者之间具有协同作用；且灵芝多糖稳定的纳米颗粒能在4℃稳定存放90d。

23、(3)本发明采用脱水吡啶既保证了小分子量灵芝多糖的得率(通过限制游离态水增加了酶与糖苷键的接触)，又促进了灵芝多糖和纳米颗粒的结合(通过活化硒颗粒)。

24、(4)本发明通过低温摇床的制备方法，具有反应条件温和可控，可以实现大规模生产。