基于金属-多酚网络与光点击硫醇-烯明胶层层自组装的益生菌单细胞包被方法

本发明属于食品、日化、医药生物，具体涉及一种基于金属-多酚网络与光点击硫醇-烯明胶层层自组装的益生菌单细胞包被方法。

背景技术：

1、随着生物治疗技术的发展，益生菌应用于肠道疾病治疗有着极大的发展前景。然而，益生菌经口服后会面临强酸性胃液、胆盐、降解酶等一系列挑战，由此显著降低益生菌的活性及生物利用度。近年来的研究发现，益生菌单细胞包封技术由于其生物利用度高、包封材料需求量少、显著提高益生菌的肠道定植等优势，相较于传统的微胶囊、水凝胶及脂质体等多细胞包封技术更加简单、高效、快速、安全。

2、其中，层层自组装是一种最常见的益生菌单细胞包封技术，它通常基于静电吸附而将益生菌交替暴露于带负电和带正电的涂层材料中。尽管相关分子材料例如壳聚糖、海藻酸盐、羧甲基纤维素、植酸钠等已在层层自组装包封技术中得到广泛应用，然而仍需要采用至少4层的多层包封来提供良好的益生菌保护效果，由此产生繁琐的操作过程及涂层材料的浪费。另外，过厚的涂层也会抑制益生菌在肠道中的生长繁殖能力。因此，有必要寻找能简化涂层数量并同时提供优越保护效果的涂层材料来提高层层自组装包封技术的应用潜力。

3、金属-多酚网络是金属离子和天然多酚的非共价配位配合物，能在各种界面形成稳定的自组装涂层，因此在益生菌包封方面具有潜在的应用价值。然而金属-多酚网络在酸性环境下易降解，对于口服益生菌的保护作用有限，导致益生菌的生物利用度仍然不高。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于金属-多酚网络与光点击硫醇-烯明胶层层自组装的益生菌单细胞包被方法，该方法简单，制备得到的包被益生菌增强了益生菌在胃肠液中的生存能力，提高了对益生菌的保护效果。

2、烯丙基官能化的改性明胶可基于硫醇-烯光点击反应在较短的时间内交联生成致密的三维聚合物网络，并且明胶基材料具有良好的生物相容性和低免疫原性。基于此，本发明利用金属-多酚网络对蛋白质(明胶)的氢键的吸附作用，将烯丙基官能化的改性明胶导向至益生菌细胞表面，利用硫醇-烯光点击反应在金属-多酚网络外部形成致密的保护涂层，实现简化且高效的益生菌层层自组装包被涂层。

3、一种基于金属-多酚网络与光点击硫醇-烯明胶层层自组装的益生菌单细胞包被方法，包括以下步骤：

4、(1)将多酚溶液滴加至益生菌菌液中混匀，向其中添加金属离子溶液，搅拌反应，得到金属-多酚网络包被的益生菌；

5、(2)向金属-多酚网络包被的益生菌中加入烯基官能化明胶溶液，搅拌反应，得到金属-多酚网络和明胶包被的益生菌；

6、(3)先后向金属-多酚网络和明胶包被的益生菌中加入硫醇溶液和光引发剂，混合均匀后，在光照下进行光点击反应，得到金属-多酚网络和光点击硫醇-烯明胶包被的益生菌。

7、上述包被方法中，步骤(1)和(2)中的反应均在温和搅拌条件下进行；步骤(1)中反应结束后在益生菌细胞的表面形成第一层保护层，即金属-多酚网络层；步骤(2)反应结束后，在金属-多酚网络层外部形成第二保护层，即烯基官能化明胶层；步骤(3)通过向步骤(2)中制得的益生菌中添加硫醇和光引发剂进行光点击反应，使烯基官能化明胶交联形成致密的细胞保护层，最终得到层层自组装包被的益生菌。上述益生菌单细胞包被过程均在0～50℃下进行。

8、作为优选，所述益生菌为大肠杆菌nissle 1917、植物乳杆菌或酿酒酵母。

9、作为优选，益生菌菌液通过将益生菌细胞悬浮于弱碱性缓冲液中制备得到。其中，益生菌细胞(富集细胞)通过将过夜培养至对数期的细胞用无菌管收集得到。

10、作为优选，所述多酚为单宁酸、茶多酚、原花青素中的一种或多种。作为进一步优选方案，所述多酚为单宁酸、茶多酚、原花青素中的一种。

11、作为优选，金属离子溶液为氯化铁溶液或氯化钙溶液。

12、作为优选，多酚与金属离子的质量比为1:20-20:1。进一步优选为(1～10):1。更进一步优选为3:1。

13、作为优选，步骤(1)中，搅拌反应时间为20～50min。进一步优选为30min。

14、作为优选，多酚与烯基官能化明胶的质量比为20:1-1:20。进一步优选为1：(1～10)。更进一步优选为1:(2～5)。

15、作为优选，步骤(2)中，搅拌反应时间为20～50min。进一步优选为30min。

16、作为优选，多酚溶液、金属离子溶液、烯基官能化明胶溶液的溶剂分别选自弱碱性缓冲液。弱碱性缓冲液作为溶剂能够稳定金属-多酚网络，促进络合反应的进行。

17、作为优选，所述硫醇为二硫苏糖醇(dtt)。硫醇用于为光点击反应提供所需巯基。

18、作为优选，硫醇溶液的溶剂为弱碱性缓冲液。

19、作为优选，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lap)。

20、作为优选，所述光引发剂以其弱碱性缓冲溶液的形式进行添加。

21、作为优选，硫醇与烯基官能化明胶的质量比为1:(5～50)。进一步优选为1:(5～10)。更进一步优选为1:8。

22、作为优选，光引发剂与硫醇的质量比为1:(5～100)。进一步优选为1：(40～60)。更进一步优选为1:50。

23、作为优选，步骤(3)中，光照时间为3～8min。进一步优选为5min。

24、作为优选，所述光点击反应所用光源为波长为405nm的可见光。

25、作为优选，本文中所述弱碱性缓冲液可以选用ph值为8.0的tris-hcl溶液。

26、作为具体优选，一种基于金属-多酚网络与硫醇-烯光点击明胶层层自组装的益生菌单细胞包被方法，包括以下步骤：

27、(1)首先将益生菌悬浮于弱碱性缓冲液中，得到益生菌菌液；随即将以弱碱性缓冲液为溶剂配制的多酚溶液滴加入至益生菌菌液中混匀得混合溶液；向上述混合溶液中逐滴加入以弱碱性缓冲液为溶剂配制的金属离子溶液，温和搅拌反应，得含金属-多酚网络包被的益生菌的菌泥；

28、(2)向步骤(1)中得到的菌泥中加入以弱碱性缓冲液为溶剂配制的烯基功能化明胶溶液，温和搅拌反应，得到含金属-多酚网络和明胶包被的益生菌的菌泥；

29、(3)向步骤(2)中得到的菌泥中先后加入二硫苏糖醇溶液(溶剂为弱碱性缓冲液)和lap溶液(溶剂为弱碱性缓冲液)搅拌均匀后，置于405nm波长的光照下照射，即得到金属-多酚网络与硫醇-烯光点击明胶层层自组装包被的益生菌。

30、本发明的益生菌单细胞包被方法，利用多酚的金属螯合能力，将多酚与铁离子或钙离子进行配位自组装在益生菌细胞表面形成金属-多酚网络层，同时借助多酚与蛋白质的相互作用层层自组装上烯基功能化明胶层，最后基于硫醇-烯光点击反应原理形成交联的烯基功能化明胶致密保护层；该致密的保护层可以保护益生菌细胞免受胃肠道逆境环境的损害来维持益生菌的活性，并提高益生菌在肠道的定植。本发明的益生菌单细胞包被材料具有良好的安全性，是一种简单，高效、快速、安全的益生菌封装方法。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

32、(1)本发明的益生菌包被方法为单细胞封装技术，材料制备简单，制备过程污染少；

33、(2)本发明的益生菌包被材料安全性好；

34、(3)本发明的益生菌包被材料可以增强益生菌在胃肠液中的生存能力，提高益生菌在肠道中的生物利用度等，可以作为肠道疾病预防和治疗的增强疗法。

35、本发明的益生菌单细胞包被方法，首先将多酚与金属离子进行配位自组装在益生菌细胞表面形成金属-多酚网络层，然后导向吸附烯基功能化明胶在益生菌细胞表面形成第二层涂层，最后基于硫醇-烯光点击反应原理形成交联的烯基功能化明胶保护涂层。本发明的益生菌包被方法简化了现有层层自组装技术的操作步骤，缩短了包封时间，包封层数量减少却又致密的保护涂层，可以保护细胞免受胃肠道逆境环境的损害来维持益生菌的活性，并提高益生菌在肠道的定植。本发明的包被过程简单，使用可生物降解的多酚和明胶为包被材料，可以增强益生菌在胃肠液中的生存能力，提高益生菌在肠道中的生物利用度，可以作为肠道疾病预防和治疗的一种生物疗法。