治疗癌症及/或癌症转移的方法与流程

本发明为涉及一种癌症疗法。特定来说，本发明提供利用中孔二氧化硅奈米粒子(msn)的癌症疗法。

背景技术：

1、已知癌症为由忽略组织中的必要条件，无限增殖的未分化细胞构成的细胞块，且亦称为肿瘤。具有此无限增殖能力的癌细胞浸润周围组织且在更严重情况下转移至身体的其他器官，从而导致严重疼痛及最终死亡。

2、近来使用几种靶向治疗剂治疗特定癌症，但迄今为止，主要方法为手术、放射疗法及使用抑制细胞增殖的化学治疗剂的化学疗法。然而，因为化学治疗剂并非靶向治疗剂，所以现有化学治疗剂的最大问题为归因于细胞毒性及抗药性的副作用，其为尽管抗癌剂具有初始成功反应，但治疗最终失败的主要因素。因此，为克服此类化学治疗剂的局限性，有必要不断研发具有清楚抗癌作用机制的靶向治疗剂。

技术实现思路

1、因此本发明为涉及一种治疗个体的癌症及/或癌症转移的方法。

2、因此，本发明提供一种治疗个体的癌症及/或治疗具有所述癌症转移或处于所述癌症转移的风险下的个体的方法，其包含向所述个体投与呈结合物形式的装载有伊立替康(iri)的中孔二氧化硅奈米粒子(msn)及视情况选用的医药学上可接受的载剂。

3、在本发明的一些实施例中，癌症为转移性癌症。在一些实施例中，癌症为实体癌症。癌症的实例包括(但不限于)鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃(gastric)或胃(stomach)癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝瘤、乳癌、大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌或其相关转移。

4、在一些实施例中，所述方法用于抑制血管生成。

5、在一些实施例中，所述方法用于抑制管形成。

6、本发明亦提供一种抑制有需要的个体的细胞的点状黏着转换及/或细胞迁移的方法，其包含向个体投与msn或结合物及视情况选用的医药学上可接受的载剂。

7、在一些实施例中，细胞为癌细胞。细胞的实例包括(但不限于)鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃或胃癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝瘤、乳癌、大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌或其相关转移的细胞。

8、在一些实施例中，msn界定至少一个孔且在至少一个孔的侧壁上具有至少一种官能基，其中所述至少一种官能基的pka值小于或等于4.5。

9、在一个实施例中，至少一个孔的侧壁上的至少一种官能基为酸基。在另一实施例中，至少一种官能基包含磺酸盐基(sulfonate)、有机硫酸盐基(organosulfate)、羧酸盐基(carboxylate)、膦酸盐基(phosphonate)、亚膦酸盐基(phosphinate)、有机磷酸盐基(organophosphate)或有机亚磷酸盐基(organophosphite group)。在另一实施例中，至少一种官能基为烷基磺酸盐基(alkylsulfonate group)。

10、在一个实施例中，硅烷的量与具有官能基的硅烷的量的莫耳比在60:1至5:1、50:1至5:1 40:1至5:1、30:1至5:1、20:1至5:1、10:1至5:1、9:1至7:1、50:1至10:1、40:1至20:1、35:1至25:1或30:1至27:1范围内。

11、在一个实施例中，msn进一步包含用有机分子、寡聚物或聚合物及/或带正电荷的分子、寡聚物或聚合物对外表面进行改质。

12、有机分子、寡聚物或聚合物的实例包括(但不限于)聚(乙二醇)(peg)、聚(丙二醇)(ppg)或peg-ppg共聚物或其组合。

13、带正电荷的分子、寡聚物或聚合物的实例包括(但不限于)(氯化n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-n,n,n-三甲铵)、n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺、聚乙烯亚胺(pei)；烷氧基硅烷封端的(聚)伸烷基(聚)胺或具有胺基的有机烷氧基硅烷或其组合。

14、在一些实施例中，通过穿透式电子显微镜(tem)量测，msn的平均粒度小于100nm，而在另一态样中，在pbs介质中通过动态光散射(dls)量测，msn的平均流体动力直径小于100nm。

15、在一些实施例中，msn的ζ电位在-30mv至+30mv范围内。

16、本发明亦提供一种结合物，其包含装载有药剂的中孔二氧化硅奈米粒子，所述中孔二氧化硅奈米粒子界定至少一个孔且在所述至少一个孔的侧壁上具有至少一种官能基，其中所述至少一种官能基的pka值小于或等于4.5。

17、在本发明的一些实施例中，药剂装载于至少一个孔中。

18、在本发明的一些实施例中，药剂的pka值类似于或高于msn的官能基中的任一者的pka，及/或药剂在类似于或高于msn的官能基中的任一者的pka值的ph值下展现性质变化(诸如活性/非活性形式转化、带电荷的状态等)。

19、在本发明的一些实施例中，药剂带正电荷及/或在类似于或高于msn的至少一个孔的侧壁上的官能基中的任一者的pka值的ph值下展现活性形式。药剂的实例包括(但不限于)伊立替康(iri)、金刚胺(amantadine)、阿替洛尔(atenolol)、胺碘酮(amiodarone)、阿西替尼(axitinib)、巴比妥(barbital)、克林达霉素(clindamycin)、氯氮平(clozapine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、喜树碱(camptothecin)、氯奎宁(chloroquine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氯米芬(clomiphene)、西替利嗪(cetirizine)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、苯乙哌啶(diphenoxylate)、表柔比星(epirubicin)、麻黄素(ephedrine)、肾上腺素(epinephrine)、乙硫异烟胺(ethionamide)、依托泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、埃达霉素(idarubicin)、利多卡因(lidocaine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、甲氮芥(mechlorethamine)、罂粟碱(papaverine)、普萘洛尔(propranolol)、普敏太定(promethazine)、奎纳克林(quinacrine)、雷尼替丁(ranitidine)、舍曲林(sertraline)、舒尼替尼(sunitinib)、拓朴替康(topotecan)、曲米帕明(trimipramine)、托瑞米芬(toremifene)、特康唑(terconazole)、曲帕拉醇(triparanol)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)或文拉法辛(venlafaxine)。

20、本发明亦关于一种制备本文所揭示的msn的方法，其包含以下步骤：

21、(a)提供含有浓度足以形成微胞的界面活性剂的碱性溶液；

22、(b)将硅烷源及充当孔侧壁的硅烷源引入所述碱性溶液中；其中充当孔侧壁的硅烷源包含官能基或所述官能基的前驱体基团，且所述官能基的pka值小于或等于4.5；及

23、(c)对步骤(b)中的碱性溶液进行水热处理以获得msn。

24、在一些实施例中，依次或同时引入步骤(b)中的硅烷源及充当孔侧壁的硅烷源。

25、在一些实施例中，所述方法进一步包含将第二硅烷源引入步骤(b)中的碱性溶液中。

26、在一些实施例中，所述方法进一步包含对msn的外表面进行表面改质。在本发明的一些实施例中，在步骤(b)之后或在将第二硅烷源引入步骤(b)中之碱性溶液的步骤之后进行表面改质。

27、在一些实施例中，所述方法进一步包含自步骤(c)中的碱性溶液移除界面活性剂。

28、在一些实施例中，所述方法进一步包含纯化或净化msn。

29、在一个实施例中，官能基为烷基磺酸盐基。

30、在一个实施例中，所述官能基的前驱体基团为烷基硫醇基。

31、在一个实施例中，步骤(b)中硅烷源的使用量与充当孔侧壁的硅烷源的使用量的莫耳比在60:1至5:1、50:1至5:1 40:1至5:1、30:1至5:1、20:1至5:1、10:1至5:1、9:1至7:1、50:1至10:1、40:1至20:1、35:1至25:1或30:1至27:1范围内。

32、本发明提供一种治疗有需要的个体的疾病及/或增加存活时间的方法，其包含向所述个体投与结合物及视情况选用的医药学上可接受的载剂。

33、本发明亦提供一种抑制有需要的个体的血管生成的方法，其包含向个体投与结合物及视情况选用的医药学上可接受的载剂。

34、图式简单说明

35、图1展示30nm(so3-)-msn(ntt2_186k)的tem图。

36、图2展示伊立替康、装载有伊立替康的(so3-)-msn(装载有iri的ntt2_185)及伊立替康与吉西他滨(gemcitabine)共同治疗的抗胰脏癌功效及毒性。

37、图3展示伊立替康及装载有伊立替康的(so3-)-msn(装载有iri的ntt2_186k)的抗大肠直肠癌功效。

38、图4a及4b展示用于评估装载有iri的ntt2_186k在转移性大肠直肠小鼠模型中抑制肿瘤生长及转移的作用的生物发光图的结果(图4a)，及肿瘤中定量生物发光强度及总存活期的结果(图4b)。

39、图5展示用于评估msn抑制管形成的作用的管形成分析的结果。

40、图6展示用于评估msn对血管生成的作用的绒毛尿囊膜(cam)分析的结果。

41、图7展示msn(msn与抗肿瘤药剂共同治疗)的抗转移及总存活期增加。

42、图8a及图8b展示与msn的转移抑制相关的蛋白质表现(图8a)及蛋白质标记物(图8b)。

43、实施方式

44、为了促进对本文中本发明的理解，如本文所用的术语在此定义。

45、术语“视情况存在”或“视情况”意谓随后所描述的事件或情形可能发生或可能不发生，且所述描述包括所述事件或情形发生的情况及所述事件或情形不发生的情况。举例而言，词组“视情况包含药剂”意谓所述药剂可能存在或可能不存在。

46、在本说明书及申请专利范围的上下文中，除非另外特别指示，否则单数形式“一(a/an)”及“所述(the)”包括多数个提及物。除非另外说明，否则本文中所提供的任何及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)仅用于更好地说明本发明，而非限制本发明的范畴。

47、应理解本说明书中所述的任何数值范围意欲包括其中涵盖的所有子范围。举例而言，“50至70℃”的范围包括所陈述最小值50℃与所陈述最大值70℃之间(包括端值)的所有子范围及特定值，例如，58℃至67℃，及53℃至62℃、60℃或68℃。由于所揭示的数值范围为连续性的，因此其含有最小值与最大值之间的各数值。除非另外说明，否则本说明书中指示的多个数值范围为近似值。

48、术语“治疗(treatment,treating,treat)”一般为指获得所需药理学及/或生理学作用。所述作用就完全或部分预防疾病、病症或其症状而言可为预防性的，且就部分或完全治愈疾病、病症及/或归因于其的症状而言可为治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物(优选人类)的疾病的任何治疗，且包括(1)遏制个体的疾病、病症或其症状的发展，或(2)缓解或改善个体的疾病、病症或其症状。

49、在本发明中，如本文所用的术语“治疗剂”或“药剂”为指在生物体中具有治疗作用的物质。治疗成分的实例包括(但不限于)小分子药物、肽、酶、蛋白质药物、抗体、疫苗、抗生素或核苷酸药物。

50、如本文所用，术语“个体”为可受益于如本文所揭示的化合物或组合物的投与的任何动物。在一些实施例中，个体为哺乳动物，例如人类、灵长类动物、犬、猫、马、牛、猪、啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。通常，哺乳动物为人类。

51、如本文所提供的术语活性成分的“有效量”意谓成分的足以提供所需功能的所需调控的量。如下文将指出，视个体的病况、身体状况、年龄、性别、物种及体重、组合物的特定特性及调配等而定，所需精确量将随各个体而变化。可调节给药方案从而诱发最优治疗反应。举例而言，可每天投与若干分次剂量，或可如治疗情况的紧急程度所指示按比例减少剂量。因此，不会一直指定确切“有效量”。然而，一般技术者仅利用常规实验便可确定适当有效量。

52、如本文所用，术语“医药学上可接受”为指在合理医学判断范围内，适合与个体(人类或非人类动物)组织接触使用，无过度毒性、刺激、过敏性反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的化合物、物质、组合物及/或剂型。各载剂、赋形剂等必须在与调配物的其他成分兼容的意义上亦为“可接受”。适合的载剂、赋形剂等可见于标准医药学文本中。

53、在本发明中，除非特定指定，否则如本文所用的前缀“奈米”意谓约300nm或更小的尺寸。除非特定指定，否则如本文所用的前缀“中孔”意谓不超过约50nm的尺寸。在本发明中，如本文所用的术语“硅烷”为指sih4的衍生物。通常情况下，如下所述，四个氢中的至少一者经诸如烷基、烷氧基、胺基等取代基替换。如本文所用的术语“烷氧基硅烷”为指具有至少一个直接键结至硅原子的烷氧基取代基的硅烷。如本文所用的术语“有机烷氧基硅烷”为指具有直接键结至硅原子的至少一个烷氧基取代基及至少一个烃基取代基的硅烷。如本文所用的术语“硅酸盐源”为指可被视为正硅酸的盐形式或酯形式的物质，例如正硅酸钠、偏硅酸钠、正硅酸四乙酯(四乙氧基硅烷，teos)、正硅酸四甲酯、正硅酸四丙酯。视情况，烃基取代基可进一步经杂原子取代或间杂有杂原子。

54、在本发明中，术语“烷基”为指饱和、直链或分支链烷基，其优选包含1-30个碳原子，且更优选1-20个碳原子。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、二级丁基、异丁基、三级丁基、2-乙基丁基、正戊基、异戊基、1-甲基戊基、1,3-二甲基丁基、正己基、1-甲基己基、正庚基、异庚基、1,1,3,3-四甲基丁基、1-甲基庚基、3-甲基庚基、正辛基、2-乙基己基、1,1,3-三甲基己基、1,1,3,3-四甲基戊基、壬基、癸基、十一基、1-甲基十一基、十二基、1,1,3,3,5,5-六甲基己基、十三基、十四基、十五基、十六基、十七基、十八基或其类似物。

55、在本发明中，如本文所用的术语“烷氧基(alkoxyl,alkoxy)”意谓具有式“-o-烷基”的基团，其中所述式中“烷基”的定义具有如上文所陈述的“烷基”的含义。

56、如本文所用，术语“载剂”或“赋形剂”为指本身不是治疗剂的任何物质，其用作载剂及/或稀释剂及/或佐剂或者用于递送治疗剂至个体的媒剂，或添加至调配物中从而改良其操控或储存性质或者允许或有助于组合物的剂量单元形成离散物品，例如液体溶液、悬浮液、乳液、颗粒、安瓿、注射剂、植入物、插入物、输注、套组、软膏、洗剂、搽剂、乳膏、凝胶、喷雾、滴剂、气溶胶或其组合从而进行表面投与。适合载剂或赋形剂为一般熟习制造医药调配物或食品的技术者所熟知的。通过助于说明而非限制，载剂或赋形剂可包括缓冲剂、稀释剂、崩解剂、结合剂、黏着剂、润湿剂、聚合物、润滑剂、滑动剂、为遮蔽或抵消不好味道或气味而添加的物质、调味剂、染料、芳香剂及为改善组合物外观而添加的物质。可接受的载剂或赋形剂包括柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸及硫酸及钠盐及钙盐、碳酸镁、滑石、明胶、阿拉伯树胶、褐藻酸钠、果胶、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明胶、纤维素材料(诸如烷酸的纤维素酯及纤维素烷基酯)、低熔点蜡可可脂、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(edta)、二甲亚砜(dmso)、氯化钠或其它盐、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(诸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)及其他医药学上可接受的材料。载剂不应破坏治疗剂的药理学活性且在足以递送治疗量的治疗剂的剂量投与时应无毒。

57、举例而言，msn及装载的药剂可专门调配成以固体或液体形式投与，包括适于以下的形式：(1)经口投与，例如大剂量药液(水性或非水性溶液或悬浮液)、口含锭、糖衣药丸、胶囊、丸剂、锭剂(例如目标为经颊、舌下及全身性吸收的锭剂)、大丸剂、散剂、颗粒剂、施用于舌头的糊剂；(2)非经肠投与，例如通过例如无菌溶液或悬浮液或持续释放调配物形式皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部施用，例如以乳膏、洗剂、凝胶、软膏或控制释放贴片或喷雾剂形式施用于皮肤；(4)阴道内或直肠内，例如以子宫托、乳膏、栓剂或泡沫形式；(5)舌下；(6)经眼；(7)经皮；(8)经黏膜；或(9)经鼻。

58、用于治疗癌症及/或癌症转移的方法

59、本发明提供一种治疗个体的癌症及/或治疗具有所述癌症转移或处于所述癌症转移的风险下的个体的方法，其包含向所述个体投与呈结合物形式的装载有伊立替康(iri)的中孔二氧化硅奈米粒子(msn)及视情况选用的医药学上可接受的载剂。

60、本发明提供一种治疗有需要的个体的疾病及/或增加存活时间的方法，其包含向所述个体投与结合物及视情况选用的医药学上可接受的载剂。

61、本发明亦提供一种抑制有需要的个体的血管生成的方法，其包含向个体投与结合物及视情况选用的医药学上可接受的载剂。

62、在本发明的一些实施例中，疾病为癌症；特定言之，疾病为转移性癌症。在一些实施例中，疾病为实体癌症。疾病的实例包括(但不限于)鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃或胃癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝瘤、乳癌、大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌或其相关转移。

63、在本发明的一个实施例中，msn及结合物有效治疗大肠直肠癌，尤其转移性大肠直肠癌。大肠直肠癌(crc)为男性中第三最常诊断出的癌症及女性中第二最常见的癌症，且亦为全球癌症死亡的第二大原因。5年存活时间在局部阶段crc(i-iii期)的90％至患有远程转移的患者(iv期)的10％范围内。转移为crc相关死亡率的主要原因。22％crc在初次诊断时为转移性的，且约70％患者将最终出现转移性复发。大肠直肠癌易于转移且扩散至邻近淋巴结、肝脏、肺、骨骼、脑或脊髓。非常需要能够抑制原发性大肠直肠肿瘤生长从而及转移的有效疗法。

64、癌细胞转移至脑中为另一问题，其可能导致高死亡率。一旦肿瘤已转移至脑中，手术及放射疗法对治疗均不会特别有效，则由于bbb，全身性化学疗法具有有限功效。bbb为中枢神经系统中的重要生理学障壁，其调控离子及分子自循环血液至脑中的移动且保护脑免被病原体及毒性剂侵入。然而，bbb亦阻断大部分药物至脑中进行脑部疾病治疗。本发明者发现，孔具有特定内表面改质及粒子具有表面改质的msn展现对治疗剂、尤其伊立替康的极佳装载能力，在缓冲剂或生理条件下的良好分散性，及储存时或生理条件下的良好稳定性，可用于肿瘤靶向、血-脑肿瘤屏障(bbtb)渗透、bbb渗透、脑癌以及脑转移治疗。此外，基于活体外及活体内模型，msn已展现用于预防、抑制或遏制癌症转移的反细胞迁移活性，且其可降低癌症转移的发生率。装载msn的治疗剂提供一种用于治疗具有高转移倾向的癌症的新方法。

65、由于独特的物理/化学特性，诸如大孔隙体积、化学/热稳定性、高装载能力、可调节的表面特性及优良生物兼容性，中孔二氧化硅奈米粒子被认为具有作为药物递送系统巨大的潜力。msn提供二氧化硅与中孔材料两者的组合优势。二氧化硅化学的通用性使得便于与其他材料，包括金属奈米粒子、荧光分子及稀土元素进行整合。中孔材料提供大表面积、高孔隙体积及均匀孔径分布。结合上述散装与奈米材料的优点，提供可在一系列应用中使用的特征。

66、伊立替康已经批准用于大肠直肠癌及胰脏癌(与不同药物组合的一线疗法)。伊立替康为此类癌症的关键化学治疗剂，但骨髓及胃肠道(gi)毒性的发生率高。此外，脂质体伊立替康(onivyde)已经批准用于胰脏癌(与不同药物组合的二线疗法)，而脂质体不具有任何抗转移性作用。更长循环时间(数天)有助于onivyde积聚在肿瘤区域中，但同样可能滞留在体内，其可导致不希望的副作用。onivyde的gi毒性仍为在大肠直肠癌中使用的一个问题。

67、在本发明的一个实施例中，包含装载有伊立替康的msn的结合物显著提高对大肠直肠癌的抗癌功效。此外，基于活体外及活体内模型，已显示msn阻止癌症转移，且可降低大肠直肠癌中的转移发生率，转移为非常常见的。包含装载有伊立替康的msn的结合物提供优于伊立替康及脂质体伊立替康的额外临床益处，尤其对于具有高转移倾向的癌症。

68、在本发明的一个实施例中，包含装载有伊立替康的msn的结合物显著提高对胰脏癌的抗癌功效。装载有伊立替康的ntt_msn的抗癌功效优于单独伊立替康，与公知伊立替康+吉西他滨组合疗法相比，体重减轻较少。

69、在本发明的一个实施例中，包含装载有伊立替康的msn的结合物能够抑制原发性肿瘤生长及转移从而及延长存活时间，而单独伊立替康展现对原发性肿瘤生长及转移的低效肿瘤抑制。

70、在本发明的一些实施例中，单独msn抑制血管的上皮细胞的管形成，从而抑制肿瘤周围的血管生成。

71、本发明亦提供一种抑制有需要的个体的细胞的点状黏着转换及/或细胞迁移的方法，其包含向个体投与msn或结合物及视情况选用的医药学上可接受的载剂。在本发明的一些实施例中，msn抑制内皮细胞的迁移能力且引起血管的不规律生长。在一些实施例中，msn抑制erk、桩蛋白(paxillin，pxn)及fak蛋白的磷酸化，且这些蛋白质的磷酸化已展示与点状黏着转换相关。在一些实施例中，msn不影响肌动蛋白及微管蛋白细胞骨架。

72、在一些实施例中，细胞为癌细胞。细胞的实例包括(但不限于)鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌的胃或胃癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝瘤、乳癌、大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌或其相关转移的细胞。

73、在孔表面上具有官能基的中孔二氧化硅奈米粒子

74、msn可用作递送剂的载剂。通常，二氧化硅奈米粒子的表面可能带有负电荷，因为氢自-sioh基团解离。因此，熟习此项技术者可考虑将具有正电荷的药剂装载至因静电相互作用而可获得的msn。然而，在大多数情况下，msn的表面电荷被认为带轻微负电荷。不受理论束缚，咸信二氧化硅奈米粒子上的硅烷醇基团的pka值可为约4.5至5.5或8.5至9.9，此意谓在中性或弱酸性环境中存在的msn在表面上仅具有极少负电荷。亦即，若待装载至msn的药剂例如展现类似于或低于msn上的硅烷醇基团的pka值，或展现特性变化(诸如活性/非活性形式转化、带电荷的状态等)，则由于低或排斥静电相互作用而难以有效装载所述药剂。因此，可能需要对msn的表面特征进行改质或优化。另外，优选将药剂装载至孔中而非粒子的“外表面”上，此可避免潜在问题，诸如药物更容易自粒子泄漏、粒子聚集或msn行为在活体内的影响。

75、为达到这些目标，将官能基引入msn的表面、特别是孔侧壁)上，其中官能基具有小于或等于4.5的pka值，从而使得msn的(孔)表面在较低ph值(例如低于7、6或5.5)下可带有足够负电荷。此处，本发明提供一种中孔二氧化硅奈米粒子，其界定至少一个孔且在所述至少一个孔的侧壁上具有至少一种官能基，其中所述至少一种官能基的pka值小于或等于4.5。

76、在一个实施例中，官能基可为酸性基团，诸如磺酸盐基、有机硫酸盐基、羧酸盐基、膦酸盐基、亚膦酸盐基、有机磷酸盐基或有机亚磷酸盐基。在一个实施例中，前驱体基团可转化为官能基且可为硫醇、磺内酯、酰基氯化物、腈、酸酐、酰胺及羧酸酯、氧氯化磷、三氯化磷。

77、在一个实施例中，硅烷的量与具有官能基的硅烷的量的莫耳比在60:1至5:1、50:1至5:1 40:1至5:1、30:1至5:1、20:1至5:1、10:1至5:1、9:1至7:1、50:1至10:1、40:1至20:1、35:1至25:1或30:1至27:1范围内。

78、在一个实施例中，msn进一步包含用有机分子、寡聚物或聚合物及/或带正电荷的分子、寡聚物或聚合物对外表面进行改质。

79、有机分子、寡聚物或聚合物的实例包括(但不限于)聚(乙二醇)(peg)、聚(丙二醇)(ppg)或peg-ppg共聚物或其组合。

80、带正电荷的分子、寡聚物或聚合物的实例包括(但不限于)(氯化n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-n,n,n-三甲铵)、n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺、聚乙烯亚胺(pei)；烷氧基硅烷封端的(聚)伸烷基(聚)胺或具有胺基的有机烷氧基硅烷或其组合。

81、msn的特征

82、在本发明中，通过穿透式电子显微镜(tem)量测，msn的平均直径(粒度)优选小于100nm。在一个实施例中，通过tem量测，本发明的中孔二氧化硅奈米粒子的平均粒度为100nm或更小、80nm或更小、65nm或更小、50nm或更小、40nm或更小、30nm或更小、20nm或更小。在一个实施例中，本发明的中孔二氧化硅奈米粒子的孔径为20nm或更小、10nm或更小、5nm或更小、3nm或更小、或2nm或更小。在一个实施例中，通过动态光散射在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中量测，本发明的中孔二氧化硅奈米粒子的平均流体动力直径为100nm或更小、80nm或更小、60nm或更小、50nm或更小、40nm或更小、30nm或更小。

83、在某些实施例中，msn的ζ电位(在ph 7.4条件下)可在-30mv至30mv、-28mv至+25mv、-23mv至+22mv、-20mv至+20mv、-15mv至+15mv、或-10mv至+10mv范围内，或本文提及的端点内的合理数值范围，例如-15mv至+20mv、-10mv至+25mv、-15mv至+10mv等。在一个实施例中，中孔二氧化硅奈米粒子的bet表面积为1000m2/g或更小、750m2/g或更小或500m2/g或更小。

84、制备孔经改质的msn的方法

85、在一个态样中，msn可通过以下步骤制备：(a)提供含有浓度足以形成微胞的界面活性剂的碱性溶液；(b-1)将硅烷源引入碱性溶液中且接连将充当孔侧壁的具有期望官能基或其前驱体基团的硅烷源(下文中称为“充当孔侧壁的硅烷”)引入碱性溶液中，或(b-2)将硅烷源及充当孔侧壁的硅烷引入溶液中；视情况引入第二硅烷源及引入外表面调节剂；及(c)对碱性溶液进行水热处理；视情况收集产物；视情况自产物移除残余界面活性剂；及视情况纯化或净化产物。

86、在一个实施例中，在所需温度(例如45至65℃)下，在密封烧杯中，使0.2至0.5g界面活性剂溶解于100至250ml碱性水溶液(例如氢氧化铵溶液(0.05至1.2m))中。在搅拌10至30分钟之后，添加含200至550μl硅烷源及10至100μl充当内表面的硅烷的300至2500μl溶剂(例如醇，诸如乙醇)且搅拌30至120分钟。此后，再引入含50至200μl硅烷源的0.6至2ml溶剂(例如醇，诸如乙醇)且搅拌1.5至3小时。引入表面改质剂，例如650至1700μl peg-硅烷及视情况选用的30至1000μl具有带正电荷的基团的硅烷的含2至6ml溶剂(例如醇，诸如乙醇)且搅拌0.5至1.5小时。在搅拌或不搅拌下使混合物在所需温度(例如40至80℃)下老化至少15小时。最后，密封溶液且将其置放于60至100℃下的烘箱中，进行12至48小时的水热处理。洗涤合成的产物且通过离心或交叉流收集。最终处理合成的产物，从而移除界面活性剂及纯化，且洗涤且通过离心或交叉流收获。若硅烷源具有所需官能基的前驱体基团，则进行进一步处理，诸如氧化或水解，从而将前驱体基团转化为所需官能基，视情况包括进一步纯化。接着储存最终产物，优选储存于水或85％或更高的乙醇中。

87、适合用于步骤(a)的界面活性剂的实例包括(但不限于)阳离子界面活性剂、阴离子界面活性剂及非离子界面活性剂。基于反应条件选择适当界面活性剂，诸如ph值、离子强度、温度、反应物及产物等。阳离子界面活性剂的实例包括(但不限于)具有长链烃基的ph依赖性一级、二级或三级胺，其中末端胺基在呈现小于特定ph值时带有正电荷，诸如一级及二级胺在ph<10时变成带正电荷，例如奥替尼啶二盐酸盐，及永久带电的四级铵盐，例如溴化十六烷基三甲基铵(ctab)、氯化十六烷基铵(cpc)、氯化苄烷铵(benzalkonium chloride，bac)、氯化苯索宁(benzethonium chloride，bzt)、氯化二甲基二(十八烷基)铵及溴化二(十八烷基)二甲基铵(dodab)。阴离子界面活性剂的实例包括(但不限于)硫酸盐、磺酸盐及磷酸盐或酯，例如月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠(十二烷基硫酸钠、sls或sds)及相关烷基醚硫酸酯、月桂醇醚硫酸钠(月桂基醚硫酸钠或sles)及肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、多库酯(磺琥珀酸钠二辛酯)、全氟辛磺酸酯(pfos)、全氟丁烷磺酸酯、烷基-芳基醚磷酸酯、烷基醚磷酸酯等。非离子界面活性剂的实例包括(但不限于)聚(氧化乙烯)壬基苯基醚、聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯、聚乙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇烷基苯基醚、甘油烷基酯、聚丙二醇烷基醚、嵌段共聚物、泊洛沙姆(poloxamer)、椰油酰胺mea、椰油酰胺dea、月桂基二甲基氧化胺或聚乙氧基化牛脂胺。

88、在一个实施例中，用于步骤(b-1)、(b-2)中的硅烷源包含四乙氧基硅烷(teos)、四甲氧基硅烷(tmos)、硅酸钠或其混合物。

89、在一个实施例中，在步骤(b-1)或(b-2)中可使用充当孔侧壁的硅烷。所述充当孔侧壁的硅烷的实例包括(但不限于)(巯基烷基)三烷氧基硅烷，例如(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷、(11-巯基十一基)三甲氧基硅烷；(三羟基硅基)烷磺酸，例如3-(三羟基硅基)丙烷-1-磺酸(tps)、3-(三羟基硅基)丙基甲基磷酸酯；(3-三乙氧基硅基)丙基丁二酸酐、双(3-三乙氧基硅基丙基)碳酸酯、羧基乙基硅烷三醇、2-(4-氯磺酰基苯基)乙基三甲氧基硅烷、三乙氧基硅基丙基顺丁烯酰胺酸、n-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸酯、二乙基磷酰乙基三乙氧基硅烷。

90、在一个实施例中，表面改质剂可用于调节msn的特性。在一个实施例中，(有机)调节剂包括(但不限于)丙基三乙氧基硅烷、丁基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、二苯基二乙氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷、氯甲基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、乙基三甲氧基苯乙烯硅烷、甲基三乙氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷(pteos)、苯基三甲氧基硅烷(ptmos)、甲基三甲氧基硅烷(mtmos)、乙基三乙酰氧基硅烷(etas)、n-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺四乙酸(edtas)、(3-三羟基烷基)丙基甲基磷酸酯(thpmp)、甲基三乙酰氧基硅烷(mtas)、两性离子硅烷、(氯化n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-n,n,n-三甲铵)、n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺、聚乙烯亚胺(pei)；烷氧基硅烷封端的(聚)伸烷基(聚)胺或具有胺基的有机烷氧基硅烷等。

91、在一个实施例中，硅烷源(总体，亦即步骤(b-1)/(b-2)中所用)与充当孔侧壁的硅烷的莫耳比可在60:1至5:1、50:1至5:1、40:1至5:1、30:1至5:1、20:1至5:1、10:1至5:1、9:1至7:1、50:1至10:1、40:1至20:1、35:1至25:1或30:1至27:1范围内，或在由端点组成的合理数值范围内。

92、含有装载于孔经改质的msn上的药剂的结合物

93、本发明者推断，在进行某些孔侧壁改质下，msn有可能提供药剂所需药理学作用以及优良装载功效或稳定性，所述药剂的pka值类似于或高于msn的官能基中的任一者的pka，及/或药剂在类似于或高于msn的官能基中的任一者的pka值的ph值下展现性质变化(诸如活性/非活性形式转化、带电荷的状态等。此外，药剂在类似于或高于msn的至少一个孔的侧壁上的官能基中的任一者的pka值的ph值下带正电荷及/或展现活性形式。

94、药剂的一个特定实例为伊立替康(iri)。详言之，iri在酸性环境中，特定言之ph<5.5呈内酯形式(其视为具有治疗活性)，且在弱酸性、中性或碱性环境中，特定言之ph>6呈羧酸盐形式(其视为非活性)。因此，iri应以活性形式，亦即在酸性环境下装载，但msn上的硅烷醇基团的解离程度可能无法对iri提供足够的吸引力，此导致iri的装载功效及/或长期稳定性较差。这些药剂的实例包括(但不限于)金刚胺、阿替洛尔、胺碘酮、阿西替尼、巴比妥、克林达霉素、氯氮平、苯丁酸氮芥、喜树碱、氯奎宁、氯丙嗪、氯米芬、西替利嗪、多柔比星、道诺霉素、苯乙哌啶、表柔比星、麻黄素、肾上腺素、乙硫异烟胺、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、埃达霉素、利多卡因、米托蒽醌、甲氮芥、罂粟碱、普萘洛尔、普敏太定、奎纳克林、雷尼替丁、舍曲林、舒尼替尼、拓朴替康、曲米帕明、托瑞米芬、特康唑、曲帕拉醇、长春新碱、长春花碱或文拉法辛。

95、在一个实施例中，将药剂装载至奈米粒子中。药剂封装于msn中不会显著影响在介质(诸如生物学上类似于或等效于磷酸盐缓冲盐水(pbs)的介质)中的分散度及流体动力尺寸。

96、为治疗疾病，可将额外生物活性成分装载至msn上及/或msn中，例如分布于msn中的空间内、msn的表面上等。生物活性成分可基于其尺寸及所关注病症/疾病适当地选择。生物活性成分的实例包括(但不限于)依维莫司(everolimus)、曲贝替定(trabectedin)、阿布拉生(abraxane)、tlk 286、av-299、dn-i0l、帕唑帕尼(pazopanib)、gsk690693、rta 744、on0910.na、azd 6244(arry-142886)、amn-107、tki-258、gsk461364、azd 1152、恩扎妥林(enzastaurin)、凡德他尼(vandetanib)、arq-197、mk-0457、mln8054、pha-739358、r-763、at-9263、flt-3抑制剂、vegfr抑制剂、egfr tk抑制剂、奥洛拉激酶抑制剂(aurora kinaseinhibitor)、pik-1调节剂、bcl-2抑制剂、hdac抑制剂、c-met抑制剂、parp抑制剂、cdk抑制剂、egfr tk抑制剂、igfr-tk抑制剂、抗hgf抗体、pi3激酶抑制剂、akt抑制剂、jak/stat抑制剂、检查点-1或2抑制剂、点状黏着激酶抑制剂、map激酶激酶(mek)抑制剂、vegf trap抗体、培美曲塞(pemetrexed)、埃罗替尼(erlotinib)、达沙替尼(dasatanib)、尼罗替尼(nilotinib)、德卡替尼(decatanib)、帕尼单抗(panitumumab)、胺柔比星(amrubicin)、奥戈伏单抗(oregovomab)、lep-etu、诺拉曲特(nolatrexed)、azd2171、巴他布尔(batabulin)、奥伐木单抗(ofatumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、艾特咔林(edotecarin)、汉防己碱(tetrandrine)、卢比替康(rubitecan)、替米利芬(tesmilifene)、奥利默森(oblimersen)、曲美木单抗(ticilimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、棉子酚(gossypol)、bio 111、131-i-tm-601、alt-110、bio 140、cc 8490、西仑吉肽(cilengitide)、吉马替康(gimatecan)、il13-pe38qqr、ino 1001、ipdr1 krx-0402、胺甲硫蒽酮(lucanthone)、ly317615、纽拉迪布(neuradiab)、维特斯潘(vitespan)、rta 744、sdx102、他仑帕奈(talampanel)、阿曲生坦(atrasentan)、xr 311、罗米地辛(romidepsin)、ads-i00380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他(vorinostat)、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、脂质体、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺(temozolomide)、zk-304709、塞利希布(seliciclib)；pd0325901、azd-6244、卡培他滨(capecitabine)、l-麸胺酸、n-[4-[2-(2-胺基-4,7-二氢-4-侧氧基-1-h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苄酰基]-二钠盐七水合物、喜树碱、peg标记的伊立替康、他莫昔芬(tamoxifen)、柠檬酸托瑞米芬(toremifenecitrate)、阿那曲唑(anastrazole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、des(己烯雌酚(diethylstilbestrol))、雌二醇、雌激素、结合的雌激素、贝伐珠单抗(bevacizumab)、imc-1c11、chir-258、3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹啉酮)、凡塔蓝尼(vatalanib)、ag-013736、ave-0005、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)、双羟萘酸曲普瑞林(triptorelinpamoate)、乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、羟孕酮己酸酯(hydroxyprogesterone caproate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、雷诺昔酚(raloxifene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、cp-724714；tak-165、hki-272、埃罗替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatanib)卡奈替尼(canertinib)、abx-egf抗体、爱必妥(erbitux)、ekb-569、pki-166、gw-572016、爱纳法尼(ionafarnib)、bms-214662、替法米布(tipifamib)；阿米福汀(amifostine)、nvp-laq824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古霉素a(trichostatin a)、fk-228、su11248、索拉非尼(sorafenib)、krn951、胺鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那格雷(anagrelide)、l-天冬酰胺酶、卡介苗(bacillus calmette guerin，bcg)、博莱霉素(bleomycin)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯屈膦酸盐(clodronate)、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、放线菌素d(dactinomycin)、道诺霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉宾(fludarabine)等、氟可体松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、吉西他滨、羟基脲(hydroxyurea)、埃达霉素、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、亮丙立德(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomustine)、甲氮芥、美法仑(melphalan)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、美司钠(mesna)、甲胺喋呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼鲁胺(nilutamide)、奥曲肽(octreotide)、奥沙利铂(oxaliplatin)、帕米膦酸盐(pamidronate)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、利妥昔单抗(rituximab)、链脲菌素(streptozocin)、替尼泊苷(teniposide)、睪固酮(testosterone)、沙力度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、视网酸(tretinoin)、长春地辛(vindesine)、13-顺-视黄酸、苯丙胺酸氮芥(phenylalanine mustard)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)、雌莫司汀(estramustine)、六甲蜜胺(altretamine)、氟尿苷(floxuridine)、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、6-巯基嘌呤(6-mecaptopurine)、脱氧柯福霉素(deoxycoformycin)、骨化三醇(calcitriol)、伐柔比星(valrubicin)、光神霉素(mithramycin)、长春花碱、长春瑞宾(vinorelbine)、拓朴替康、拉佐欣(razoxin)、马立马司他(marimastat)、col-3、新伐司他(neovastat)、bms-275291、角鲨胺(squalamine)、内皮生长抑素(endostatin)、su5416、su6668、emd121974、介白素-12、im862、血管生长抑素(angiostatin)、维他欣(vitaxin)、曲洛昔芬(droloxifene)、艾多昔芬(idoxyfene)、螺内酯(spironolactone)、非那雄安(finasteride)、西米替丁(cimitidine)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、地尼白介素(denileukindiftitox)、吉非替尼(gefitinib)、硼替佐米(bortezimib)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、无十六醇聚氧乙烯醚的太平洋紫杉醇(cremophor-free paclitaxel)、埃博霉素b(epithilone b)、bms-247550、bms-310705、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、哌喷昔芬(pipendoxifene)、era-923、阿佐昔芬(arzoxifene)、氟维司群(fulvestrant)、阿考比芬(acolbifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)、艾多昔芬(idoxifene)、tse-424、hmr-3339、zk186619、拓朴替康(topotecan)、ptk787/zk 222584、vx-745、pd 184352、雷帕霉素(rapamycin)、40-o-(2-羟乙基)雷帕霉素、坦罗莫司(temsirolimus)、ap-23573、rad001、abt-578、bc-210、ly294002、ly292223、ly292696、ly293684、ly293646、渥曼青霉素(wortmarmin)、zm336372、l-779,450、peg-非格司亭(peg-filgrastim)、达贝泊汀(darbepoetin)、红血球生成素(erythropoietin)、颗粒球群落刺激因子、左仑膦酸盐(zolendronate)、普赖松(prednisone)、西妥昔单抗(cetuximab)、颗粒球巨噬细胞群落刺激因子、组胺瑞林(histrelin)、聚乙二醇化干扰素α-2a(pegylated interferon alfa-2a)、干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷(azacitidine)、peg-l-天冬酰胺酶、来那度胺(lenalidomide)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、氢化可体松(hydrocortisone)、介白素-11、右雷佐生(dexrazoxane)、阿仑妥珠单抗(alemtuzumab)、全反式视黄酸、酮康唑(ketoconazole)、介白素-2、甲地孕酮(megestrol)、免疫球蛋白、氮芥(nitrogen mustard)、甲基普赖苏浓(methylprednisolone)、替伊莫单抗(ibritgumomabtiuxetan)、雄激素、地西他滨(decitabine)、六甲蜜胺、贝沙罗汀(bexarotene)、托西莫单抗(tositumomab)、三氧化二砷、可体松(cortisone)、依替膦酸盐(editronate)、米托坦(mitotane)、环孢霉素(cyclosporine)、脂质体道诺霉素(liposomaldaunorubicin)、欧文氏菌属-天冬酰胺酶(edwina-asparaginase)、锶89、卡索匹坦(casopitant)、奈妥吡坦(netupitant)、nk-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(palonosetron)、阿匹坦(aprepitant)、苯海拉明(diphenhydramine)、安泰乐(hydroxyzine)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、劳拉西泮(lorazepam)、阿普唑仑(alprazolam)、氟哌啶醇(haloperidol)、氟哌啶(droperidol)、屈大麻酚(dronabinol)、地塞米松(dexamethasone)、甲基普赖苏浓、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、格拉司琼(granisetron)、昂丹司琼(ondansetron)、多拉司琼(dolasetron)、特比司琼(tropisetron)、派非格司亭(pegfilgrastim)、红血球生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa)及阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、多西他赛(docetaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、姜黄素(curcumin)、姜黄素类似物。

97、提供以下实例从而使一般熟习本发明涉及的技术者可更理解本发明，但并不意欲限制本发明的范畴。

98、实例

99、材料、方法及测试模型

100、穿透式电子显微镜(tem)

101、穿透式电子显微术(tem)用于直接检查及验证二氧化硅奈米粒子的外观。在以100kv加速电压操作的hitachi h-7100穿透式电子显微镜上获取tem影像。将分散于乙醇中的样品滴在经碳涂布的铜网上，且风干，用于tem观测。

102、动态光散射(dls)及ζ电位

103、二氧化硅奈米粒子在不同溶液环境中的尺寸量测为通过动态光散射(dls)在malvern zetasizer nano zs(malvern,uk)上进行。分析不同溶液中形成的(溶剂化)粒度：室温下h2o及pbs缓冲溶液(ph 7.4)。通过malvern zetasizer nano zs量测在0.1mg/ml粒子浓度下pbs(0.01x，ph 7.4)中二氧化硅奈米粒子的表面电荷(ζ电位)。

104、元素分析

105、通过元素分析仪(ncsh的elementar vario el立方体型，german)测定二氧化硅奈米粒子中的碳、氮、氧、硫及氢的质量百分比。

106、实例1

107、制备在粒子外表面上具有改质但在孔侧壁上无改质的中孔二氧化硅奈米粒子

108、使用氨碱催化的方法在高度稀释及低界面活性剂条件下制备msn。通过调整氨浓度、添加的teos量及反应温度来控制粒度。通常，在60℃下在密封烧杯中使0.29g ctab溶解于150ml氢氧化铵溶液(0.128m至0.17m)中。搅拌15分钟后，移除密封盖，且随后在剧烈搅拌下将含390μl四乙氧基硅烷(teos)及5μl 3-胺基丙基三甲氧基硅烷(aptms)的4.105ml乙醇溶液添加至溶液中。在搅拌1小时之后，将含550μl peg及85.7-300μl ta(视情况添加)的2ml乙醇溶液引入反应中。在搅拌混合物30分钟之后，在不搅拌下使混合物在60℃下老化隔夜，直至反应体积下降至50ml。接着用0.22μm过滤器过滤溶液且置于70℃下的烘箱中进行24小时的水热处理。洗涤合成的样品且通过交叉流收集。为移除msn的孔中的界面活性剂，在60℃下，将合成的样品收集在含有848μl hcl(36.5-38％)的50ml乙醇溶液中，进行第一次酸萃取，历时1小时，且收集在含有50μl hcl的50ml乙醇溶液中，进行第二次酸萃取，历时1小时。将产物洗涤且通过交叉流收获，且最终储存于h2o或有机溶剂中。msn的粒度(25nm及50nm)通过调整teos及nh4oh的浓度(25nm msn：msn-peg 25、msn-peg/ta 25；50nm msn：msn-peg 50、msn-peg/ta 50)控制。

109、实例2

110、制备在孔侧壁上具有磺酸官能基的中孔二氧化硅奈米粒子((so3-)-msn)

111、在45至65℃下在密封烧杯中，使0.2至0.5g ctab溶解于100至250ml氢氧化铵水溶液(约0.05m至1.2m)中。在搅拌10至30分钟之后，添加含200至550μl四乙氧基硅烷(teos)及10至100μl(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)(teos/mptms的莫耳比＝50:1、40:1、25:1、20:1、10:1、8.3:1及5:1，可改变teos:mptms比率以针对不同应用或装载药物调节孔表面的官能基的量)的900-2500μl乙醇溶液且搅拌30至90分钟。此后，再引入含50至130μl四乙氧基硅烷(teos)的0.8至2ml乙醇溶液，且搅拌1.5至3小时。随后，引入含650至1700μl 2-[甲氧基(聚伸乙基氧基)丙基]-三甲氧基硅烷(peg-硅烷)及100至260μl氯化n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]-n,n,n-三甲铵(ta-硅烷)的2000至5400μl乙醇溶液且搅拌0.5至1.5小时。随后，使混合物在40至60℃下老化至少15小时。最后，密封溶液且将其置放于65至75℃下的烘箱中，进行15至24小时的水热处理。洗涤中间产物且通过离心或交叉流收集。最终处理中间产物，从而移除界面活性剂及纯化，洗涤且通过离心或交叉流收获。为将巯基(硫醇)基团转化成磺酸盐基，通过将氧化剂引入中间物中来进行氧化，且进一步纯化最终产物。将产物储存于水、有机溶剂或缓冲液中。

112、在pbs缓冲液中经由动态光散射(dsl)量测(so3-)-msn的流体动力直径。dls结果显示，所有(so3-)-msn充分分散于约30nm至50nm范围内，但高度引入磺酸的粒子(teos:mptms＝5:1)其分散度可能受到影响(在水及pbs缓冲液中流体动力直径为约60nm)。ntt2_185及ntt2_186k的合成条件为teos/mptms(8.3:1)及peg-硅烷/ta-硅烷(7:1)。ntt2_185及ntt2_186k的表征包括通过tem量测的粒径约20.6nm及25.1nm；在pbs中量测的dls粒径约33.5及39.7nm；ζ电位约-25mv及-25.3mv。ntt2_186k的表征类似于ntt2_185，但ntt2_186k的表面改质及制造制程经过优化。

113、制备具有中性表面电荷(ζ电位)的(so3-)-msn

114、在55至65℃下在密封烧杯中，使0.2至0.5g ctab溶解于100至250ml氢氧化铵水溶液(约0.05m至1.2m)中。在搅拌10至30分钟之后，分开引入含25至70μl 3-(三羟基硅基)丙烷-1-磺酸(tps)的250至700μl水、含200至550μl四乙氧基硅烷(teos)的900至2500μl乙醇溶液及另一含50至130μl四乙氧基硅烷(teos)的800至2000μl乙醇溶液，各次引入后在55至65℃下搅拌5分钟至2.5小时。随后，引入含650至1700μl 2-[甲氧基(聚伸乙基氧基)丙基]-三甲氧基硅烷(peg-硅烷)及30至90μl n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(edptms)的2000至5400μl乙醇溶液且搅拌0.5至1.5小时。随后，使混合物在45至65℃下老化至少15小时。最后，密封溶液且将其置放于60至90℃的烘箱中，进行18至30小时的水热处理，得到最终产物(so3-)-msn(ntt2_202)。

115、ntt2_202的表征包括通过tem量测的粒径约28.2nm；在pbs中量测的dls粒径约52.9nm；ζ电位约+1.41mv。

116、实例3

117、伊立替康(iri)装载至msn中

118、将含300mg msn的16.785ml h2o与495μl nahco3(0.1m，ph 9.96)或乙酸盐缓冲液(0.1m，ph 5.5)混合。在室温下震荡5分钟之后，在室温下将iri溶液引入溶液中，搅拌30分钟。此后，将混合物通过vivaspin或交叉流，用nahco3(2.5mm，ph 8.5)或乙酸盐缓冲液(2.5mm，ph 5.5)洗涤且纯化。最后，将产物储存于nahco3或乙酸盐缓冲液中。

119、伊立替康(iri)装载至(so3-)-msn(ntt2_185及ntt2_186k)中

120、在室温下，将含600mg粒子的6ml乙酸盐缓冲液(2.5mm，ph 5.5)与iri溶液混合，搅拌30分钟。此后，将混合物通过vivaspin或交叉流用乙酸盐缓冲液洗涤且纯化。最后，将产物储存于乙酸盐缓冲液中。

121、伊立替康(iri)装载至(so3-)-msn(ntt2_202)中

122、将含150mg ntt2_202的1.5ml h2o与375μl nahco3(93mm，ph 11.5)混合从而进行碱处理。接着在室温下引入iri溶液，搅拌10分钟。此后，混合物首先用h2o洗涤且接着通过vivaspin用乙酸盐缓冲液(2.5mm，ph 5.5)洗涤。随后在4℃下将在ntt2_202下的iri浸入7.5ml乙酸盐缓冲液中，历时至少15小时。此后，进一步用乙酸盐缓冲液洗涤混合物且将产物储存于乙酸盐缓冲液中。

123、iri装载至msn或(so3-)-msn的驱动力为静电相互作用。带正电荷的iri吸附至在孔的内表面上具有带负电荷的硅烷醇基团或官能基的msn的孔中。伊立替康(pka约10.9)在环境ph小于10.9下带正电荷且iri的构形视ph而变化。iri在酸性环境(ph<5.5)中呈内酯形式(其视为具有治疗活性)，且在弱酸性、中性或碱性环境(ph>6)中呈羧酸盐形式(其视为非活性形式)。根据iri的特性，iri装载过程的适当条件在ph5.5或更低的情况下，此可使iri带正电荷且呈活性形式。针对msn、ntt2_186k及ntt2_202测试不同装载策略。在酸性条件(ph≦5.5)下将iri装载至msn中展现较差的装载能力(3.93％)及效率(33％)，及装载有iri的msn具有较差的长期稳定性。原因为孔的内表面上的硅烷醇基团在酸性条件下呈现弱负电荷，导致iri与孔侧壁上的硅烷醇基团之间的静电相互作用差。在碱性条件下进行iri装载过程增加msn的孔中的负电荷，此可将装载能力提高至10％-15％。然而，在装载有iri的msn中iri的内酯形式比率为约63％且随着储存时间不断减少。相比之下，(so3-)-msn在孔侧壁上具有磺酸官能基(约pka-7)，其甚至在酸性条件下亦可展现强负电荷。ntt2_186k的iri装载能力(11.43％)及效率(>80％)比在孔的内表面上无磺酸官能基的msn高得多。更重要地，几乎所有iri分子均呈内酯形式(>99％)。在粒子表面上经edptms改质的另一(so3-)-msn(ntt2_202)展现中性ζ电位。为将iri装载至ntt2_202中，略微调整装载过程。首先，用碱性nahco3缓冲液处理ntt2_202粒子从而将ntt2_202的表面上的胺基去质子化，从而减弱带正电荷的胺基与iri之间的静电斥力。iri分子可经由孔侧壁上的带负电荷的磺酸基与带正电荷的iri之间的静电相互作用而装载至孔中。在装载过程之后，用乙酸盐缓冲液洗涤装载有iri的ntt2_202且将其储存于酸性条件中进行长期储存。在装载有iri的ntt2_202中iri的内酯形式比率可达到约96％或更高。尽管ntt2_202的装载能力低于ntt2_186k，但ntt2_202提供一种合成具有中性表面电荷(ζ电位)且装载有iri的msn粒子的方法，且粒子仍可展现良好装载能力、效率及iri的内酯形式比率。总之，磺酸官能基(pka≦4.5的官能基)在msn的孔的内表面上进行改质，此对于将iri装载至msn而言，尤其对于在酸性条件下进行的装载过程而言为重要的。装载有iri的msn的表征展示于表1中。

124、表1

125、

126、实例4

127、伊立替康在msn中的奈米调配物用于胰脏癌疗法

128、为评估活体内装载有iri的(so3-)-msn抗胰脏肿瘤的功效，将5×106个panc-1细胞人类胰脏癌细胞皮下植入nod scid小鼠的左侧腹，从而充当panc-1异种移植小鼠模型。当肿瘤体积达到100mm3时开始第一次注射。携带肿瘤的小鼠接受伊立替康(iri)、iri与吉西他滨gem(一种经批准用于胰脏治疗的药物)共同治疗及装载有iri的ntt2_185，每周一次20mg iri/kg，总共投与4次。在研究时段内观测肿瘤尺寸及体重。结果表明装载有iri的ntt2_185及(iri+gem)组合疗法对肿瘤生长抑制的功效优于iri。尽管装载有iri的ntt2_185的抗癌功效类似于iri+gem，但装载有iri的ntt2_185展现与(iri+gem)组合疗法相比更小的毒性(更低的体重减轻)(图2)。亦在另一皮下同种异体移植肿瘤模型中评估装载有iri的(so3-)-msn的抗胰脏癌功效。将2×106kpc细胞皮下植入b6小鼠的左侧腹上。当肿瘤体积达到100mm3时开始第一次注射。携带肿瘤的小鼠接受iri及装载有iri的(so3-)-msn，每周两次20mg/kg，总共投与4次。装载有iri的(so3-)-msn与iri组相比展现显著肿瘤生长抑制。此外，装载有iri的(so3-)-msn展现剂量相关的抗癌功效。总之，伊立替康在msn中的奈米调配物具有更佳的肿瘤靶向能力(基于msn的epr作用)，使得药物相关的毒性减弱且改善肿瘤抑制。iri的msn奈米调配物提供针对胰脏癌治疗的未满足医学需求的可能治疗。

129、实例5

130、伊立替康在msn中的奈米调配物用于大肠直肠癌疗法

131、为评估活体内装载有iri的(so3-)-msn(装载有iri的ntt2_186k)抗大肠直肠肿瘤的功效，将5×106个hct-116细胞人类大肠直肠癌细胞皮下植入nod-scid小鼠的左侧腹上，从而充当hct-116异位异种移植小鼠模型。携带肿瘤的小鼠接受iri及装载有iri的ntt2_186k，每周两次20mg/kg及40mg/kg的剂量，总共投与6次。在研究时段内观测肿瘤尺寸及体重。伊立替康在msn中的奈米调配物展现比单独伊立替康更高的有效肿瘤抑制。结果表明装载有iri的ntt2_186k展现剂量相关的抗癌功效。在40mg/kg装载有iri的ntt2_186k组中，肿瘤生长得到显著遏制且在投与期间未观测到体重减轻。治疗后，用40mg/kg装载有iri的msn治疗的小鼠上的肿瘤几乎消失。此外，装载有iri的ntt2_186k可以比单独iri低两倍的剂量达成类似功效(图3)。

132、实例6

133、伊立替康于msn中的奈米调配物能够抑制原发性肿瘤生长及转移且延长小鼠存活时间

134、大肠直肠癌具有高度转移性，且非常需要能够抑制原发性大肠直肠肿瘤生长以及转移的有效疗法。原位转移性大肠直肠癌模型为测试治疗剂有效性的良好模型。利用手术将2×106个表现荧光素酶的hct-116细胞直接注射至盲肠的壁中从而建立原位大肠直肠癌转移模型，此模型自发地在相邻肠组织、腹膜及远处转移(脾脏、肾脏、肝脏及隔膜)中产生高度转移性肿瘤。携带肿瘤的小鼠接受iri及装载有iri的ntt2_186k，每周两次40mg/kg的剂量，总共投与8次。一周一次通过ivis系统观测肿瘤生长及转移，且在研究时段内观测体重。为评估总存活期，监测动物直至自发性死亡或接近濒死状态的时间点。ivis影像及定量生物发光强度的结果呈现对照组中的快速肿瘤生长及明显腹膜转移，由此促进小鼠死亡。与对照组相比，用单独iri处理的小鼠展现较慢肿瘤生长速率，但iri展现肿瘤生长及转移的低效抑制，因此一旦治疗中断，即观测到肿瘤复发及肿瘤转移。装载有iri的ntt2_186k显著抑制原发性肿瘤生长及癌症转移，且癌细胞的生物发光信号在治疗后侦测不到。装载有iri的ntt2_186k治疗组其存活时间比iri治疗组及对照组长得多，所有小鼠皆存活至研究结束(图4a及4b)。亦使用另一转移小鼠模型进行功效研究。将hct-116-luc细胞肿瘤块(2-3mm×2-3mm块)固定至盲肠壁从而充当原位大肠直肠癌转移模型。观测到类似结果，装载有iri的ntt2_186k治疗组展现显著抑制原发性肿瘤生长及癌症转移并延长存活。总之，伊立替康在msn中的奈米调配物可提供优于伊立替康的益处，同时抑制原发性肿瘤生长及癌症转移并延长存活期。抗肿瘤剂在msn中的奈米调配物提供对于具高度转移性癌症的潜在治疗。

135、实例7

136、管形成分析

137、癌细胞迁移及肿瘤血管生成为癌症转移的重要因素。在肿瘤血管生成过程期间，内皮细胞自现有血管长出且在肿瘤部位附近形成新血管，所述血管为肿瘤快速生长提供营养物。使用管形成分析研究msn对细胞迁移及血管生成的作用。通过在基质胶上接种huvec细胞建立管形成分析试验。6小时后，观测到管状结构的形成且使用imagej计算血管的接合点。在对照组及ssn(固体二氧化硅奈米粒子)组中，展现管状结构的完整网络。然而，在四个msn组中，管状结构的形成受到抑制。结果表明msn可抑制huvec的爬行且防止管状结构形成(图5)。

138、实例8

139、血管生成的绒毛尿囊膜(cam)分析试验

140、为评估msn对肿瘤血管生成的作用，使用鸡胚胎绒毛尿囊膜(cam)肿瘤模型。将受精蛋在培育箱中培育10天，接着在蛋壳中开一窗口，并将癌细胞植入cam膜上主动脉附近。在第12天，当形成肿瘤时，投与msn或多柔比星(dox)且在第14天及第16天观测肿瘤附近的血管生成。

141、在dox治疗组中，血管展现崩解及密度降低，此归因于dox抑制血管增殖。虽然msn未像dox一般降低血管密度，但msn引起血管不规则生长且相较于对照组中的血管，阻止肿瘤区域中的血管形成。在msn组中，分支微血管的数目增加，但长度变得短得多(图6)。msn抑制内皮细胞及肿瘤细胞的迁移，因此肿瘤诱发的血管内皮细胞增殖无法向外扩散且仅原位积聚。总之，在msn治疗组中，血管密度未降低，但内皮细胞的迁移能力受到影响，引起血管不规则生长。

142、实例9

143、在活体内研究中msn抑制转移且增加总存活期(lipo-dox与msn的共同治疗)

144、使用自发性癌症转移小鼠模型评估msn转移抑制对存活时间的影响。将1.5×106个表现荧光素酶的4t1癌细胞皮下植入balb/c小鼠的左侧腹上，从而充当异位同种异体移植小鼠模型。携带肿瘤的小鼠接受lipo-dox(iv注射，4mg/kg)，与/不与msn(iv或it注射)组合，以3天时间间隔总共投与3次。在肿瘤注射之后监测肿瘤生长及总存活期。为追踪癌症转移，在第22、26、29及34天通过ivis系统获取生物发光图。观测到对照组中的小鼠快速生长且癌细胞转移至身体其他部分。在lipo-dox处理组中，虽然原发性肿瘤的生长受到抑制但仍观测到癌症转移。对照组及lipo-dox处理组的严重转移导致小鼠死亡，使得两组具有类似存活时间。相比之下，用lipo-dox及msn(msn经由静脉内或瘤内注射进行注射)共同治疗显著抑制转移且延长存活时间(图7)。结果表明msn明显抑制癌症转移，但不影响体重及原发性肿瘤尺寸。转移为引起死亡的主要因素，抗肿瘤剂(化学治疗剂、蛋白、核酸药物)在msn中的奈米调配物或抗肿瘤剂与msn共同治疗可同时遏制原发性肿瘤生长及癌症转移且延长存活时间。msn可提供额外临床益处，降低转移发生率，尤其对于具有高转移倾向的癌症。

145、实例10转移抑制机制

146、为研究msn抑制细胞迁移、血管生成及癌症转移的机制，通过西方墨点法评估用msn处理的癌细胞(4t1)的蛋白质表现量。根据西方墨点法的结果，用msn-peg/ta 25处理的细胞中p-erk、p-桩蛋白及p-fak的蛋白质表现量低于对照组，此表明msn抑制erk、桩蛋白及fak的磷酸化(图8a)。这些蛋白质(erk、桩蛋白及fak)的磷酸化已被证明与细胞迁移相关的点状黏着转换有关。结果表明msn可断点状黏着转换的平衡，引起细胞迁移、血管生成及癌症转移的抑制。此外，处死在抗转移活体内研究中用msn治疗的携带肿瘤的小鼠且收集肿瘤并切片从而进行免疫组织化学染色。肿瘤(来自经msn治疗的小鼠)中来自p-fak及p-epr的绿色信号显著低于对照组(图8b)。分析细胞中的蛋白质表现及肿瘤中的蛋白质标记物的免疫荧光的结果，证实msn抑制转移的机制与点状黏着转换的平衡的中断有关。

147、文献中提出奈米粒子限制细胞运动性的另一机制，其为奈米粒子介导的对细胞内微管组装的大规模破坏。为评估msn对细胞的细胞骨架的影响，通过西方墨点法及免疫荧光分析来侦测经msn处理的细胞其与细胞骨架相关的蛋白质表现(g-肌动蛋白及f-肌动蛋白)及细胞骨架形态(f-肌动蛋白及α-微管蛋白)的变化。西方墨点法及免疫荧光分析数据显示msn处理组与对照组之间无差异；使得msn不影响肌动蛋白及微管细胞骨架。msn转移抑制与点状黏着转换的平衡的中断有关，而与细胞内微管细胞骨架的干扰无关。

148、实例中所说明的成分、反应条件及参数仅出于说明的目的且并不意欲限制材料或制备方法。

149、本发明的一般熟习此项技术者应理解，在不脱离本技术案的精神及范畴下，可对本发明的教示及揭示内容作出变化及修改。基于以上内容，本技术案意图涵盖其任何变化及修改，其限制条件为所述变化或修改属于如随附申请专利范围或其等效物所定义的范畴内。