一种肿瘤组织靶向脂质体及其制备方法和应用

本发明属于肿瘤疫苗，具体涉及一种提高药物在血管-淋巴管递送效率的肿瘤组织靶向脂质体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、肿瘤疫苗是通过将肿瘤抗原与免疫佐剂一起递送到抗原呈递细胞（apcs）中来激活肿瘤特异性免疫反应，进而引发抗肿瘤免疫反应杀死肿瘤细胞。目前肿瘤疫苗包括肿瘤单价疫苗、肿瘤多价疫苗、肿瘤全细胞疫苗以及肿瘤原位疫苗。与传统其他疫苗不同，肿瘤原位疫苗是通过各种手段原位促进肿瘤部位抗原产生，并启动免疫反应，发挥抗肿瘤的功能，具有抗原范围广、无需分离鉴定抗原、副作用小、适用于个体化治疗以及可以与其他手段相联合的优势。放射治疗、化学治疗、光动力治疗、光热治疗等手段均可诱导免疫原性细胞死亡，促进肿瘤部位抗原的产生，激活apcs，进而启动免疫反应。

3、有效的免疫反应需关注免疫循环各个过程，主要涉及：1）通过apcs来递呈和识别肿瘤抗原；2）apcs向引流淋巴结（tdlns）的迁移并在tdlns中诱导t细胞共刺激信号和细胞因子表达，启动和激活 t 细胞；3）效应t细胞通过血管迁移至肿瘤组织，识别肿瘤抗原，发挥抗肿瘤免疫反应。目前有越来越多的研究关注肿瘤疫苗中各个过程，通过各种手段促进包括抗原的产生，dc细胞的成熟，t细胞的激活以及解除t细胞在肿瘤部位的失活，肿瘤部位血管异常化等问题，但是肿瘤和淋巴结之间信息交流和细胞交换的“通路”确鲜有人关注。

4、在抗原信息被dc细胞摄取后，需通过淋巴管迁移至肿瘤引流淋巴结，并在引流淋巴结内部实现t细胞的激活，随后激活的t细胞通过血管迁移到肿瘤组织并在其中发挥功能，因此，“血管-淋巴管”是肿瘤组织和淋巴结组织交流的“通路”。肿瘤部位血管和淋巴管的异常阻碍了激活的t细胞迁移至肿瘤内和dc携带抗原信息向淋巴结的迁移，这极大抑制了体内免疫反应的疗效。然而现有研究仅仅关注改善肿瘤部位血管异常化从而促进免疫细胞瘤内浸润，少有研究关注淋巴管的异常。肿瘤组织淋巴管异常是指肿瘤周围的淋巴系统发生了改变或损害。在正常情况下，淋巴管可以排除体内的废物、细菌和其他物质，帮助维持身体的免疫功能。但是当肿瘤形成时，它可能会对周围的淋巴管产生压力或侵犯，导致淋巴管发生异常。这种异常可能包括淋巴管的扩张或变形，甚至有时会出现淋巴管的堵塞，抑制dc细胞向淋巴结内部的迁移，降低了淋巴结内部抗原的递送，从而降低抗肿瘤免疫疗效。

5、因此需要开发一种肿瘤疫苗，提高肿瘤疫苗在血管-淋巴管递送效率，并实现药物的肿瘤靶向，提高肿瘤治疗效果。

技术实现思路

1、鉴于肿瘤组织和淋巴结组织在免疫反应中的关键作用，重塑两者之间交流的“通路”——血管和淋巴管，将会显著改善肿瘤原位疫苗的疗效，且该发明不仅仅局限于肿瘤原位疫苗，对于任何激活免疫的策略都是有促进意义的。为重塑肿瘤组织和淋巴结组织之间血管和淋巴管的正常化。本发明设计并制备了两个结构类似的脂质体：rgd靶向肽（氨基酸序列为：甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-天冬酰胺酰-脯氨酸）修饰的包载血管内皮生长因子c（vegfc）的主动靶向脂质体（vegfc-αlip）和rgd靶向肽修饰的包载修饰精氨酸（argine）和马来酰亚胺（malemide）的空心金纳米粒（hollow gold nanospheres coatedwith argine and malemide, ham）的主动靶向脂质体 (ham-αlip)，以实现血管和淋巴管的重塑。vegfc-αlip和ham-αlip均能够在rgd靶向肽的作用下，实现肿瘤组织的大量蓄积。vegfc-αlip能够释放出vegfc，vegfc可以和vegfr3受体结合，促进淋巴管的生成，改善dc细胞向肿瘤组织的迁移；ham-αlip在体内激光照射下释放出精氨酸和马来酰亚胺共修饰的空心金纳米粒（hgn），同时诱导肿瘤细胞凋亡，释放出肿瘤抗原。一方面hgn上马来酰亚胺基团能够和肿瘤抗原上巯基反应捕获肿瘤抗原，另一方面，hgn上精氨酸能够在激光照射诱导产生的活性氧作用下分解，释放一氧化氮（no），发挥重塑血管的功能。重塑血管联合重塑淋巴管，将会在肿瘤组织和淋巴结组织搭建免疫细胞往返的“通道”，达到最大化免疫治疗效果，具有明显的创造性。

2、本发明第一方面，提供一种脂质体，包括脂质体ham-αlip和脂质体vegfc-αlip，所述脂质体ham-αlip活性物质为ham，所述脂质体vegfc-αlip活性物质为血管内皮生长因子c（vegfc），所述脂质体ham-αlip和脂质体vegfc-αlip的空白脂质体中都包含二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-rgd（dspe-peg2000-rgd），所述ham为精氨酸和马来酰亚胺共修饰的空心金纳米粒。

3、进一步的，所述空白脂质体还包含磷脂和胆固醇，所述磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）。更进一步的空白脂质体通过薄膜分散法制备。

4、进一步的，所述脂质体ham-αlip和脂质体vegfc-αlip的活性物质的质量比为8:1，能够达到重塑淋巴管和血管“通路”的良好治疗效果。

5、进一步的，所述脂质体ham-αlip中dppc、胆固醇、dspe-peg2000-rgd的质量比为20:2.5:5，ham溶液为0.2 mg/ml，该比例能够有效包载ham并发挥靶向递送的功能，且该浓度的ham溶液具备肿瘤部位血管重塑的功能。

6、进一步的，所述脂质体vegfc-αlip中dppc、胆固醇、dspe-peg2000-rgd的质量比为20:2.5:5，vegfc溶液为100 ng/ml，该比例能够有效包载vegfc蛋白并发挥靶向递送的功能，且该浓度的蛋白溶液能够发挥生物学功能。

7、进一步的，所述ham为本专利首次合成，合成步骤为，首先制备表面修饰金壳的钴纳米球（hgn），进一步hgn表面修饰活化后的s-乙酰基硫代乙醇酸n-琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇2000-精氨酸（sata-peg2000-arg）和s-乙酰基硫代乙醇酸n-琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（sata-peg2000-mal），得到ham。

8、本发明另一方面，提供一种脂质体的制备方法，步骤如下：

9、1）称取dppc、胆固醇和dspe-peg2000-rgd溶解于甲醇中，旋转蒸发，除去有机溶剂，形成脂质薄膜；

10、2）步骤1）中加入ham溶液，超声，获得脂质体ham-αlip；

11、3）步骤1）中加入vegfc溶液，超声，获得脂质体vegfc-αlip。

12、进一步的，详细步骤如下：

13、1）采用dppc（20 mg）、胆固醇（2.5 mg）和dspe-peg2000-rgd（5% 摩尔比例）为材料制备，称取后溶解于甲醇（2 ml）中，在40℃下旋转蒸发30分钟，除去有机溶剂，形成脂质薄膜。

14、2）步骤1）中加入2 ml ham溶液，在超声条件下超声30分钟，即可获得ham-αlip。所述ham的制备如下，在氮气保护下向预脱氧水（100 ml）中加入柠檬酸钠（0.1 mm）、氯化钴（0.1 mm）和pvp（0.1 μm），并在持续搅拌下，加入硼氢化钠（0.8 mm）以形成均匀的钴纳米球。当溶液中无气泡产生后，加入1% 氯金酸（430 μl），在钴纳米球表面形成金壳。然后将反应溶液暴露在空气中，使内部钴纳米球氧化，即可得到所需的hgn。将hgn与活化后的sata-peg2000-arg和sata-peg2000-mal混合（hgn、sata-peg2000-arg和sata-peg2000-mal的质量比为1：0.6：0.6），并于室温条件下搅拌过夜，得到ham。

15、3）步骤1）中加入2 ml vegfc溶液，在超声条件下超声30分钟，即可获得ham-αlip或vegfc-αlip。

16、用dls测定vegfc-αlip和ham-αlip的粒径和电位，透射电镜表征vegfc-αlip和ham-αlip的表面形态。

17、本发明另一方面，提供一种脂质体在制备重塑血管-淋巴管药物中的应用。

18、本发明另一方面，提供一种脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

20、（1）本发明将vegfc和ham分别装载于脂质体中并修饰肿瘤组织靶向因子，能够提高蛋白的稳定性，同时防止ham上修饰的马来酰亚胺基团对血液中蛋白的捕获，保证其对肿瘤抗原的捕获，能够提高抗肿瘤效果。

21、（2）本发明显著改善了肿瘤组织血管和淋巴管的重塑，在黑色素瘤模型中，肿瘤切片显示精氨酸修饰联合vegfc后能够显著增加血管和淋巴管的浸润，ham-αlip和vegfc-αlip同时能够提高抗肿瘤效果，并促进t细胞和ctl在肿瘤组织的浸润。

22、（3）本发明中的磷脂胆固醇的浓度，vegfc以及ham的装载都是经过优化后的数据，其疗效效果较好。本发明所使用原料简单、安全可靠。载体材料磷脂和胆固醇均为人体内源性物质，安全无毒且生物可降解，具有良好的生物相容性。