滨海刺芹愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化或抗炎皮肤产品中的应用与流程

本发明属于护肤品或药品，涉及一种滨海刺芹愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化或抗炎皮肤产品中的应用，皮肤产品包括：氧化或抗炎皮肤产品。

背景技术：

1、滨海刺芹，属伞形科刺芹属，是一种欧洲原生的海岸植物，生长于海岸沙地和卵石滩等地，长期承受土壤养分含量低、霜冻、强碱风、高温和日晒等极端环境，使其进化成为一种生命力极其强大的盐生植物，富含高活性类黄酮、多酚、多元醇脂肪酸等。在医学上，经常被用作镇痛消炎的药物，且其强大的抗氧化能力，也受到了大量化妆品的青睐。

2、类囊泡是由细胞分泌释放到外部环境中，直径为40-150nm的纳米级囊泡，具有磷脂双分子层结构，内含mrna、mirna、蛋白质等。能够参与细胞间通讯，调节受体细胞的基因表达、刺激信号通路等作用。随着研究的深入，也发现了植物类囊泡，通过透射电镜检测，其形态结构与动物来源外泌体类似，同样具有磷脂双分子层结构，含有mrna、mirna和蛋白质等成分。植物源性类囊泡不仅来源广泛，安全无毒，并且免疫原性低，同样能够促进物种间的生物信息交流。

3、目前，植物类囊泡的提取主要通过对整株植物的功效部位或者愈伤组织经过破碎后提取获得。但这种方法效率低，需要大量的整株植物的功效部位，并且通过破碎后获得植物类囊泡的纯度也较低。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种滨海刺芹愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化或抗炎皮肤产品中的应用。

2、本发明采用一种使用切向流柱层析方法从滨海刺芹愈伤组织培养液中提取滨海刺芹愈伤组织类囊泡，并对类囊泡进行了抗氧化和抗炎功效评价，探索其在护肤品中应用的可能性。

3、本发明的发明人发现愈伤组织培养液中含有大量愈伤组织分泌的类囊泡，相比处理整株植物或愈伤组织，获得的类囊泡纯度更高，且不含有机溶剂，对皮肤刺激小。通过验证发现滨海刺芹愈伤组织类囊泡与其愈伤组织或提取物相比，具有更好的抗氧化或美白功效。

4、解决方案

5、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

6、第一方面，本发明提供一种滨海刺芹愈伤组织类囊泡在制备抗氧化或抗炎皮肤产品中的应用，可选地，所述滨海刺芹愈伤组织类囊泡来源于滨海刺芹愈伤组织培养液。

7、进一步地，所述滨海刺芹愈伤组织类囊泡在产品中的浓度为108~1012particles/ml，可选地为109~1012particles/ml，可选地为1010~1012particles/ml，可选地为1011~1012particles/ml。

8、进一步地，所述滨海刺芹愈伤组织类囊泡能抑制cox-2表达和/或抑制ros生成，可选地，抗氧化或抗炎皮肤产品为抑制cox-2表达和/或抑制ros生成的产品。

9、进一步地，所述滨海刺芹愈伤组织类囊泡采用如下方法制备：

10、1）将滨海刺芹愈伤组织进行光照培养，收集培养液；

11、2）从步骤1）的培养液中分离获得含有滨海刺芹愈伤组织类囊泡的上清液，浓缩，纯化，获得滨海刺芹愈伤组织类囊泡。

12、第二方面，提供一种滨海刺芹愈伤组织类囊泡的提取方法，包括如下步骤：

13、1）将滨海刺芹愈伤组织进行光照培养，收集培养液；

14、2）从步骤1）的培养液中分离获得含有滨海刺芹愈伤组织类囊泡的上清液，浓缩，纯化，获得滨海刺芹愈伤组织类囊泡。

15、上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，获得含有滨海刺芹愈伤组织类囊泡的上清液的方式包括离心、取离心上清液过滤获得含有滨海刺芹愈伤组织类囊泡的上清液。

16、上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，中空纤维的截留分子量≥100kd，可选地为100kd~800kd，可选地为100kd~750kd，可选地为100kd~300kd。

17、上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，过滤方法采用0.2μm至1μm间不同孔径（可选地孔径为0.6μm~1μm，可选地孔径为0.8μm~1μm，优选孔径为1μm）的深层过滤器。

18、上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，浓缩倍数为50~200倍或80~150倍或100~150倍。

19、上述第一方面或第二方面中，所述滨海刺芹愈伤组织通过将滨海刺芹植株的部分组织诱导获得。

20、上述第一方面或第二方面中，滨海刺芹植株的部分组织包括植株的顶端和腋生组织中的一种或两种。

21、上述第一方面或第二方面中，所述滨海刺芹愈伤组织经诱导获得，诱导培养基包括：固体ms培养基，还添加有0.5-2mg/l3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸和0.5-2mg/l噻苯隆。具体地：

22、可选地，叶腋分支的方法获得外植体茎芽，通过培养获得外植体，外植体培养基以ms培养基为基础，还含有琼脂7.6g/l，6-苄基腺嘌呤（bap）2.0mg/l，ii吲哚乙酸（iaa）1mg/l和赤霉素（ga3）2mg/l。

23、可选地，培养条件为：55±2μmol/m2s光子照度，16±2h光照/8±2h黑暗的光照循环，保持温度在21±2℃的条件下培养。

24、可选地，外植体茎芽培养40天后，获得大量新生的外植体，取其叶片置于50ml固体ms培养基（添加1mg/l3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸和1mg/l噻苯隆）培养3周，得到愈伤组织块。

25、上述第一方面或第二方面中，步骤1）中，光照培养采用悬浮培养基，悬浮培养基包括：1.0-4.0mg/l2,2-双(3-氨基-4-羟基苯基)丙烷（bap），1-5mg/l吲哚-3-乙酸（iaa）、1-5mg/l赤霉素（ga3）和100mg/l聚乙烯吡咯烷酮，可选地为1.0-4.0mg/l2,2-双(3-氨基-4-羟基苯基)丙烷（bap），0.5-2.0mg/l吲哚-3-乙酸（iaa）、1-4mg/l赤霉素（ga3）和80-120mg/l聚乙烯吡咯烷酮。可选地，继续继代培养，培养条件为：55±2μmol/m2s光子照度,16±2h光照/8±2h黑暗的光照循环，保持温度在25±2℃的条件下培养。

26、第三方面，提供一种含有滨海刺芹愈伤组织类囊泡的抗氧化或抗炎皮肤产品，包括第二方面的提取方法提取的滨海刺芹愈伤组织类囊泡。

27、进一步地，所述滨海刺芹愈伤组织类囊泡在产品中的浓度为108~1012particles/ml或1010~1012particles/ml。

28、有益效果

29、1）本发明从滨海刺芹愈伤组织培养液中利用切向流超滤和色谱法结合，提取培养液中的类囊泡，实现大规模滨海刺芹愈伤组织类囊泡工业化生产。且本发明的滨海刺芹愈伤组织类囊泡对细胞没有毒性，因此可以选择提取到的最高浓度，提高其应用安全性。

30、2）本发明获得的滨海刺芹愈伤组织类囊泡能够抑制ros生成，有较好的抗氧化功效。

31、3）本发明获得的滨海刺芹愈伤组织类囊泡能抑制cox-2表达，说明有较好的抗炎功效。