一种重组纤溶酶在制备治疗祛斑淡斑组合物中的应用的制作方法

本发明涉及酶制剂，尤其涉及一种重组纤溶酶在制备治疗祛斑淡斑组合物中的应用。

背景技术：

1、黑色素细胞是皮肤的重要组成细胞之一，存在于表皮基底层。黑色素细胞具有形成和分泌黑色素的功能。黑色素细胞属于腺细胞，呈树突状突起，并通过树突状突起与角质细胞以1：15-30左右的比例构成一个表皮黑素单位。在表皮黑素单位中，黑色素细胞与角质细胞之间相互影响，尤其是角质细胞，可通过接触并分泌多种细胞因子而对黑色素细胞的形态、结构和功能产生明显影响。

2、黑色素为高分子生物色素，主要有两种醌型聚合物：优黑素(真黑素)和褐黑素组成。优黑素主要由5，6-二羟基吲哚和少量5，6-二羟基吲哚-2羧酸通过不同类型的c-c键构成的聚合物。褐黑素是由不同结构和色素构成的聚合物，呈黄色、红色或胡萝卜色。优黑素与褐黑素转换机制主要与酪氨酸酶的活性有关，高水平的酪氨酸酶活性导致优黑素的产生。皮肤黑色素的形成过程包括黑色素细胞的迁移、黑色素细胞的分裂成熟、黑素小体的形成、黑色素颗粒的转运以及黑色素的排泄等一系列复杂的生理生化过程。黑素小体的形成过程分为五期，简要描述如下：第一期，酪氨酸酶在胞浆的内质网中合成，同时高尔基体空泡增大，合成蛋白质；第二期，称为前黑色素颗粒期；第三期，称黑色素颗粒成熟期，黑色素主要在这一期合成；第四期，成熟的黑色素颗粒堆积在胞浆内，通过细胞的树枝状突起向角质形成细胞转运；第五期，黑素颗粒的释放，转移到角质形成细胞的黑素颗粒随着表皮细胞上行至角质层，并随角质层脱落而排泄。黑色素的形成必须有三种基本物质：酪氨酸为制造黑色素的主要原料；酪氨酸酶是酪氨酸转变为黑色素的主要限速酶，为铜及蛋白质的组合物；酪氨酸在酪氨酸酶的作用下产生黑色素，此种作用为氧化过程，必须与氧结合才能转变为黑色素。目前公认的黑色素形成途径为：酪氨酸→多巴→多巴醌→多巴色素→二羟基吲哚→酮式吲哚→黑色素，形成的黑色素叫优黑素或真黑素，皮肤的色素主要由其组成。

3、皮肤色斑是一种常见的色素沉着性疾病，真正病因复杂，随着年龄的增长，皮肤出现色斑的概率也明显增加，其组织学特点表现为表皮中黑素小体数增加，黑色素细胞活性增强。目前认为内分泌变化为色斑形成的主要原因，并与遗传、肝脏疾病、某些药物、化妆品、紫外线、情绪等因素有关。

4、皮肤内色素增多而使得皮肤上出现褐色、黄褐色、黑色等小斑点，统称为皮肤色斑，在一定意义上包括很多种类的斑，如黄褐斑、咖啡斑、老年斑、炎症性色沉、斑痣等。黄褐斑是一种发生于面部的色素代谢异常、沉着性皮肤病。多见于中年妇女，其主要表现为面部出现大小形状不一的黄褐色或灰黑色斑，常对称分布于额、面、颊、鼻和上唇等部位。不高出皮肤，边界清楚，病程缓慢，长期存在，数年不褪，日晒后往往加重，主要原因是女性内分泌失调，精神压力大，外用化学药物等引起的。咖啡斑是较为常见的色素沉着性疾病，颜色呈现咖啡色、浅褐色、棕褐色，每一片的颜色都很均匀，大小自数毫米至数厘米，边界清晰。咖啡斑的发病机制尚不完全清楚，为多种系统性疾病的一种表现，如神经纤维瘤、多发性黑子综合征等。老年斑是一种老年性皮肤病变，表现为散在的色素斑块，大小不等，扁平或者稍微高于皮肤，表面光滑，呈棕褐色。老年斑中主要是β-淀粉样蛋白，由淀粉样蛋白前体水解断裂的片段聚合而成。炎症性色沉即炎症后色素沉着，是皮肤炎症或损伤后导致的色素增加性疾病，也称获得性皮肤色素沉着或炎症后黑变病。临床上各种炎症性皮肤病、外伤、手术、剥脱术及激光治疗等都可能诱发。炎症性色沉在任何年龄和任何皮肤类型都可以发生，尤其是肤色较深和易晒黑的人群中，临床表现为淡褐色、深棕色、蓝灰色或黑色不等的色素斑，不仅令人容貌受损，还易引起焦虑和抑郁等心理问题，严重影响患者身心健康。斑痣，又称葡萄酒色斑，是常见的先天性血管畸形，其特征是真皮中毛细血管和小静脉畸形扩张。斑痣在人群中的发病率0.3％～0.5％，通常发生在面部、颈部和其他暴露部位，表现为先天性皮肤和(或)黏膜上的红斑。如果不进行治疗，随着年龄增长皮损颜色逐渐增厚加深，最终形成结节样增生。

5、皮肤色斑的颜色主要取决于皮肤细胞中的黑色素的含量与分布。在黑色素合成过程中可受以下相关酶的影响，首先是酪氨酸酶，此酶为含铜的氧化酶，其活性与铜离子含量成比例，内生化过程和物理环境的改变可对酪氨酸酶的活性产生影响。从酪氨酸向多巴转化和多巴向多巴醌转化中，都是由酪氨酸酶催化进行的，酪氨酸酶直接控制黑素合成的起始及速度，决定了后续步骤是否能够进行下去。当各种因素作用于酪氨酸酶使其活性升高时，黑素合成增多，酪氨酸酶活性被抑制时，黑素合成减少。黑素合成过程中除酪氨酸酶起作用外，还有两种酶对黑素的合成也起着不容忽视的作用，即多巴色素互变酶和5,6-二羟基吲哚-2羧酸氧化酶。即酪氨酸在酪氨酸酶、多巴色素互变酶、5,6-二羟基吲哚-2羧酸氧化酶的作用下形成多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等，最后形成黑色素。在内外因素刺激下，会影响黑素形成相关酶的活性，导致黑素过多累积就会形成色斑。

6、色斑的治疗目前主要包括口服、局部注射和物理治疗。口服和局部注射可以口服或注射维生素c、谷胱甘肽、氨甲环酸等。这些药物经口服或者局部注射后在多种色斑患者中取得显著疗效。这些药物可以通过多种途径抑制酪氨酸酶活性，从而干扰黑色素形成，或者将黑色素还原为无色的前体，从而治疗色斑。物理治疗主要包括激光治疗，激光治疗可以通过选择性光热机制，破坏黑色素，治疗各种色素性皮肤病，但有文献报道激光有可能加重黄褐斑和炎症性色沉的发病，因此激光治疗由较大的局限性和个体差异。

7、蛋白酶激活受体(par-2)是一种细胞膜表面受体，属于g蛋白耦联受体超家族成员之一，人par-2分子是由397个氨基酸组成的跨膜蛋白，分子质量50～55kda。par-2由细胞外区(n-末端和胞外区)、跨膜区(7个跨膜螺旋)及细胞内区(胞内区和c-末端)组成。par-2广泛分布于哺乳动物体内，在表皮中par-2只表达于角质形成细胞，不表达于黑色素细胞。可以促使黑色素小体向角质细胞扩散，使肌肤变黑，色素沉积。

8、mc-1r受体全称为黑素皮质素受体1，也称为促黑素细胞激素受体，是肾上腺皮质(mc)受体家族之一。mc受体家族包含了5大类受体，分别是mc-1r、mc-2r、mc-3r、mc-4r、mc-5r，这5类受体在不同组织中有着不同的表达和功能。mc-1r最先在黑色素细胞中被发现，主要在毛囊和皮肤黑色素细胞中表达。mc-1r受体蛋白是g蛋白耦合受体，生物信息学显示其存在7个跨膜结构域，是最小的一个的g蛋白耦合受体，且在机体中有多种效用，如在黑色素细胞和白细胞中对于防止紫外线、抗炎方面有着促进、活化正向调节作用，但最主要的功能是调控皮肤色素沉积，参与皮肤与紫外线的反应，进而影响动物毛色及肤色的形成。

9、重组人截短型纤溶酶是一种组织型纤溶酶，是纤溶系统中的重要一员。纤维蛋白溶解系统简称纤溶系统，是指纤溶酶原在纤溶酶原激活剂作用下转变为纤溶酶，进而由纤溶酶降解纤维蛋白(原)及其他蛋白的系统。纤溶酶是丝氨酸蛋白酶家族的一员，其主要的生物学功能可以降解血栓中的纤维蛋白。重组人截短型纤溶酶为纤溶酶的截短形式，采用毕赤酵母发酵得来，第一种将其用于临床的药物是thrombo genics研发的jetrea(ocriplasmin)，该药物在2012年10月18日经美国食品药品管理局(fda)批准用于治疗症状性玻璃体黄斑粘连(vma)。重组人截短型纤溶酶可致玻璃体和玻璃体视网膜界面的蛋白质组分(如层粘连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白)水解，可溶解造成vma的蛋白基质。

技术实现思路

1、本发明提供了一种重组纤溶酶在制备治疗祛斑淡斑组合物中的应用，为消除或减少色斑提供了一种新的途径。

2、本发明第一方面，提供一种重组纤溶酶在制备治疗祛斑淡斑组合物中的应用，具体为含有重组纤溶酶的组合物在皮肤的色斑部位经无创或微创局部导入后，消除或者淡化色斑。所述组合物具有如下作用中的一种或几种；

3、(1)消除和/或淡化色斑；

4、(2)抑制黑色素细胞增值和/或促进黑色素细胞凋亡；

5、(3)减少蛋白酶激活受体表达和/或活性；

6、(4)减弱和/或抑制黑素小体通过蛋白酶激活受体转运到表皮细胞；

7、(5)抑制表皮细胞吸收黑色素。

8、本发明一具体实施例中，所述重组纤溶酶为重组人截短型纤溶酶，其氨基序列包括如下中的至少一种：

9、(a)seq id no:1所示的序列；或

10、(b)与(a)所示的氨基酸序列经过一个或几个保守氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有相同功能的氨基酸序列。

11、本发明一具体实施例中，重组人截短型纤溶酶经局部导入皮肤祛斑或淡斑的应用中，有效浓度为100-1000ug/ml。

12、本发明一具体实施例中，所述重组人截短型纤溶酶通过无创或微创的方式导入皮肤；优选地，导入方法包括微针、微晶针、水光针、无创注射、超声导入和光电导入；优选微针、微晶针。

13、本发明一具体实施例中，所述重组人截短型纤溶酶通过微针导入皮肤，每周1～2次。

14、本发明一具体实施例中，所述色斑包括黄褐斑、老年斑、咖啡斑、炎症性色沉、斑痣、雀斑。

15、某些实施例中，所述含有重组纤溶酶的组合物还包括具有祛斑淡斑的药物，优选包括维生素c、谷胱甘肽、氨甲环酸。

16、本发明第二方面，提供一种制剂在在制备治疗祛斑淡斑组合物中的应用，所述制剂包括重组人截短型纤溶酶，优选地，所述重组人截短型纤溶酶的氨基序列包括如下中的至少一种：

17、(a)seq id no:1所示的序列；或

18、(b)与(a)所示的氨基酸序列经过一个或几个保守氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有相同功能的氨基酸序列。

19、本发明一具体实施例中，所述制剂可单独使用或与其他药物辅料混合使用；

20、优选地，所述药物辅料包括赋形剂、稀释剂、媒介物、载体中的一种或几种，更优选，甘露醇、柠檬酸；

21、优选地，所述制剂包括溶液、粉针剂；更优选，冻干粉针剂；

22、优选地，所述制剂的ph为3-4；

23、优选地，所述制剂包括25-500ug/ml重组人截短型纤溶酶、4％甘露醇、5.5mmol/l柠檬酸；ph 3.1。

24、本发明第三方面，提供一种祛斑淡斑产品，包括重组人截短型纤溶酶，优选地，所述重组人截短型纤溶酶的氨基序列包括如下中的至少一种：

25、(a)seq id no:1所示的序列；或

26、(b)与(a)所示的氨基酸序列经过一个或几个保守氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有相同功能的氨基酸序列；

27、优选地，还包括具有祛斑淡斑的药物；更优选包括维生素c、谷胱甘肽、氨甲环酸；

28、优选地，所述产品可制成制剂形式，所述制剂包括溶液、粉针剂；更优选，冻干粉针剂；

29、优选地，所述制剂包括25-500ug/ml重组人截短型纤溶酶、4％甘露醇、5.5mmol/l柠檬酸；ph 3.1。

30、本发明具有如下的有益效果：

31、1)本发明首次发现重组人截短型纤溶酶可以抑制hema细胞和b16细胞增殖和促进其凋亡，抑制蛋白酶激活受体(par-2)表达和hacat细胞吸收黑色素。

32、2)本发明的重组人截短型纤溶酶通过经局部导入皮肤起到祛斑淡斑的作用。

33、3)本发明的重组人截短型纤溶酶冻干制剂活性稳定，保存时间长。