一种脱细胞基质/脱蛋白骨粉复合生物墨水及其制备方法和应用

本发明涉及一种组织工程材料，更具体地，涉及一种脱细胞基质/脱蛋白骨粉复合生物墨水及其制备方法和应用。

背景技术：

1、骨缺损是医疗领域中常见的骨科疾病，会严重影响患者的行动能力，从而导致生活质量降低。目前，骨移植仍然是临床治疗骨缺损相关问题的“黄金标准”。然而，骨移植具有相当大的局限性和缺点，包括移植排斥反应、供体功能缺陷以及供体来源少等。因此，基于生物材料的骨组织工程支架已成为治疗骨缺损的有前途的替代方案。

2、目前，基于3d打印的组织工程技术在骨再生领域取得了巨大进展。其中负载细胞的生物打印技术作为一种前沿的组织支架制造方法，为各种组织和器官的生物重建提供了新的手段。生物墨水是生物打印技术的重要组成部分，一款良好的生物墨水不仅需要满足支持生物打印的一般性要求，还需要满足特定损伤组织或器官修复的具体要求，通过模仿缺损部位组织的特征以提供特定的生物功能。

3、细胞外基质(ecm)可提供由蛋白质、多糖等组成的复杂环境，能为细胞提供适宜的环境以及机械、生物物理和生化信号；还具有器官特异性，其详细组成因器官而异。基于以上优点，器官来源的脱细胞基质(decm)已经成为公认的最具仿生性的生物材料。以decm为主要材料的组织工程支架已经应用到各个器官，如：心脏、肝脏、骨、软骨、皮肤的再生和修复中(如中国专利cn106075594a、cn114796616a、cn107213515a)，并取得了相当不错的效果。而在生物打印领域，decm因其固有的低机械稳定性而遭受限制，仅以decm作为成分制备的生物墨水，打印性能并不理想；因此，现有技术中通常采用加入聚己内酯(pcl)、甲基丙烯酸化明胶(gelma)等合成材料的方法以制备复合生物墨水(如中国专利cn113403267a、cn111359017a)，从而帮助decm保持打印结构。但目前的生物墨水仍然与天然骨组织的基质微环境差异较大，因此，需要一种生物墨水在具有良好打印性的同时进一步还原骨组织的天然微结构。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种骨脱细胞基质/脱蛋白骨粉复合生物墨水。

2、本发明的第二个目的在于提供所述复合生物墨水的制备方法。

3、本发明的最后一个目的在于提供所述复合生物墨水的应用。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

5、本发明旨在解决现有decm生物墨水的制备过程中需要加入合成材料以增强脱细胞基质(decm)的低机械稳定性，与还原天然骨组织的基质微环境不充分，难以兼顾打印性与微结构保留的问题，创造性地将decm与脱蛋白骨粉(dbp)复合，制备出了一种完全基于骨组织细胞外基质成分的复合生物墨水，所述墨水与现有技术中常规的以decm为主要成分的复合生物墨水相比，在具有良好打印性的同时，进一步保留了天然骨组织的微结构，部分还原了天然骨组织的微环境，从而显著提高了墨水的成骨活性，促进骨缺损的再生。

6、因此首先，本发明提供一种骨脱细胞基质/脱蛋白骨粉复合生物墨水，包含脱细胞基质与脱蛋白骨粉，以及中性溶液。所述脱细胞基质具体为脱除了细胞成分、无机矿物，保留了天然组织的有机组分的细胞外基质；所述脱蛋白骨粉具体为脱细胞脱蛋白骨粉，即去除了骨组织全部的细胞成分和蛋白质，并保留了了天然骨矿物的活性离子成分、微结构和化学构成的骨磷灰石。所述脱细胞基质、脱蛋白骨粉皆可采用本领域常规技术手段制备得到。所述中性溶液为脱细胞基质与脱蛋白骨粉的溶剂。

7、优选地，所述脱细胞基质为骨组织来源的脱细胞基质，具体为脱除了细胞成分、无机矿物，保留了天然骨组织的有机组分的细胞外基质。

8、优选地，本发明所使用的骨组织来源的脱细胞基质，使用了无洗涤剂的制备策略制备而成，从而更好地保留了脱细胞基质的成分与微结构。

9、进一步地，所述骨组织来源的脱细胞基质的提取方法如下：

10、s1.将新鲜牛骨在生理盐水中加热，取出后解剖表面软组织。

11、s2.解剖去除其皮质骨和软骨部分，将松质骨部分分离。

12、s3.将松质骨置于纯水中搅拌，洗去残余组织。

13、s4.将清洗干净的松质骨冷冻。

14、s5.在低温状态下将松质骨粉碎，获得松质骨颗粒。

15、s6.将松质骨颗粒加入纯水中搅拌，过滤。

16、s7.将抗生素药剂加入细胞等渗溶液中，配置得到含抗生素的细胞等渗溶液。

17、s8.使用s7配制得到的溶液再次清洗松质骨颗粒。

18、s9.将松质骨颗粒用纯水清洗后，冻干。

19、s10.在松质骨颗粒中加入盐酸，搅拌，得松质骨颗粒酸性混合物。

20、s11.将s10所得混合物离心，取沉淀用纯水清洗。

21、s12.用氯仿/甲醇混合液浸泡s11所得固体物，然后用甲醇冲洗，再用纯水冲洗，冻干。

22、s13.将s12所得产物加入含胰蛋白酶和edta的细胞等渗溶液中，搅拌。

23、s14.将s13所得产物用细胞等渗溶液冲洗，然后在低温下用含青霉素/链霉素的细胞等渗溶液搅拌，然后冻干。

24、s15.在盐酸溶液中配置胃蛋白酶溶液，将s14中的产物按加入到胃蛋白酶溶液中，搅拌。

25、s16.配置nacl溶液。

26、s17.将s15所得溶液过滤后等体积缓慢滴加入s16配置的nacl溶液中搅拌，再在低温下搅拌，过滤得到白色蛋白质团块。

27、s18.将s17所得固体用纯水清洗后放入透析袋中透析，得到透明黏稠液体，冻干即得骨组织来源的脱细胞基质(decm)。

28、优选地，步骤s1中，加热操作具体为：在56～60℃的生理盐水中煮3h。

29、优选地，步骤s5中的松质骨颗粒为粒径小于2mm的颗粒。

30、优选地，步骤s7中的含抗生素的细胞等渗溶液为含有0.1％庆大霉素的磷酸盐缓冲液。

31、优选地，步骤s10所述加入盐酸的具体操作为：按照25ml/g的比例在松质骨颗粒中加入0.5m的盐酸。

32、优选地，步骤s12所述氯仿/甲醇混合液中，氯仿：甲醇＝1:1。

33、优选地，步骤s13所述含胰蛋白酶和edta的细胞等渗溶液为：含0.05％胰蛋白酶和0.05％ edta的磷酸盐缓冲液；s12所得产物的加入量为：以10mg/ml的比例加入细胞等渗溶液中。

34、优选地，步骤s14所述含青霉素/链霉素的细胞等渗溶液为含1％青霉素/链霉素的pbs缓冲液。

35、优选地，步骤s15所述胃蛋白酶溶液的浓度为1mg/ml；s14中的产物的加入量为：按照1％(w/v)的浓度加入到胃蛋白酶溶液中。

36、优选地，步骤s16所述nacl溶液的质量浓度为15％(w/v)。

37、优选地，步骤s18所述透析袋的截留分子量(mw)为3500。

38、优选地，本发明所使用的脱蛋白骨粉，采用了无烧结的制备方法制备而成，从而更好地保留骨组织中天然矿物的结晶度，避免了结晶度过高而带来的不降解问题。

39、进一步地，所述脱蛋白骨粉的提取方法如下：

40、s1.将新鲜牛骨在生理盐水中加热，取出后解剖表面软组织。

41、s2.解剖去除其皮质骨和软骨部分，将松质骨部分分离。

42、s3.将松质骨置于纯水中搅拌，洗去残余组织。

43、s4.将清洗干净的松质骨分割成小块，加入纯水搅拌。

44、s5.将清洗干净的小块松质骨在沸水中煮，然后去除水分。

45、s6.去除水分后，快速放入naoh溶液中搅拌。

46、s7.将骨块从naoh溶液中滤出，用纯水冲洗。

47、s8.在沸水中加热后，趁热在乙酸甲酯中浸泡。

48、s9.滤出骨块，烘干水分。

49、s10.用氯仿/甲醇混合液浸泡所得固体物，然后用甲醇冲洗，再用纯水冲洗，冻干。

50、s11.将s10所得的骨块浸入次氯酸钠溶液，超声后搅拌。

51、s12.将骨块滤出后，用纯水清洗，烘干，使其完全干燥。

52、s13.将烘干后的骨块磨碎，得到脱蛋白骨粉(dbp)。

53、优选地，步骤s4中所述的小块为长边小于5mm的小块。

54、优选地，步骤s6中所述的naoh溶液浓度为0.1m。

55、优选地，步骤s9与步骤s12中所述的烘干温度为60℃。

56、优选地，步骤s10所述氯仿/甲醇混合液中，氯仿：甲醇＝1:1。

57、优选地，步骤s11所述次氯酸钠溶液的质量分数为5.5％～6.5％，使用量为30ml/块。

58、优选地，步骤s13中所述磨碎的具体参数为：放入球磨机中，10hz研磨3min。

59、进一步地，所述脱细胞基质在中性溶液中的质量浓度为1％～5％(w/v)，脱蛋白骨粉在中性溶液中的质量浓度为0.1％～20％(w/v)。

60、优选地，所述骨脱细胞基质的质量浓度为1％～3％(w/v)，脱蛋白骨粉的质量浓度为1％～10％(w/v)，进一步为2％～10％(w/v)。

61、更优选地，所述脱细胞基质的质量浓度为3％(w/v)，脱蛋白骨粉的质量浓度为5％(w/v)。

62、进一步地，所述复合生物墨水还包括有活性细胞成分。

63、优选地，所述活性细胞包括间充质干细胞、3t3细胞、软骨细胞、成骨细胞中的任意一种或多种。

64、进一步地，所述复合生物墨水还包括有等渗溶液。

65、其中，所述等渗溶液用于给细胞提供稳定的环境，因此只要是与细胞等渗透压，并提供ph缓冲体系的溶液即可。当无活性细胞混入上述生物墨水时，则无需提供上述等渗溶液。

66、进一步地，所述等渗溶液为磷酸盐缓冲液。

67、优选地，所述等渗溶液的ph＝7.4。

68、进一步地，所述复合生物墨水还可以包括引发剂。所述引发剂主要起到进一步引发脱细胞基质交联的作用，因此只要是可以产生自由基的引发剂都可以使用。

69、进一步地，所述引发剂为天然引发剂或化学引发剂。当复合生物墨水中不含有活性细胞成分时，引发剂可以使用化学引发剂。

70、优选地，所述引发剂为核黄素、姜黄素、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂、钌/过硫酸盐、temod中的任意一种或多种。

71、本发明还提供上述任一复合生物墨水的制备方法，是将各组分在中性溶液中混合，即得。例如：根据需求，将脱细胞基质与脱蛋白骨粉在中性溶液中混合，即得复合生物墨水；或将脱细胞基质、脱蛋白骨粉和活性细胞成分在中性溶液中混合，即得复合生物墨水；或将脱细胞基质、脱蛋白骨粉、活性细胞成分和等渗溶液在中性溶液中混合，即得复合生物墨水；或将脱细胞基质、脱蛋白骨粉和引发剂在中性溶液中混合，即得复合生物墨水。

72、本发明还提供所述复合生物墨水在制备组织工程支架中的应用。

73、本发明最后提供一种骨组织工程支架，为使用上述任一所述复合生物墨水3d打印而成，复合生物墨水在打印过程中进行交联；所述交联方法不做限制，只要能交联一型胶原的所有方法都可以。

74、进一步地，所述交联为化学交联或物理交联。

75、进一步地，所述化学交联可是将生物墨水进行3d打印后，浸泡例如戊二醛、edc-nhs等溶液进行交联。

76、其中，所述引发剂主要起到引发脱细胞基质交联的作用，因此只要是可以产生自由基的引发剂都可以使用。

77、进一步地，所述交联采用光引发剂进行。

78、进一步地，所述引发剂为核黄素、姜黄素、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂、钌/过硫酸盐、temod中的任意一种或多种。

79、优选地，所述引发剂为核黄素。

80、更优选地，所述核黄素的质量浓度为0.01～0.1％(w/v)。

81、进一步地，所述物理交联为热交联。

82、优选地，所述热交联具体为：在35～40℃中对混合溶液进行加热。

83、更优选地，所述加热温度为37℃。

84、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

85、本发明将脱蛋白骨粉(dbp)与脱细胞基质(decm)相结合，制备了一种脱细胞基质/脱蛋白骨粉复合生物墨水。所述复合生物墨水与现有技术中常规的以decm为主要成分并加入合成材料的复合生物墨水相比，在具有良好打印性的同时，还进一步地保留了天然骨组织的微结构，部分还原了天然骨组织的微环境，从而显著提高了墨水的成骨活性，促进了体外骨缺损的再生。