一种用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种用于破坏病毒囊膜结构的ph响应相转变磺酸脂质体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，各种病毒引发的疾病和疫情已经成为公共卫生的重大挑战。针对此问题，目前已经有多种抗病毒药物获得了报道，如公开号为cn115894587a的专利申请公开了一种核苷衍生物的制备及其在抗病毒药物领域中的用途，得到的化合物具有良好的抗病毒活性，适用于开发为新型抗病毒药物。

2、公开号为cn114605555a的专利申请公开了一种抗新型冠状病毒sars-cov-2的双特异性中和抗体及其应用，其为双特异抗体a4-a7或者双特异抗体a7-a4，均包括纳米抗体a4和纳米抗体a7，纳米抗体a4和纳米抗体a7均包括可变区，可变区均具有3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3。

3、虽然疫苗、抗病毒药物和病毒中和抗体在一定程度上控制了疫情，但是，由于病毒的自我进化，各种病毒变种的出现极大地限制了这些治疗方法的效果。

4、抗病毒纳米颗粒因其制备简单、储存条件温和、广谱抗病毒效果优异而备受关注。大多数抗病毒纳米颗粒通过病毒中和机制抑制病毒性疾病。这些纳米颗粒可以通过与病毒结合来阻止病毒与细胞之间的接触。例如，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(hspg)是一种位于细胞表面的高度硫酸化的蛋白多糖，也是许多病毒侵入细胞的第一个结合位点，通过对纳米颗粒进行硫酸盐基或磺酸基的修饰，可以使其实现hspg仿生和广谱中和病毒。然而，由于大多数纳米颗粒不会破坏病毒结构，因此在纳米颗粒从病毒表面脱落后，病毒仍有可能会恢复感染细胞的能力。

5、病毒是一类微小且无完整细胞结构的粒子，按照病毒表面是否存在囊膜，可以将病毒简单地分为囊膜病毒和非囊膜病毒两种类型。相较于非囊膜病毒，能够引起人类疾病的囊膜病毒种类更加多样，如冠状病毒、流感病毒、艾滋病毒、乙肝病毒等。这些囊膜病毒借助膜蛋白实现对易感细胞的粘附，在膜蛋白的帮助下使病毒囊膜和细胞膜或吞噬小体膜融合，并将其基因组释放到细胞内。由于囊膜在病毒入侵过程中起着重要作用，破坏病毒囊膜可能是实现病毒灭活的一种方法。

技术实现思路

1、本发明针对病毒灭活不够理想的问题，提供一种用于破坏病毒囊膜结构的ph响应相转变磺酸脂质体，不仅可以借助硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生策略实现对病毒的初步中和，通过与病毒粒子竞争性结合的方式阻止病毒接触易感细胞，还可以响应溶酶体内或病毒感染引起的炎症组织低ph微环境、破坏病毒囊膜结构进而实现病毒灭活。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、第一方面，一种用于破坏病毒囊膜结构的ph响应相转变磺酸脂质体，由双链磷脂、单链脂质和辅料组成；

4、所述双链磷脂为二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)；所述单链脂质为油酸(oa)和十六烷基磺酸钠(hsa)；所述辅料为胆固醇(cho)。

5、所述dope结构如下，具有圆锥形分子形状。

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7、所述dotap用于调节脂质体响应ph，其结构如下：

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9、所述oa作为分子形状可调的弱电解质脂质，其结构如下：

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11、所述hsa作为可使脂质体具备病毒粘附作用的磺酸脂质，其结构如下：

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13、本发明破坏病毒囊膜结构的机理在于：oa的羧基亲水头部在正常生理组织高ph环境中能够保持离子形态，使其呈现大尺寸亲水头和小尺寸疏水尾的倒圆锥分子形状，与具有小尺寸亲水头和大尺寸疏水尾的圆锥形分子dope相契合，形成脂质双分子层结构。而当脂质体进入低ph环境后，oa的羧基会被质子化，导致其亲水头部尺寸变小，并使分子形状转变为圆锥形。此时脂质体将难以维持原本的双分子层结构，开始向结晶六角相转变。并且，脂质体中hsa提供的磺酸基团使其与病毒囊膜紧密接触，于是脂质体在相转变的过程中会进一步促进脂质体与病毒的膜融合并引起病毒囊膜发生结构性破坏，最终导致病毒的灭活。

14、因此本发明的ph响应相转变磺酸脂质体能在较高ph环境下(ph 7.0以上，如7.4)保持稳定分散的脂质双分子层结构，而在低ph环境中(低于7.0，如ph6.8)则首先会发生聚集，并进一步向六角相转变。

15、优选地，所述(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵的摩尔量为二油酰磷脂酰乙醇胺、油酸和十六烷基磺酸钠总摩尔量的20-30％；其中阳离子脂质dotap的掺入能够通过改变脂质体净电荷的方法来改变脂质体的ph响应值，dotap含量越高，脂质体的负电性就越弱，ph响应值也就越高。优选dotap为dope、oa和hsa总摩尔量的25％。

16、优选地，所述二油酰磷脂酰乙醇胺、油酸和十六烷基磺酸钠的摩尔比为2:1-1.5:1-1.5。其中油酸含量的变化可以调节脂质体响应ph的相转变能力，磺酸比例的变化则与中和病毒能力相关。

17、优选地，所述二油酰磷脂酰乙醇胺、油酸和十六烷基磺酸钠的摩尔比为2:1:1。

18、所述胆固醇为双链磷脂和单链脂质总摩尔量的5-25％。胆固醇能为脂质体的氧化稳定性、物理稳定性等提供良好保障。掺入的胆固醇过少不利于脂质体的稳定，而掺入过多的胆固醇具有引起高脂血症、肿瘤等疾病的不利风险。

19、第二方面，本发明还提供所述的用于破坏病毒囊膜结构的ph响应相转变磺酸脂质体的制备方法，包括步骤：

20、步骤1，将二油酰磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、油酸、十六烷基磺酸钠和胆固醇溶解混合，旋蒸去除溶剂得到脂质薄膜；

21、步骤2，采用水溶液浸泡分散脂质薄膜，经超声破碎得到所述ph响应相转变磺酸脂质体。

22、步骤1中采用溶剂包括二氯甲烷、氯仿、甲醇中一种或多种；优选地，溶剂采用氯仿和甲醇的混合溶剂，如体积比8:2-3的三氯甲烷/甲醇混合溶剂，其中大极性甲醇促进荷电脂质的溶解。

23、步骤2中水溶液包括磷酸盐缓冲液、去离子水、超纯水中一种或多种。

24、优选地，步骤2中超声功率为40-60w，超声时间为1-15min。超声功率低则注入的能量低，无法将脂质体充分破碎；超声功率过高则会释放热量，不利于磷脂或脂质的稳定。

25、所述ph响应相转变磺酸脂质体粒径为30-60nm。大尺寸的脂质体需要更强的结合力才能保证其黏附在病毒表面而不脱落，因此其抗病毒能力会受到一定程度的影响。

26、进一步优选地，所述的用于破坏病毒囊膜结构的ph响应相转变磺酸脂质体的制备方法，包括步骤：

27、步骤1，使用体积比为8:2的三氯甲烷/甲醇混合溶剂溶解原料，在55℃水浴环境中通过旋转蒸发去除溶剂，并采用氮气吹干产物表面溶剂，制得脂质薄膜；

28、步骤2，用磷酸盐缓冲液水化脂质薄膜，并使用超声清洗器将容器壁上粘附的脂质薄膜剥离到水相溶液中，初步形成尺寸分布较宽的粗产物；

29、步骤3，将制得的脂膜溶液用超声波细胞破碎仪充分超声破碎，制备得到脂质体，此时脂质体尺寸分布均匀，形貌规整。

30、第三方面，本发明还提供所述的ph响应相转变磺酸脂质体在制备预防或/和治疗病毒引起疾病药物中的应用。

31、本发明基于硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生策略，通过改变脂质分子形状的方法实现对脂质体相转变的调控，构建了一种用于破坏病毒囊膜结构的ph响应相转变磺酸脂质体。在病毒感染初期接近于正常生理环境的高ph环境中，这一脂质体能够粘附病毒，通过包裹病毒的方式阻隔病毒与细胞的接触，实现对病毒的中和，此时病毒与脂质体形成的大块团聚物能够被细胞内吞，脂质体能够在胞内溶酶体酸性环境中发生相转变灭活病毒。而在病毒感染后期形成的炎症低ph环境中，脂质体粘附病毒后直接在胞外发生相转变破坏病毒囊膜，导致病毒基因组的泄露，实现病毒灭活功能。

32、此外，由于通过与硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合实现对细胞入侵的病毒种类繁多，该脂质体还具有广谱抗病毒的能力。

33、优选地，所述病毒包括严重急性呼吸综合征病毒、中东呼吸综合征病毒、猪德尔塔冠状病毒、人冠状病毒oc43、人冠状病毒nl63、新型冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、拉沙热病毒、单纯孢疹病毒、艾滋病毒、人乳头瘤病毒中的一种或多种。

34、将本发明的ph响应相转变磺酸脂质体与病毒混合孵育，降低病毒感染细胞的能力。特别是体内病毒感染严重时，体内微环境ph下降，本发明的脂质体能够聚集和进一步的相转变，进而破坏病毒囊膜结构实现病毒灭活，效果更强。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、(1)本发明构建的用于破坏病毒囊膜结构的ph响应相转变磺酸脂质体成分及配方明确，制备方法简单，尺寸合适，分布均匀，提高了硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生纳米粒子成药性的同时，还有可能能够实现大批量生产。

37、(2)本发明构建的脂质体能够在病毒感染初期的高ph环境中通过黏附、包裹病毒的形式中和病毒，利用自身组成及形貌与病毒包膜相似的特点与其发生膜融合，并以被细胞内吞的方式在溶酶体中发生相转变实现胞内灭活病毒。而在病毒感染后期引起的炎症组织低ph微环境中，脂质体在黏附病毒后能够直接在胞外通过相转变来破坏病毒囊膜以实现病毒灭活。故无论是在病毒感染初期还是后期，该脂质体都能实现病毒的有效杀灭。

38、(3)由于硫酸乙酰肝素蛋白多糖为多种病毒侵入细胞的共同结合位点，该仿硫酸乙酰肝素蛋白多糖结构的磺酸脂质体能够表现出对多种病毒的抑制效果，具有广谱抗病毒能力。

39、(4)相较于传统硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生纳米粒子病毒灭活能力较弱的问题，该脂质体能够通过相转变策略破坏病毒囊膜，引起病毒基因组的泄露，对病毒实现高效灭活。