一种富含多种生长因子的纤维蛋白及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种富含多种生长因子的纤维蛋白及其制备方法与应用。

背景技术：

1、纤维蛋白(原)(英语：fibrinogen，又称为血纤维蛋白原)是由肝细胞合成和分泌的一种糖蛋白(α2β2γ2)；纤维蛋白(原)是血液中存在的具有调节凝血、炎症及组织修复功能的多效蛋白。纤维蛋白(原)是参与凝血和止血过程中的重要蛋白；也是促进组织血运重建，伤口愈合和组织修复作用的重要蛋白。第二次世界大战后血纤维蛋白原和凝血酶被广泛使用，后来受到了禁止，因为它会传播肝炎。自国际机构开发出能消除肝炎的危险以后，血纤蛋白密封剂被广泛地在临床上使用，不仅用于出血控制，而且用于各种手术场合的手术室辅助物；纤维蛋白封闭剂是模拟血凝的最后阶段反应由血浆蛋白成份组成的一种复合制剂，它可以通过凝血酶从纤维蛋白原释放纤维蛋白肽形成具有一定强度的纤维蛋白凝块，应用于临床可起到封闭创面，止血和伤口愈合的作用；工业化制造的纤维蛋白封闭剂己在许多外科手术中显示出特有的价值，迄今还未发现明显的毒性和不良反应。采用人血作为纤维蛋白封闭剂制备原料有传播hbv、hiv等病毒的潜在危险，而且采用人血为原料易导致产品成本高，价格昂贵，在发展中国家广泛应用受到一定的限制。因此，用动物血源替代人血成为了较佳的选择。

2、目前用动物血源的纤维蛋白(原)、凝血酶制成的纤维蛋白封闭剂己在外科手术中广泛应用，而用动物血源制备纤维蛋白用于制备化妆品或医美产品还未见报导。

技术实现思路

1、纤维蛋白除了和凝血酶组合用于止血以外，纤维蛋白是具有促进组织血运重建，伤口愈合和组织修复作用的重要蛋白。因此，纤维蛋白应还可用于化妆品或医美产品。血液中富血小板纤维蛋白内的主要生长因子和细胞因子主要有：生长因子：转化生长因子β1(tgf-β1)、血小板释放生长因子(pdgfs)、胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactors，igfs)、血管生成因子[血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，vegf)；促炎性细胞因子：白介素-1β(interleukin-1β,il-1β)、白介素-4(interleukin 4，il-4)、白介素-6(interleukin-6，il-6)；肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factorα，tnf-α)等。本发明在提取纤维蛋白的同时，试图尽可能保留这些生长因子。本发明首次通过对动物纤维蛋白的开发研究，以最佳的组合配方和制备工艺，提供一种富含多种生长因子的纤维蛋白用于制备化妆品或医美产品。本发明制备的动物纤维蛋白不仅制备工艺简单、而且富含多种生长因子，既降低了成本、又避免了人类血源性疾病的传播机会，既丰富了用于制备化妆品或医美产品的原料、又丰富了化妆品或医美产品的美容功效。

2、基于此，本发明的首要目的在于提供一种富含多种生长因子的纤维蛋白的制备方法。该制备方法以动物血为主原料，既降低了成本，又减少了血源性疾病的传播机会，具有高效、安全、稳定和富含多种生长因子的优点。

3、本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的富含多种生长因子的纤维蛋白。

4、本发明的再一目的在于提供上述富含多种生长因子的纤维蛋白在制备高效美肤功效化妆品或医美产品中的应用。

5、本发明的目的通过下述技术方案实现：

6、一种富含多种生长因子的纤维蛋白的制备方法，包括如下步骤：

7、(1)将新鲜动物血液和抗凝剂溶液混合均匀；接着将含有抗凝剂的血液于0～10℃的环境中静置，待血浆与红细胞分层后，分取上层血浆，下层血细胞另用；

8、(2)取步骤(1)分离得到的血浆于2℃～10℃离心，取上清液，过滤，得到精制血浆；

9、(3)将步骤(2)得到的精制血浆与甘氨酸混合均匀，得到混合血浆a；将混合血浆a的温度调节至0～5℃后与醋酸钠混合均匀，得到混合血浆b；对混合血浆b进行离心，收集沉淀；

10、(4)将步骤(3)得到的沉淀搅碎，加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的缓冲溶液，搅拌至完全溶解，过滤，得到溶解液，测量溶解液的蛋白含量和溶解液体积；然后往溶解液中加入氨基酸或氨基酸类似物，搅拌至完全溶解，过滤，收集滤液；

11、(5)在步骤(4)得到的滤液中加入由枸橼酸钠与三羟甲基氨基甲烷制成的缓冲溶液，调节ph值至5.0～9.0，得到混合液a；再加入聚山梨酯-80量与磷酸三丁酯，搅拌均匀，25±2℃保温搅拌，得到病毒灭活液；

12、(6)将步骤(5)得到的病毒灭活液和甘氨酸混合均匀，得到混合液b；将混合液b的温度调节至0～5℃，再与醋酸钠混合均匀，得到混合液c；将混合液c离心，收集沉淀；

13、(7)用三羟甲基氨基甲烷溶液洗涤步骤(6)得到的沉淀，收集沉淀，得到精制纤维蛋白。

14、步骤(1)中所述的新鲜动物血液优选为新鲜猪血、新鲜牛血、新鲜羊血、新鲜马血等较大动物的新鲜血液，更优选为新鲜猪血。

15、步骤(1)中所述的抗凝剂溶液的组成优选如下：枸橼酸钠0.38％(w/v)、氯化钠0.09％(w/v)，溶剂为水；w/v表示g/ml。

16、步骤(1)中所述的抗凝剂溶液的用量优选按新鲜动物血液：抗凝剂溶液＝体积比8～10：1的配比计算；更优选按新鲜动物血液：抗凝剂溶液＝体积比8～9：1的配比计算。

17、步骤(1)中所述的环境的温度优选为5～8℃。

18、步骤(1)中所述的静置的时间优选为8～10h。

19、步骤(1)中所述的分取上层血浆的方法优选为虹吸法。

20、步骤(2)中所述的离心的条件优选为于4000～6000rpm的转速离心40～60min；更优选为于4500～5000rpm的转速离心40～50min。

21、步骤(2)中所述的过滤优选为使用0.45μm的滤器过滤。

22、步骤(3)中所述的甘氨酸的用量优选按甘氨酸：精制血浆＝1.0～7.0g：1l的配比计算；更优选按甘氨酸：精制血浆＝3.5～4.0g：1l的配比计算；最优选按甘氨酸：精制血浆＝3.7～3.8g：1l的配比计算。

23、步骤(3)中所述的温度优选为3～4℃。

24、步骤(3)中所述的醋酸钠的用量优选按醋酸钠：精制血浆＝60g～200g：1l的配比计算；更优选按醋酸钠：精制血浆＝132g～140g:1l的配比计算；最优选按醋酸钠：精制血浆＝136g～137g:1l的配比计算。

25、步骤(3)中所述的与醋酸钠混合均匀中的混合均匀优选为通过搅拌20～40min实现。

26、所述的搅拌的速度优选为400～480rpm；更优选为450rpm。

27、步骤(3)中所述的离心的条件优选为于2℃～10℃的温度、3000～5000rpm的转速离心30～50min；更优选为于2℃～10℃的温度、4000rpm的转速离心30～40min。

28、步骤(4)中所述的缓冲溶液的组成优选如下：枸橼酸钠16g/l、三羟甲基氨基甲烷10g/l。

29、步骤(4)中所述的缓冲溶液的ph值优选为9.0～11.0，更优选为10.0±0.2。

30、步骤(4)中所述的缓冲液的用量优选按缓冲液：沉淀＝9～12ml：1g配比计算。

31、步骤(4)中所述的氨基酸优选为组氨酸和甘氨酸中的至少一种。

32、步骤(4)中所述的氨基酸类似物优选为6-氨基己酸。

33、步骤(4)中所述的氨基酸或氨基酸类似物的用量优选按氨基酸或氨基酸类似物：总蛋白量＝质量比0.1～1.2：1配比计算；更优选按氨基酸或氨基酸类似物：总蛋白量＝质量比0.2～0.3：1配比计算；最优选按氨基酸或氨基酸类似物：总蛋白量＝质量比0.25～0.26：1配比计算。

34、步骤(4)中所述的过滤优选使用0.25～1.0μm的滤芯过滤。

35、步骤(5)中所述的缓冲溶液的组成优选如下：枸橼酸钠16g/l、三羟甲基氨基甲烷10g/l。

36、步骤(5)中所述的缓冲溶液的ph值优选为9.0～11.0，更优选为10.0±0.2。

37、步骤(5)中所述的缓冲溶液的用量是依据其调节得到的混合液a的ph值至需求而定。

38、步骤(5)中所述的混合液a的ph值优选为7.0～7.5；更优选为7.2～7.3。

39、步骤(5)中所述的聚山梨酯-80的用量优选按聚山梨酯-80：滤液＝5.0～15.0g：1l配比计算。

40、步骤(5)中所述的磷酸三丁酯的用量优选按磷酸三丁酯：滤液＝1.0～5.0g：1l配比计算。

41、步骤(5)中所述的搅拌的时间优选为4～8小时；更优选为6～8小时。

42、步骤(6)中所述的甘氨酸的用量优选按甘氨酸：病毒灭活液＝1.0g～7.0g：1l配比计算。

43、步骤(6)中所述的醋酸钠的用量优选按60g～200g：1l配比计算。

44、步骤(6)中所述的与醋酸钠混合均匀中的的混合均匀优选为通过搅拌20～40min实现。

45、步骤(6)中所述的离心的条件优选为于2℃～10℃的温度、4000～6000rpm的转速离心；更优选为于6℃～8℃的温度、4000～5000rpm的转速离心。

46、步骤(7)中所述的三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度优选为0.1％(w/v)，其ph值为使用盐酸调节。

47、所述的三羟甲基氨基甲烷溶液的ph值优选为ph＝3.0～7.0，更优选为ph＝5.0±0.2。

48、步骤(7)中所述的洗涤的次数优选为1～5次；更优选2～3次。

49、步骤(7)中所述的精制纤维蛋白可用作制备纤维蛋白胶封闭剂的原料，生化原料，或用作其它纤维蛋白的替代品。

50、一种富含多种生长因子的纤维蛋白，通过上述制备方法得到。

51、上述富含多种生长因子的纤维蛋白的应用，可用做纤维蛋白胶封闭剂的原料、生化原料或用作其它纤维蛋白的替代品。

52、上述富含多种生长因子的纤维蛋白在制备高效美肤功效化妆品或医美产品中的应用。

53、一种纤维蛋白主体美肤冻干粉，由上述富含生长因子的纤维蛋白和辅料组成。

54、所述的辅料优选为烟酰胺、酰本胺、尼克酰胺、尿囊素、透明质酸钠、熊果苷、甘露糖醇、海藻糖、蔗糖、透明质酸、组氨酸、精氨酸、肌肽、聚山梨酯、磷酸及其盐、柠檬酸及其盐、醋酸及其盐、枸椽酸及其盐、盐酸及其盐、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种组成。

55、上述纤维蛋白主体美肤冻干粉的制备方法，包括如下步骤：

56、(a)将上述富含生长因子的纤维蛋白与辅料混合后，加水制成纤维蛋白主体美肤液；

57、(b)步骤(a)中的纤维蛋白主体美肤液经冷冻干燥制成纤维蛋白主体美肤冻干粉。

58、步骤(b)中所述的冷冻干燥优选为将配制好的纤维蛋白主体美肤液迅速冷却至-50℃～-40℃，持续冷冻干燥l～3小时，升到-25℃～-15℃，持续冷冻干燥10～20小时，再缓慢升温到0℃，持续冷冻干燥4～8小时，再升到室温25℃，真空压盖或充氮压盖。

59、一种纤维蛋白主体美肤液，是纤维蛋白主体美肤冻干粉冻干前的溶液，优选由如下成分组成：富含生长因子的纤维蛋白3.0～3.1％、烟酰胺0～0.3％、酰本胺0～0.2％、尿囊素0～0.15％、肌肽0～0.2％、尼克酰胺0～0.2％、神经酰胺0.05～0.15％、海藻糖0.5～0.6％、甘露糖醇1.2～1.3％、组氨酸0.7～0.9％、精氨酸0.2～0.4％、氯化钠0.15～0.25％、枸橼酸钠0.15～0.25％、聚山梨酯-80 0.01～0.02％、水余量；更优选由如下成分组成：富含生长因子的纤维蛋白3.0～3.1％、烟酰胺0～0.3％、酰本胺0～0.2％、尿囊素0～0.15％、肌肽0～0.2％、尼克酰胺0～0.2％、神经酰胺0.1％、海藻糖0.5～0.6％、甘露糖醇1.2～1.3％、组氨酸0.7～0.9％、精氨酸0.2～0.4％、氯化钠0.2％、枸橼酸钠0.2％、聚山梨酯-80 0.01～0.02％、水余量。

60、一种与纤维蛋白主体美肤冻干粉配合使用的冻干粉溶解液，由醋酸钠、氯化钠、海藻糖、透明质酸钠、增溶剂和水组成；优选由以下按质量百分比计的成分组成：醋酸钠0.40～0.45％、氯化钠0.6～0.7％、海藻糖0.5～0.6％、透明质酸钠0.5～0.6％、增溶剂5.0～5.2％、水余量；更优选由以下按质量百分比计的成分组成：醋酸钠0.41％、氯化钠0.64％、海藻糖0.5～0.6％、透明质酸钠0.5～0.6％、增溶剂5.0～5.2％、水余量。

61、所述的增溶剂优选为甘油、双甘油和1,3-丙二醇中的至少一种。

62、上述冻干粉溶解液的制备方法，包括如下步骤：

63、(1)称取醋酸钠、氯化钠、海藻糖、透明质酸钠和增溶剂，加入到水中，搅拌至完全溶解；

64、(2)用醋酸调ph值至3.5～8.5，搅拌均匀，在无菌条件下，用0.45μm滤膜过滤；

65、(3)灌装，轧盖，灭茵，检验，包装，得到与纤维蛋白主体美肤冻干粉配合使用的冻干粉溶解液。

66、所述的与纤维蛋白主体美肤冻干粉配合使用的冻干粉溶解液，是按与纤维蛋白主体美肤冻干粉冻干前的体积的比例不小于1配置，从而能充分溶解纤维蛋白主体美肤冻干粉。

67、本发明的实施具有如下有益效果：

68、1、本发明首次通过对动物纤维蛋白的开发研究，以最佳的制备工艺，发明了一种富含多种生长因子的纤维蛋白用于制备化妆品或医美产品。

69、2、本发明从动物血液中制备富含多种生长因子的纤维蛋白，制备工艺相对简单，制备的纤维蛋白富含多种天然生长因子，美肤效果强，生产也易实现自动化控制。

70、3、本发明利用动物血作为主原料进行纤维蛋白的提取，由于较大哺乳动物的基因序列同人的基因序列极为相似，而携带人类的传染性疾病传播风险极小，既降低了成本，又避免了人类血源性疾病的传播机会。

71、4、本发明首次以动物纤维蛋白为主要原料，以最佳组合配方和制备工艺，制备纤维蛋白主体美肤冻干粉和纤维蛋白主体美肤冻干粉溶解液，二部分共同组成化妆品或医美产品。

72、5、本发明通过纤维蛋白主体美肤冻干粉的制备，让纤维蛋白处于干燥直空环境，防止了纤维蛋白在常温下保存和运输过程中变性失活。本发明生产安全环保，操作过程中对人员和周围环境不产生危害，符合国家的环保要求。