二甲双胍接枝聚己内酯纳米支架的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物医药，涉及一种二甲双胍接枝聚己内酯纳米支架的制备方法及其在制备预防或治疗硬膜外纤维化的药物中的应用，还提供了一种预防或治疗硬膜外纤维化的药物组合物。

背景技术：

1、器官纤维化是一个复杂的过程，可导致严重的临床状况，如肝硬化、肾纤维化、心脏纤维化和硬膜外纤维化(epidural fibrosis,ef)，严重损害器官功能，甚至可能危及生命。尽管进行了大量研究，但纤维化的潜在机制仍不完全清楚。现有研究显示，ef以瘢痕组织形成为特征，主要源于成纤维细胞过度增殖，并与组织细胞密度降低和细胞外基质成分增加相关，如胶原蛋白1(collagen 1,col1)、纤黏连蛋白和硫酸皮肤素。最近的研究强调了起源于背根神经节(dorsal root ganglion,drg)的感觉神经网络参与了纤维化。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,cgrp)阳性神经在粘连中普遍存在，它代表着初级感觉神经，在神经元去极化后，cgrp从神经末梢释放并介导各种生物学功能，这表明感觉神经在纤维化进程中发挥作用。此外，支配肌肉的感觉轴突有助于维持肌肉的完整性，从而减少纤维化和胶原化。cgrp已被证明可以减轻心肌纤维化，因此我们有理由假设感觉神经可能利用cgrp发挥潜在的抗纤维化作用。迄今为止，还没有研究证实感觉神经在调节ef进展中的作用。

2、椎板切除术是一种常见的脊柱手术，目的是缓解椎间盘突出、椎管狭窄等各种情况引起的脊髓和神经根压力。然而，大约8-40％的患者在接受这一手术后会出现失败的背部手术综合征，这主要归因于硬膜外纤维化。背部手术综合征主要表现为ef压迫硬脊膜或神经根引起的持续性腰痛或腿痛。约4-9％的患者需要翻修手术，即再次暴露相同的手术区域。由于缺乏骨性结构作为标志物，这些再次手术面临更多的技术挑战，并且由于纤维粘连增加了硬脊膜撕裂和神经根病变的可能性，因此风险更高。尽管外科技术和设备取得了显著进步，但有症状的纤维化再次手术往往导致不良临床结局。目前，外科医生无法预测哪些患者会出现症状性ef，一旦发生，也没有有效的治疗方法。为避免ef，应实施预防措施。然而，由于对其潜在机制的了解有限，目前仍缺乏有效的治疗方法。我们研究首次发现感觉神经来源的cgrp可抑制ef的进展。这一发现表明，感觉神经可能成为预防ef的新靶点，但针对这一过程的具体策略尚未开发。

3、目前，人们已经采用了许多策略来预防ef和减少硬脊膜粘连，包括局部或全身给药和基于生物材料的物理屏障。近年来，聚己内酯(polycaprolactone,pcl)和聚乳酸(polylactide,pla)等纳米纤维聚合物材料因其优异的可打印性、可调节的力学性能和生物可降解性在组织工程中得到了广泛的应用。特别是pcl，由于其高孔隙率和大表面积体积比，确保了药物的长期稳定释放。此外，pcl降解可根据所载药物的使用寿命进行定制，从而消除移除装置的需要。这些特性使pcl成为物理屏障和药物递送系统的理想选择。

4、考虑到与新药开发相关的巨大成本，重新利用现有药物是一种可行的替代方案。初步验证发现，二甲双胍(metformin,met)在mrna和蛋白水平均显著促进drg细胞分泌cgrp。met是一种广泛用于治疗与肥胖相关的2型糖尿病的药物，在神经性、炎性和内脏疼痛中也显示出镇痛作用。其安全性良好，新的应用不断涌现。但如果met直接在局部使用，药物作用时间短会明显削弱其治疗效果，因此需要采用合适的局部给药方式，实现局部连续给药，充分发挥met的作用。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题进行，提供了一种二甲双胍接枝的pcl纳米支架(metg-pcln)，通过采用共聚接枝技术构建该支架，使其具有缓释met、物理屏障性能、生物相容性和生物可降解性。该创新方法靶向感觉神经调节的纤维生成，可解决ef进展。

2、本发明的技术方案概述如下：聚己内酯纳米纤维膜在弱碱性tri-hcl缓冲液中表面包覆一层聚多巴胺后，同样在弱碱性tri-hcl缓冲液中与二甲双胍共混并37℃摇床孵育，产物经洗涤冻干后得到二甲双胍接枝的聚己内酯纳米支架。

3、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

4、本发明第一方面，提供了一种二甲双胍接枝聚己内酯纳米支架的制备方法，包括如下步骤：

5、a、聚己内酯纳米纤维膜制备

6、将终浓度为10％～20％的聚己内酯溶液在-4kv和+12kv的电压条件下静电纺丝形成聚己内酯纳米纤维膜。优选的，聚己内酯溶液的终浓度为18％，纺丝喷头与纳米纤维膜接收板之间的间距为15cm，纺丝液的出液速度为0.05～0.3mm/min，优选0.15mm/min。

7、b、聚多巴胺包覆

8、将聚己内酯纳米纤维膜置于10mm、ph＝8.5的tri-hcl缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐，然后在37℃振荡器中以120rpm/min孵育4-24h(优选15h)，在pcl纳米纤维表面覆盖一层聚多巴胺；

9、其中，聚己内酯纳米纤维膜的形状为矩形或方形；聚己内酯纳米纤维膜与多巴胺盐酸盐之间的质量比为2.5:1，聚己内酯纳米纤维膜与tri-hcl缓冲液的质量体积比为5:1。

10、c、二甲双胍接枝

11、包被聚多巴胺的聚己内酯纳米纤维膜的pcl用去离子水洗涤3次后，然后加入10mm、ph＝0.5的tri-hcl缓冲液和二甲双胍，在37℃的摇床中以100rpm/min孵育12-48h(优选24h)，所得产物用去离子水3次洗涤后，冻干得到二甲双胍接枝的聚己内酯纳米支架。

12、具体的，tri-hcl缓冲液的体积为步骤b中tri-hcl缓冲液的体积的60％，二甲双胍的质量为包覆前聚己内酯纳米纤维膜质量的4％；

13、二甲双胍接枝的聚己内酯纳米支架的冻干条件为：冷阱温度-50℃，真空度低于0.34mbar。

14、本发明第二方面，提供了采用上述方法制备得到的二甲双胍接枝聚己内酯纳米支架。

15、本发明第三方面，提供了二甲双胍接枝聚己内酯纳米支架的应用，具体是在制备预防或治疗硬膜外纤维化药物中的应用。

16、具体的，该预防或治疗硬膜外纤维化的药物为促进感觉神经分泌降钙素基因相关肽的药物。

17、本发明第四方面，提供了一种预防或治疗硬膜外纤维化的药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的辅料，其中，所述活性组分为上述所述的二甲双胍接枝聚己内酯纳米支架。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

19、制备方面，本发明所采用的原料聚己内酯、多巴胺盐酸盐以及二甲双胍均属于医疗领域常见的材料，可通过购买途径获取；同时制备工艺条件温和，简单易掌握，有助于工业化推广应用。实验结果显示，二甲双胍接枝后，对于pcl纤维的平均纤维直径、力学性能、亲水性能无影响，但可有效延迟met的释放，到用药后第6周才释放80％。

20、技术效果方面，本发明开发的metg-pcln，可使met持续释放到感觉神经元和ef中的纤维化微环境中。体外细胞实验及动物模型实验均证明了metg-pcln通过精细调节感觉神经cgrp释放来显著减缓ef的发展。

21、因此，本发明针对ef的潜在临床治疗提供了一个有前景的概念验证，并显示出相当大的转化价值。