一种改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、二型糖尿病(type2diabetesmilluts，t2dm)是一种常见的慢性代谢性疾病，其主要特征为胰岛素抵抗、胰岛素相对缺乏所造成的高血糖。长期的胰岛素抵抗和炎症可导致β细胞应激和代偿，持续的高血糖和高血脂会导致β细胞糖脂毒性和β细胞衰竭，进而导致广泛的健康问题，累及血管、肾、眼、足等多个器官慢性损伤，心血管疾病、肾脏疾病和视力下降等并发症不可避免地发生在体内。

2、t2dm目前的主要治疗方法为合理饮食、适度运动及口服降糖药物，常用的降糖药物主要通过增强外周组织的胰岛素敏感性(如噻唑烷二酮类)、抑制肝脏糖异生(如双胍类)、以葡萄糖依赖方式增加胰岛素分泌(如胰高血糖素样)，仅针对减轻症状，即通过增强剩余β细胞的胰岛素分泌和改善t2dm中的胰岛素敏感性，以及通过严格控制的外源性胰岛素疗法使血糖正常化。这并不能起到改善胰岛β细胞损伤、降低慢性炎症来达到保护胰岛的目的。

3、为了保护胰岛，目前临床上选择直接输注干细胞，虽然来源广泛、成本低廉、对2型糖尿病有一定治疗作用，但是单纯的干细胞移植目前还存在未分化干细胞易形成肿瘤、无法特定停留在目标组织以及存活率低的问题。因此传统的干细胞输注难以满足日常和临床需求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料的制备方法及其应用。本发明提供的方法制得的改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料能够免受患者免疫系统的影响，干细胞存活率高，可以定点停留生长，避免未分化干细胞形成肿瘤的风险发生。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料的制备方法，包括以下步骤：

4、将壳聚糖双胍盐酸盐溶液、壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液和鱼皮胶原蛋白溶液混合，调整所得混合溶液的ph值至7.0～7.3，得到改性壳聚糖基水凝胶前液；

5、向所述改性壳聚糖基水凝胶前液中加入脐带间充质干细胞使所述脐带间充质干细胞处于悬浮状态，进行成胶，得到改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料；

6、所述壳聚糖、壳聚糖双胍盐酸盐和鱼皮胶原蛋白的质量比为1～8:6～15:0.2～1；

7、所述β-甘油磷酸钠和壳聚糖双胍盐酸盐的质量比为1.1～1.8:0.08～0.13；所述脐带间充质干细胞的数量与改性壳聚糖基水凝胶前液的体积比为5×105～1.5×106个：1ml。

8、优选地，所述壳聚糖双胍盐酸盐溶液的质量体积浓度为1.5～2％，所述壳聚糖双胍盐酸盐溶液由壳聚糖双胍盐酸盐溶于水得到；

9、所述壳聚糖溶液的质量体积浓度为1.5～2％，所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶于醋酸得到；

10、所述β-甘油磷酸钠溶液的质量体积浓度为48～50％，所述β-甘油磷酸钠溶液由β-甘油磷酸钠溶于水得到；

11、所述鱼皮胶原蛋白溶液的质量体积浓度为0.5～1％，所述鱼皮胶原蛋白溶液由鱼皮胶原蛋白溶于水得到。

12、优选地，所述壳聚糖双胍盐酸盐的制备方法包括以下步骤：

13、将壳聚糖溶于盐酸中，进行质子化反应，得到壳聚糖盐酸盐溶液；

14、将所述壳聚糖盐酸盐溶液与胍基化试剂混合，进行加成反应，得到壳聚糖双胍盐酸盐。

15、优选地，所述壳聚糖与盐酸的固液比为2～6g:70～120ml；所述胍基化试剂与壳聚糖盐酸盐溶液的固液比为：1～5g:120～170ml。

16、优选地，所述胍基化试剂为异硫脲、异脲、异硫氰酸酯和双氰胺中的一种或几种。

17、优选地，制备所述壳聚糖双胍盐酸盐所用壳聚糖为95％脱乙酰度的壳聚糖；

18、所述盐酸的浓度为0.2～0.3mol/l。

19、优选地，所述加成反应的温度为80～110℃，时间为0.5～2h；

20、所述质子化反应的温度为40～60℃，时间为0.5～2h。

21、优选地，所述成胶的温度为35～45℃，保温时间为3～10min。

22、本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料，所述改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料为多孔网状结构；所述改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料中脐带间充质干细胞的浓度为5×105～1.5×106个/ml。

23、本发明还提供了上述技术方案所述的改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料在制备减轻胰岛炎症、促进胰岛β细胞增殖药物中的应用。

24、本发明提供了一种改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖双胍盐酸盐溶液、壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液和鱼皮胶原蛋白溶液混合，调整所得混合溶液的ph值至7.0～7.3，得到改性壳聚糖基水凝胶前液；向所述改性壳聚糖基水凝胶前液中加入脐带间充质干细胞使所述脐带间充质干细胞处于悬浮状态，进行成胶，得到改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料；所述壳聚糖、壳聚糖双胍盐酸盐和鱼皮胶原蛋白的质量比为1～8:6～15:0.2～1；所述β-甘油磷酸钠和壳聚糖双胍盐酸盐的质量比为1.1～1.8:0.08～0.13；所述脐带间充质干细胞的数量与改性壳聚糖基水凝胶前液的体积比为5×105～1.5×106个:1ml。本发明使用壳聚糖双胍盐酸盐可降低胰岛素抵抗作用，利用壳聚糖中的胺基与鱼胶原蛋白中的羧基、与β-甘油磷酸钠磷酸根之间产生静电相互作用力，将胶原蛋白分子穿插在成胶网络中，发挥其生物学功能，利用壳聚糖双胍盐酸盐(为壳聚糖改性后得到)，增加胺基数量，进一步增强静电相互作用力，并提高了水凝胶材料的亲水性，利于细胞生长；壳聚糖的羟基、胺基使壳聚糖分子间以及与水分子形成氢键，氢键的强度在壳聚糖改性后增强，同时鱼胶原蛋白羧基端、β-甘油磷酸钠的甘油部分与水分子之间也会形成氢键；壳聚糖分子链上疏水基团(-ch2)之间会发生疏水相互作用，在静电相互作用、氢键作用、疏水相互作用三种物理作用力交联，得到的水凝胶内部均呈多孔网状结构且孔径大小不均一，内部结构更加致密，且具有流变性，实现细胞正常的营养吸收和信息交流，利于细胞的黏附以及细胞间的相互作用，使其具有良好的生物相容性；同时得到的改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料在体外是可流动的溶胶状态，在37℃的条件下就会固化形成凝胶，通过定点注射，让溶胶在体内特定部位形成凝胶，实现定点停留，利用改性壳聚糖基水凝胶包裹干细胞，避免干细胞过度生长，进而避免了致癌性。

25、溶胀率测定结果表明改性壳聚糖基水凝胶保水性能良好；体外降解测定结果表明改性壳聚糖基水凝胶生物降解性能良好；流变学特征表明其储能模量＞损耗模量，呈固态弹性特征；细胞黏附实验和活死细胞染色实验结果表明改性壳聚糖基水凝胶对小鼠脐带间充质干细胞具有良好的促进黏附和正常存活分裂效果；动物实验结果表明改性壳聚糖基水凝胶包覆干细胞组织工程材料在糖尿病小鼠模型中具有较好的促进胰岛β细胞增殖和降低胰岛炎症潜力。