面向空间组织和器官模型构建的生物墨水、悬浮介质及悬浮3D打印方法

本发明涉及一种面向空间组织和器官模型构建的生物墨水、悬浮介质及悬浮3d打印方法，属于组织工程和生物制造。

背景技术：

1、随着航天技术的发展与推广，各国竞相在太空微重力环境中开展空间生物学研究。其中，微重力条件下的组织和器官相关研究是空间生物学的热点方向。现有的太空组织和器官研究大多是在模拟微重力装置和2d培养体系中进行，既不能真实模拟空间复杂微重力环境，也不能真实体现组织和器官的3d复杂结构，从而难以反映空间环境对组织和器官的影响，限制了太空环境中组织和器官研究的进展。太空环境一般指在人造卫星或空间站所提供的环境。

2、生物3d打印技术能够将含细胞的生物墨水按照预定义路径，层层堆积形成具有复杂结构的3d组织与器官，是新兴的组织构建技术手段。在太空环境中开展生物3d打印，可为太空组织和器官研究提供更加仿生、更加复杂的精准3d组织和器官研究模型，用于评估组织和器官病理模型的空间复合效应，将对组织和器官病因的理解产生重大科学影响；同时也可以为其他组织器官的体外重建提供使能技术，为未来在长途太空旅行的紧急医疗事故中，使用自体细胞原位3d打印进行再生医学治疗提供新的可能。

3、但是，申请人发现，由于太空微重力环境的特殊性和火箭发射条件的严苛性，会使得常规生物墨水和打印工艺在面向空间组织和器官模型构建时出现以下问题：(1)太空微重力环境下流体的表面张力占主导，若采用常规打印工艺在空气中挤出直写，生物墨水往往因表面张力作用形成球形，还可能因爬壁效应沿着针头向上流动，打印成型较为困难；(2)太空空间环境温度变化范围大，打印环境难以精准控温，而常规生物墨水适用的温度范围较窄，无法在宽温度范围下仍具备良好的打印性能；(3)太空空间载荷体积有限，而常规的悬浮介质需要借助复杂的换液装置应用，空间利用性较差；(4)火箭发射时存在较大机械振动，这要求生物墨水和悬浮介质具备较高的流变稳定性，在振动状态下能够维持为固态以不发生泄露，只在特定条件下发生“凝胶-溶胶”相变；(5)火箭发射时间不固定，而常规生物墨水生物稳定性较差，无法在室温环境下长期存储并保持生物活性。

4、因此，有必要开发一种面向空间组织和器官模型构建的生物墨水与打印技术，以改善上述问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种面向空间组织和器官模型构建的生物墨水、悬浮介质及悬浮3d打印方法，以解决现有技术中常规生物墨水和打印工艺无法在太空环境中有效开展生物3d打印的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种面向空间组织和器官模型构建的生物墨水，其包括未交联的第一连续相凝胶材料以及分散在第一连续相凝胶材料中的已交联的载细胞的第一凝胶微球；在生物墨水中，第一凝胶微球的体积含量为40～80％；第一连续相凝胶材料包括凝胶材料a和凝胶材料b；且凝胶材料a和凝胶材料b的质量比为1：3～8(例如可以为1：3、1：4、1：5、1：6、1：7或1：8)；凝胶材料a为甲基丙烯酰化透明质酸；凝胶材料b为甲基丙烯酰化明胶。

3、甲基丙烯酰化透明质酸具有优异的宽温敏特性，甲基丙烯酰化明胶具有优异的可逆性，二者协同配合使得本发明的生物墨水具备以下性能：(1)其具有更宽的打印温度应用范围，进一步扩展了其适用性，从而后续将其应用在环境温度变化范围大的太空空间时，该生物墨水也具备良好的打印性能。此处还需说明的是，第一凝胶微球的体积含量为40～80％(例如可以为40％、50％、60％、70％或80％)，这样的生物墨水在较宽温度范围内均可实现效果良好的打印，而当第一凝胶微球的体积含量不在上述范围时，即使采用上述组分依然存在较高温度或者较低温度下打印效果较差的问题。(2)该生物墨水还具备较高的流变稳定性，具有固液相变可控转化性；从而可以在火箭发射过程中维持固态以防止因机械振动导致的泄露，只在特定条件下发生“凝胶-溶胶”相变，进而在太空环境下经过简单温度调控，即可由固态转变为液态或凝胶态从而实现打印。(3)上述生物墨水生物稳定性也较好，可以在室温环境下长期存储并保持生物活性，从而可以有效避免因火箭发射时间延迟而导致的物料失效问题。(4)该生物墨水还具有优异的剪切变稀和自愈合特性，不仅适用于悬浮打印工艺，可在悬浮介质中打印成型，以适应太空的微重力环境，还可以提高打印结构的力学强度和稳定性，从而进一步拓展生物墨水的材料适用性。

4、为了进一步使生物墨水具有更适宜太空环境作业的剪切变稀特性，在一种优选的实施方式中，第一凝胶微球的直径为50～1000μm，优选为100～500μm。

5、为了实现上述目的，根据本发明的另一个方面，提供了一种面向空间组织和器官模型构建的悬浮介质，其包括未交联的第二连续相凝胶材料以及分散在第二连续相凝胶材料中的已交联的第二凝胶微球(第二凝胶微球可载细胞也可不载细胞)；在悬浮介质中，第二凝胶微球的体积含量为60～90％；第二连续相凝胶材料包括凝胶材料c和凝胶材料d；且凝胶材料c和凝胶材料d的质量比为1：1～5(例如可以为1：1、1：2、1：3、1：4或1：5)；凝胶材料c为透明质酸；凝胶材料d为明胶。

6、透明质酸具有优异的宽温敏特性和保湿性，明胶具有优异的可逆性，二者协同配合使得本发明的悬浮介质具备以下性能：(1)配合生物墨水使其具有更宽的打印温度应用范围，进一步扩展了其适用性，从而后续将其应用在环境温度变化范围大的太空空间时，该生物墨水也具备良好的打印性能。此处还需说明的是，第二凝胶微球的体积含量为60～90％(例如可以为60％、70％、80％或90％)，这样的悬浮介质可以协助生物墨水在较宽温度范围内均可实现效果良好的打印，而当第二凝胶微球的体积含量不在上述范围时，即使采用上述组分依然存在较高温度或者较低温度下打印效果较差的问题。(2)该悬浮介质还具备较高的流变稳定性，具有固液相变可控转化性；从而可以在火箭发射过程中维持固态以防止因机械振动导致的泄露，只在特定条件下发生“凝胶-溶胶”相变，进而在太空环境下经过简单温度调控，即可由固态转变为液态或凝胶态从而协助生物墨水实现打印。(3)上述悬浮介质生物稳定性也较好，可以在室温环境下长期存储并保持生物活性，从而可以有效避免因火箭发射时间延迟而导致的物料失效问题。(4)该悬浮介质还具有优异的剪切变稀和自愈合特性，不仅适用于悬浮打印工艺，可配合上述生物墨水打印成型，以适应太空的微重力环境，还可以提高打印结构的力学强度和稳定性，从而进一步拓展生物墨水的材料适用性。(5)尤其需要说明的是，该悬浮介质可以为支持细胞原位生长、增殖和分化等活动提供定制微环境，有助于打印后组织和器官的功能成熟，无需借助复杂的换液装置应用，具备维持原位培养的能力。

7、为了进一步使悬浮介质具有更适宜太空环境作业的剪切变稀特性，在一种优选的实施方式中，第二凝胶微球的直径为50～1000μm，优选为100～300μm。

8、在一些可选的实施方式中，上述第一凝胶微球和第二凝胶微球可各自独立地选自天然高分子水凝胶。例如，天然高分子水凝胶材料可以选自海藻酸钠、明胶、胶原、matrigel、壳聚糖、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、硫酸软骨素、白蛋白以及它们的甲基丙烯酰化产物(如甲基丙烯酰化明胶(gelma)、甲基丙烯酰化海藻酸钠(algma)、甲基丙烯酰化透明质酸(hama)等)中的至少一种。

9、进一步说明的是，在一些可选的实施方式中，上述第一凝胶微球和第二凝胶微球可各自独立地通过乳化法、电喷雾法或液滴微流控中至少一种手段制备得到，这是本领域技术人员所知悉并可以实现的，在此不多赘述。上述载细胞的第一凝胶微球和第二凝胶微球内的细胞为原代干细胞或多能干细胞来源的实质细胞、肿瘤细胞、基质细胞和内皮细胞中至少一种，实质细胞对应的组织和器官包括心脏、肝脏、肾脏、胰腺和脑结构中至少一种。上述第一凝胶微球和第二凝胶微球内细胞密度可各自独立地为106～108/ml。第一凝胶微球(生物墨水中)和第二凝胶微球(悬浮介质中)的质量-体积浓度可各自独立地为10～100mg/ml。

10、进一步补充的是，在一些可选的实施方式中，前述第一连续相凝胶材料和第二连续相凝胶材料也可载有细胞，细胞密度可各自独立地为106～5×107/ml。第一连续相凝胶材料(生物墨水中)和第二连续相凝胶材料(悬浮介质中)的质量-体积浓度可各自独立地为1～100mg/ml。

11、为了实现上述目的，根据本发明的另一个方面，提供了一种面向空间组织和器官模型构建的悬浮3d打印方法，其包括以下步骤：

12、步骤s1，使前述的生物墨水和前述的悬浮介质各自独立地在4～15℃温度条件下冷藏，以使生物墨水和悬浮介质呈现固态；

13、步骤s2，将固态的生物墨水和固态的悬浮介质发射到太空中；

14、步骤s3，在太空环境中，将固态的生物墨水和固态的悬浮介质各自独立地在20～37℃温度条件下加热，以使生物墨水和悬浮介质由固态转变为液态或凝胶态；

15、步骤s4，3d打印机驱动在液态或凝胶态的悬浮介质中，打印液态或凝胶态的生物墨水以构建组织和/或器官模型；

16、步骤s5，使打印后物料进行交联，并在悬浮介质中对其进行原位培养。

17、基于前文的各项原因，首先，前述悬浮介质具有良好的生物相容性和自愈合特性，生物墨水具有优异的剪切变稀特性，这样，悬浮介质可以支撑生物墨水的打印、并可以在打印结束后为细胞原位培养提供养分支持。同时，这也有助于在微重力状态下控制微丝稳定成形构建具有复杂血管通道和异质细胞结构的组织器官模型。其次，将前述生物墨水和悬浮介质在4～15℃下冷藏以使其转变为固态，这样可以有效防止物料在火箭发射的振动过程中泄露。再者，将固态的物料发射到太空中，在太空环境中，将固态的生物墨水和固态的悬浮介质各自独立地在20～37℃温度条件下加热，以使生物墨水和悬浮介质由固态转变为液态或凝胶态(半液态半固态)，从而使其能够在太空中进行3d打印。另外，打印结束后，对物料进行交联可以提高打印结构的力学强度和稳定性，再在悬浮介质中对打印的组织器官模型进行原位培养。

18、在一种优选的实施方式中，采取光交联的方式进行上述交联，以进一步提高太空环境打印结构的力学强度和稳定性，优选光强参数为20～60mw/cm2。此处说明的是，悬浮介质的连续相不进行交联。

19、在提高生物墨水和悬浮介质应用性能的基础上，考虑到进一步降低能耗，在一种优选的实施方式中，上述冷藏的时间和加热的时间可各自独立地为10～120min。

20、在一些具体地实施方式中，打印的处理温度为30～37℃，更适配太空环境。且该温度范围下可进行打印是常规生物墨水所不具备的，已有研究通常能实现的打印最高温度一般为25℃，而本发明上述生物墨水和悬浮介质能够实现更宽的打印温度窗口，可以更好地满足太空环境的要求。

21、在一种可选的实施方式中，步骤s2中，将固态的生物墨水和固态的悬浮介质先发射到太空中，再装载入已在轨运行的3d打印设备内部，或在地面中将固态的生物墨水和固态的悬浮介质先装载入3d打印设备内部，再将其发射到太空轨道中。

22、为了实现上述目的，根据本发明的另一个方面，提供了一种由前述的面向空间组织和器官模型构建的悬浮3d打印方法构建得到的组织和/或器官模型。

23、在一些可选的实施方式中，该模型可用于病损组织器官修复、药物开发与筛选和病理研究模型等，组织和/或器官结构包括心脏、肝脏、肾脏、胰腺和脑结构中至少一种，组织和/或器官结构的尺寸为500μm～100mm。