一种R8-dGR修饰的脂质纳米粒及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种r8-dgr修饰的脂质纳米粒及其用途。

背景技术：

1、常见的肺部罕见病包括囊性纤维化、特发性肺纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、原发性纤毛运动障碍、淋巴管肌瘤病等，这些疾病多为慢性或持续性的肺部症状，严重影响患者的生活质量。肺部罕见病的共同点为小分子化药难以治疗，现有的治疗指南和专家共识也大多为对症疗法，因此针对这些肺部疾病的治疗具有极大的未被满足的临床需求。同时，由于大多数肺部罕见病是由基因突变导致的，以核酸药物递送为基础的基因治疗即成为了最有潜力的对因治疗方案。其中脂质纳米粒(lipid nanoparticles,lnp)由于生物相容性良好，制备方法相对简便，对核酸药物的包封率高，成为了近年来快速发展且较为成熟的核酸药物载体系统。用于核酸药物递送的lnp通常包括可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质，目前基于这四种脂质材料处方的核酸药物递送lnp体系已有三款获批上市，包括用于淀粉样多发性神经病变的sirna药物onpattro，以及两款mrna新冠疫苗comirnaty和spikevax，此外也有更多的lnp核酸药物递送体系已进入临床研究阶段。

2、然而lnp的应用，尤其是经吸入给药在肺部疾病的基因治疗上的应用，仍然存在一定的缺陷。首先，核酸药物需进入细胞后才能调控基因表达或编码功能蛋白，而lnp进入细胞的主要方式是通过脂质材料与细胞膜的膜融合作用，这种介导入胞的能力通常是相对较弱的；同时，由于呼吸道内的上皮细胞表面通常覆盖着一层起保护作用的黏液层，经吸入给药用于肺部疾病治疗的药物在给药后会先陷于黏液层中，需有效地穿透黏液层后才能接触呼吸道上皮细胞，而后进入细胞发挥作用。因此经吸入给药的核酸药物递送系统更加需要载体具有高效的穿透能力。

3、细胞穿膜肽是一类具有高效介导穿透入胞能力的短肽，已有大量研究证实将穿膜肽作为配体修饰能够增强载药系统的组织穿透和细胞内传递，专利(cn104497147b)公开了一种具有双受体识别能力的串联型主动靶向穿膜肽rx-dgr，其能够同时识别肿瘤细胞表面高度表达的整合素受体αvβ3和跨膜蛋白受体nrp-1，将该穿膜肽用于肿瘤靶向纳米递药系统能够显著增强递药系统的肿瘤靶向和肿瘤深层穿透能力。另有研究使用该类主动靶向穿膜肽r8-dgr修饰的脂质体包载crispr/cas9基因编辑系统，用于胰腺癌的治疗，同样能够显著增强递药系统对肿瘤组织的穿透能力和治疗效果(knockdown of hypoxia-induciblefactor-1alpha by tumor targeted delivery of crispr/cas9 system suppressed themetastasis of pancreatic cancer.man li et.al,j control release.2019,304:204-215.)。该类主动靶向穿膜肽的应用目前仅局限于肿瘤靶向递药系统，但事实上，一方面穿膜肽本身较强的穿透能力使其具有了介导递药系统穿透肺部上皮细胞黏液层的潜在可能，另一方面整合素受体与肺部纤维化的发病机制同样密切相关，有研究报道整合素受体αv家族参与了肺纤维化关键靶点转化生长因子(tgf-β)的激活，进而参与肺部纤维化的病程发展，在纤维化病变的肺泡上皮细胞通常高表达整合素受体αv家族(role of integrin-mediated tgfβactivation in the pathogenesis of pulmonary fibrosis.amandagoodwin et.al,biochem soc trans.2009,37(pt 4):849-54.)。因此主动靶向穿膜肽rx-dgr具有应用于肺部核酸药物递送尤其是针对肺部纤维化病变的核酸药物递送的潜在优势，而目前尚无将此类主动靶向穿膜肽应用于治疗肺部纤维化相关疾病的研究报道。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了主动靶向穿膜肽r8-dgr修饰的包载核酸药物的脂质纳米粒，用于治疗相关疾病，其不仅能够主动靶向肺部细胞的整合素受体αv家族，还能够通过穿膜肽具有高效穿透进入细胞的作用，将脂质纳米粒包裹的核酸药物递送到病灶，进而增加药物的治疗效果。

2、本发明的目的之一是提供一种r8-dgr修饰的脂质纳米粒，其包括脂质复合物和包封在所述脂质复合物中的核酸类药物。

3、在一些实施方案中，所述脂质复合物包括可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质、r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质的一种或多种，优选地，所述脂质复合物由可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质、r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质组成。

4、在一些实施方案中，所述脂质复合物由以下组分组成：

5、所述可电离脂质的摩尔百分比为35-65％，优选45-55％；

6、所述辅助磷脂的摩尔百分比为10-20％，优选10-15％；

7、所述胆固醇的摩尔百分比为20-50％，优选30-40％；

8、所述聚乙二醇脂质的摩尔百分比为1-10％，优选1-5％；

9、所述r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质的摩尔百分比为0.1-5％，优选0.5-1.5％。

10、在一些实施方案中，所述可电离脂质为dlin-mc3-dma、sm-102、5a2-sc8、c12-200中的至少一种；优选地，所述可电离脂质为sm-102；在一些实施方案中，所述辅助磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)中的至少一种；优选地，所述辅助磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)；所述聚乙二醇脂质包括1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(dmg-peg)、二硬脂酰-rac-甘油-聚乙二醇(dsg-peg)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dppe-peg)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dmpe-peg)、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dope-peg)中的至少一种，peg分子量为500-5000；优选地，所述聚乙二醇脂质为dmg-peg2000。

11、在一些实施方案中，所述r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质由含马来酰亚胺末端的聚乙二醇脂质和含有半胱氨酸末端的r8-dgr制备得到。

12、在一些实施方案中，所述含马来酰亚胺末端的聚乙二醇脂质包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dspe-peg-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dppe-peg-mal)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dmpe-peg-mal)、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dope-peg-mal)中的至少一种，peg分子量为1000-5000；优选地，所述含马来酰亚胺末端的聚乙二醇脂质为dspe-peg2000-mal；

13、在一些实施方案中，所述r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质为dspe-peg2000-r8-dgr。

14、在一些实施方案中，所述核酸药物包括mrna药物、sirna药物、mirna药物、反义核酸药物、适配体药物和dna药物中的至少一种；优选地，所述核酸药物为mrna药物。

15、在具体实施例中，核酸药物包括mrna药物、sirna药物、mirna药物、反义核酸药物、适配体药物和dna药物中的至少一种。所有的核酸药物，可以是天然碱基组成的核酸药物，也可以是包括非天然碱基或者碱基修饰的核酸药物，或者是核酸类似物。

16、在一些实施方案中，所述核酸药物与所述脂质复合物的质量比为1:10-1:40，优选为1:20-1:30。

17、本发明的目的之二是提供一种r8-dgr修饰的脂质纳米粒的制备方法，其包括以下步骤：

18、取可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质、r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质，溶解于无水乙醇作为乙醇相，另取核酸药物溶解于柠檬酸缓冲液作为水相，混合所述水相和所述乙醇相制备脂质纳米粒，接收液为脂质纳米粒中间品；使用磷酸盐缓冲液(ph 7.4)稀释后，透析除去乙醇，过滤即得r8-dgr修饰的包载核酸药物的脂质纳米粒体系。

19、在实施例中，磷酸盐缓冲液的ph为7.4，过滤步骤采用微孔滤膜(如0.22μm)进行无菌过滤。

20、在一些实施方案中，所述柠檬酸缓冲液浓度为10-100mm，ph值为3-5；优选为50mm，ph＝4。

21、在一些实施方案中，所述水相和乙醇相的流速比为(2-5):1，总流速为2-20ml/min；优选为4-8ml/min。

22、本发明的目的之三是提供一种r8-dgr修饰的脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

23、取可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质，溶解于无水乙醇作为乙醇相；

24、取核酸药物溶解于柠檬酸缓冲液作为水相；

25、混合所述乙醇相和所述水相制备脂质纳米粒，接收液使用磷酸盐缓冲液稀释后，透析除去乙醇，得到包载核酸药物的未修饰的脂质纳米粒；

26、取r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质水化液与所述包载核酸药物的未修饰的脂质纳米粒振荡混合；过滤即得r8-dgr修饰的包载核酸药物的脂质纳米粒体系。

27、在一些实施方案中，所述柠檬酸缓冲液浓度为10-100mm，ph值为3-5；优选为50mm，ph＝4。

28、在一些实施方案中，混合所述水相和所述乙醇相制备脂质纳米粒过程中，所述水相和乙醇相的流速比为(2-5):1，总流速为2-20ml/min；优选为4-8ml/min。

29、本发明的目的之四为提供一种r8-dgr修饰的脂质复合物，所述脂质复合物包括可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质、r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质的一种或多种，优选地，所述脂质复合物由可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质、r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质组成。

30、在一些实施方案中，所述脂质复合物由以下组分组成：

31、所述可电离脂质的摩尔百分比为35-65％，优选45-55％；

32、所述辅助磷脂的摩尔百分比为10-20％，优选10-15％；

33、所述胆固醇的摩尔百分比为20-50％，优选30-40％；

34、所述聚乙二醇脂质的摩尔百分比为1-10％，优选1-5％；

35、所述r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质的摩尔百分比为0.1-5％，优选0.5-1.5％。

36、在一些实施方案中，所述可电离脂质为dlin-mc3-dma、sm-102、5a2-sc8、c12-200中的至少一种；优选地，所述可电离脂质为sm-102；在一些实施方案中，所述辅助磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)中的至少一种；优选地，所述辅助磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)；所述聚乙二醇脂质包括1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(dmg-peg)、二硬脂酰-rac-甘油-聚乙二醇(dsg-peg)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dppe-peg)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dmpe-peg)、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dope-peg)中的至少一种，peg分子量为500-5000；优选地，所述聚乙二醇脂质为dmg-peg2000。

37、在一些实施方案中，所述r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质由含马来酰亚胺末端的聚乙二醇脂质和含有半胱氨酸末端的r8-dgr制备得到。

38、在一些实施方案中，所述含马来酰亚胺末端的聚乙二醇脂质包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dspe-peg-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dppe-peg-mal)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dmpe-peg-mal)、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(dope-peg-mal)中的至少一种，peg分子量为1000-5000；优选地，所述含马来酰亚胺末端的聚乙二醇脂质为dspe-peg2000-mal；

39、在一些实施方案中，所述r8-dgr修饰的聚乙二醇脂质为dspe-peg2000-r8-dgr。

40、本发明的目的之五为提供一种药物组合物，其包括本发明所述的r8-dgr修饰的脂质纳米粒和/或药学上可接受的载体。

41、在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括ph调节剂、等渗调节剂、冻干保护剂等。

42、在一些实施方案中，所述ph调节剂包括但不限于tris、hepes、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾中的一种或多种；所述等渗调节剂包括但不限于蔗糖、氯化钠、氯化钾中的一种或多种；所述冻干保护剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇中的一种或多种。

43、在一些实施方案中，所述药物组合物为注射剂或吸入液体制剂，所述注射剂和吸入液体制剂可通过本领域常规制备方法制备得到。

44、本发明的目的之六为提供一种本发明所述的r8-dgr修饰的脂质纳米粒、r8-dgr修饰脂质复合物或药物组合物在制备治疗肺部纤维化的药物中的用途。

45、本发明的目的之七为提供一种本发明所述的r8-dgr修饰的脂质纳米粒、或r8-dgr修饰脂质复合物在制备核酸类药物递送试剂中的用途；优选地，所述试剂用于将核酸类药物递送至肺部。

46、有益效果

47、本发明提供了主动靶向穿膜肽r8-dgr修饰的包载核酸药物的脂质纳米粒，用于治疗相关疾病，其不仅能够主动靶向肺部细胞的整合素受体αv家族，还能够通过穿膜肽具有高效穿透进入细胞的作用，将脂质纳米粒包裹的核酸药物递送到病灶，进而增加药物的治疗效果。另外，本发明使用微流控法制备的r8-dgr修饰的脂质纳米粒操作简便、方法稳定、重现性高，安全性较高。从实施例的结果可见，经r8-dgr修饰的脂质纳米粒的粒径分布良好，对核酸类药物的包封率高，稳定性良好，具有高效的细胞转染效果和较高的安全性。