含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物及其应用的制作方法

本发明属于细胞制品制备，涉及一种含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物。

背景技术：

1、公开该背景技术的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、炎症性肠病（inflammatory bowel disease, ibd）是一种以肠道炎症复发为特征的慢性疾病。该疾病根据严重程度主要有两个特征的表型表现：溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis, uc)和克罗恩病(crohn’s disease, cd)。uc的发病率约为每10万人中有0.5-24.5例/年，cd的发病率约为每10万人中有0.1-16例/年。根据调查发现，在美国有超过180万的患者，全世界大约有350万的患者患有ibd。不幸的是，ibd的发病率在世界范围内急剧增加，给患者的家庭和公共医疗保健带来了沉重的经济负担。

3、该病的发病机制不明确，可能与遗传、环境因素（如细菌病原体）和免疫反应失调之间存在相互作用。ibd的治疗旨在减少症状的范围和严重程度，并阻止疾病进展。主要药物是5-氨基水杨酸盐（5-asa）、皮质类固醇和免疫抑制剂等。但这些常规的药物主要针对单一靶点治疗，具有局限性并存在严重的副作用。例如氨基水杨酸类药物长期使用会出现头晕、头痛与胃肠道不良反应；免疫抑制剂、皮质类固醇和生物制剂等会导致白细胞减少、骨质疏松、血管坏死、肾上腺功能不全以及各种感染等不良反应。因此，急需开发安全有效的产品用于ibd的治疗。

4、益生菌是一种有益的细菌，能够促进肠道菌群平衡，增强机体的免疫能力，促进营养物质的吸收，减少肠道炎症的发生，降低肠道疾病的风险。有研究显示，肠道益生菌可通过改变肠道环境来降低与ibd相关的肠道炎症，它们能够创造更有利的肠道微生物生态位，从而维持消化道的正常生理机能。但是益生菌并非百利而无一害的，部分益生菌在体内活动的时候，可能会发生感染的情况，甚至诱发某些炎症。另外有研究显示，长期摄取益生菌活菌制剂能够增加菌血症的发病率。因此，如何更加安全有效的使用益生菌，降低益生菌的不良作用备受研究人员的关注。

5、乳杆菌是一种食品级微生物，且是最常见的益生菌物种之一。鼠李糖乳杆菌atcc53103（lgg）是此类研究的理想益生菌，因为它是文献中研究最深入的细菌，具有记录的体外抗炎作用和可靠的安全性数据。初步临床研究支持可能利用lgg制剂维持ibd患者的缓解。lgg在生长过程中，会释放纳米级的囊泡物质，这种囊泡可能具有lgg功能的同时，还能减少活菌制剂的副作用。此外，细菌外膜囊泡的给药方式多数是注射给药，而对于ibd疾病口服给药更具有空间和安全优势，因此口服细胞外膜囊泡，并将其稳定的递送到特定肠道部位的是在细菌外膜囊泡应用中的需要解决的问题。

6、mscs是存在于骨髓、脐带和脂肪等组织中的一种多功能干细胞，由于mscs具有良好的促再生作用和强大的免疫调节功能且免疫原性较低，基于mscs的细胞治疗研究越来越多，涉及治疗的疾病谱非常丰富，如骨关节疾病、移植物抗宿主病、肝衰竭、感染性疾病等。有研究表明mscs通过分泌相关免疫调节因子，抑制促炎性th1/th17细胞的增殖和功能，修复损伤的细胞和组织，导致抗炎因子分泌增加，促炎因子分泌减少，从而缓解ibd。然而不同来源的mscs、移植的数量等导致治疗效果不佳。且mscs的保存条件比较严格，有使用不便的弊端。mscs源的外囊泡具有与mscs相似的生物学功能，能够修复组织损伤，调节多种免疫系统细胞、肠道微生物群等，基本无毒副作用，具有自主靶向的能力，能够归巢到特定病变组织，从而更好地发挥疗效。细胞外囊泡多采用注射的方式给药，而对于ibd疾病口服给药的途径更具有优势。

技术实现思路

1、为了扩展和强化干细胞外囊泡在炎症性肠病治疗方面的功能，本发明提供一种含益生菌外囊泡和干细胞胞外囊泡的组合物，该组合物结合lgg和ucmsc的作用，两者联合应用具有明显的协同增效作用，可以更好地促进ibd的恢复，促进肠道粘膜屏障的修复，减少炎症反应。

2、本发明的另一目的在于提供一种上述组合的制备方法。

3、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

4、一种含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物，肠道益生菌外囊泡和干细胞外囊泡颗粒数比例为1:1000-1000:1；如，1:1000、1:800、1:500、1:100、1:50、1:20、1:10、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、25:1、50:1、80:1、100:1、200:1、500:1、1000:1或者上述比值之间的任意比例。为了达到更好的治疗效果，干细胞和益生菌外囊泡颗粒数比例为1:100-100:1；结合成本和疗效，上述比例优选为1:10-10:1。

5、所述干细胞的来源并无限定，胎盘组织、脐带血、骨髓、脂肪、牙髓、尿液、经血、皮肤、神经、内皮祖细胞等任何组织中可以提取到的干细胞都可以作为干细胞来源。为了采集方便、保证数量，干细胞来源于胎盘组织、脐带血、脂肪或骨髓。用于产生外囊泡的干细胞可以是直接分离获得的或者由直接分离的干细胞传代后获得的。一般的，现有技术中，干细胞可传代10-15次左右，仍能够保持比较好的生物学活性，因此，传代1-15次的干细胞都是可以用于生产外囊泡的。为了保证外囊泡的质量和数量可用于治疗，用于产生外囊泡的干细胞为直接分离获得的干细胞传代3-7次获得的第4-8代的干细胞。

6、所述肠道益生菌为用于调节人体肠道菌群平衡的有益菌，在分类上属于乳杆菌科（lactobacillaceae）、酵母科(saccharomycetaceae)和芽孢杆菌属（ bacillus）。具体地，可以为乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、酵母属、芽孢杆菌属的菌株，如，鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、动物乳双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜热链球菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌。在一些实施例中，肠道益生菌为鼠李糖乳杆菌或罗伊氏乳杆菌；具体菌株可以选择鼠李糖乳杆菌lgg、鼠李糖乳杆菌hn001、鼠李糖乳杆菌mp108、罗伊氏乳杆菌dsm17938。

7、外囊泡的制备可采用本领域常用方法，如差速离心法、超滤法、tff切向流过滤法、密度梯度离心、空间排阻色谱法、微流控分离法、声学流体分离、介电泳分离法、聚合物沉淀、免疫亲和等方法。外囊泡的粒径根据制备方法的不同会有一定的差别。在一些实施例中，粒径范围为50nm-500nm。

8、上述组合物还包括制剂化所需的载体和/或药用辅料。其剂型可以选择适于口服的液态或固态剂型，如口服液、冻干粉、胶囊、片剂等。具体的制备方法可以采用医学或药学上通用的方法，将含干细胞和益生菌外囊泡的溶液直接或者根据需要与药学上允许的载体、添加剂，如，海藻糖、甘露醇、人白蛋白等，一起进行制剂化获得液体制剂，或者进一步通过冷冻干燥制成粉末物，或与药学上允许的添加剂一起作为胶囊的内容物、或压片制备成固体制剂。在一些实施例中，将外囊泡溶液与冻干保护剂混合后冻干，获得了复合外囊泡冻干粉。所述组合物为了适应释药部位的微环境，可以具有不同的ph，ph的范围可以在医药上、药理学上或生理学上允许的范围内，并无特别限定。如，ph 3.0-10.0、5.0-8.0、6.5-8.0。

9、为了提高组合物的疗效或者针对同一病症的其他症状，上述组合物还可以包括其他有效成分，如，氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、抗体药、低聚半乳糖、美沙拉嗪、维生素d、钙。

10、本发明还提供了一种上述组合物在制备缓解或治疗炎症性肠病的药物中的应用。

11、上述组合物制备的药物中，外囊泡的总颗粒数并无固定限制。一般地，为了适应不同医疗用途或作用靶标，外囊泡的输注颗粒数量一般为105-1011/kg体重；为了使上述组合物的使用数量能够达到该数量级范围；在一些实施例中，外囊泡的总颗粒数大于105/ml或105/g，如每毫升或每克制剂中含有外囊泡的颗粒数为107-1011数量级范围或108-109数量级范围。

12、本发明具有以下优点：

13、本发明提供的肠道益生菌外囊泡和干细胞外囊泡的组合物能够通过口服到达肠道，提供了囊泡给药的新方法。此外，本发明的复合冻干粉能够缓解dss诱导的大鼠溃疡性结肠炎，能够降低疾病活动指数、减少结肠缩短、缓解结肠炎症、修复结肠屏障，效果优于炎性肠病常用药物美沙拉嗪。