一种多级环境响应性控释外泌体复合材料及其制备方法与应用

本发明属于生物医用材料领域，特别涉及到一种多级环境响应性控释外泌体复合材料及其制备方法与应用。

背景技术：

1、外泌体在注射入体内后会被快速清除，因此构建外泌体的缓释体系显得极为重要。直接将外泌体与材料共混虽然较为方便简单，但是往往由于材料的孔径大以及与材料结合不紧密等问题，会造成外泌体的突释；将外泌体通过化学方法修饰与材料结合则有破坏外泌体的结构，影响外泌体功能的风险。因此，设计环境响应性的多级控释外泌体的材料则备受期待。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种多级环境响应性控释外泌体复合材料及其制备方法与应用，所述外泌体复合材料可以根据不同应用环境进行定制设计，可以构建出三级环境响应性控释外泌体的缓释体系。

2、本发明通过以下技术方案来实现：

3、一种环境敏感连接分子，其特征在于，所述环境敏感连接分子一端为胆固醇，另一端修饰巯基。所述环境敏感连接分子一端的胆固醇能够插入到外泌体的磷脂分子层从而与外泌体实现物理结合，另一端的巯基能够在紫外光激发下与甲基丙烯酸酐改性的透明质酸中的双键发生点击反应，从而实现外泌体与透明质酸的响应性结合。作为可选方式，在上述环境敏感连接分子中，所述巯基与胆固醇之间还连接有环境敏感键。

4、作为可选方式，在上述环境敏感连接分子中，所述环境敏感键可选择的范围较多，包括ph响应性断裂的键(如弱酸下断裂的酰腙键)和紫外照射断裂的磷酸酯键，以及能够在白介素家族蛋白(il)、基质金属蛋白酶家族蛋白(mmp)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶家族蛋白(adamts)、肿瘤坏死因子家族蛋白(tnf)等蛋白存在的情况下发生响应性断裂键。进一步的，所述环境敏感键为环境敏感肽。进一步的，所述环境敏感键为骨关节炎环境敏感键，具体为mmp响应性断裂多肽(如rvglp)，上述mmp响应性断裂多肽(rvglp)能够在mmp-13存在的情况下发生断裂。

5、作为可选方式，在上述环境敏感连接分子具体为：在rvglp多肽的一端连接赖氨酸，然后利用赖氨酸侧链的氨基与胆固醇酯琥珀酸单酯通过酰胺反应使其一端接上胆固醇基团，在rvglp多肽的另一端连接半胱氨酸从而使其另一端修饰巯基。

6、作为可选方式，在上述环境敏感连接分子具体为：cls-rvglp-sh或sh-rvglp-cls。

7、本发明还提供了一种多级环境响应性控释外泌体复合材料，包括甲基丙烯酸酐改性的透明质酸、本发明所述的环境敏感连接分子和外泌体，所述甲基丙烯酸酐改性的透明质酸通过巯基与环境敏感连接分子端部的马来酰亚胺相联，所述环境敏感连接分子端部的胆固醇能够插入到所述外泌体的磷脂分子层，从而使外泌体与巯基化透明质酸通过环境敏感连接分子形成交联稳定的结构。所述外泌体可以是干细胞来源的外泌体也可以是机体组织细胞来源的外泌体也可以是免疫细胞来源的外泌体或其他来源的外泌体，只需要保持外泌体的磷脂分子层，以便所述环境敏感连接分子的胆固醇端部插入即可。

8、作为可选方式，在上述多级环境响应性控释外泌体复合材料中，部分所述外泌体表面暴露有巯基，外泌体在三羧基乙基膦(tcep)的作用下表面蛋白的二硫键被还原可暴露巯基，能够在紫外光的激发下与甲基丙烯酸中的双键发生点击反应，从而直接与材料结合，这部分外泌体能够随材料降解释放，所述的外泌体也有部分直接与材料共混，能够通过扩散作用释放。

9、作为可选方式，在上述多级环境响应性控释外泌体复合材料中，所述复合材料为可注射凝胶、微凝胶或支架材料。

10、本发明还提供了一种上述的环境敏感连接分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

11、1)合成rvglp多肽时，两端分别接c(半胱氨酸)和k(赖氨酸)序列；利用赖氨酸侧链的氨基与胆固醇酯琥珀酸单酯通过酰胺反应接上胆固醇基团，即形成所述环境敏感连接分子。

12、本发明还提供了一种上述的多级环境响应性控释外泌体复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

13、(1)制备甲基丙烯酸酐改性的透明质酸；

14、(2)制备环境敏感连接分子；

15、(3)制备缓释复合材料。

16、作为可选方式，在上述多级环境响应性控释外泌体复合材料的制备方法中，所述步骤(1)具体为：将透明质酸(ha)粉末溶入超纯水中，搅拌均匀后调至弱碱性，滴加甲基丙烯酸酐，冰浴下反应4h，随后室温搅拌过夜。透析后冷冻干燥得到海绵状固体的甲基丙烯酸改性的透明质酸(ha-ma)。

17、作为可选方式，在上述多级环境响应性控释外泌体复合材料的制备方法中，所述步骤(3)具体为：将环境敏感连接分子用tcep处理后，4℃外泌体共混过夜，与溶解的ha-ma混合(调ph至中性)。司班80混于液态石蜡中搅拌均匀，将混合的溶液滴加至油相中，改变转速得到不同粒径，经紫外光照后交联形成的载外泌体的微凝胶体系。

18、作为可选方式，在上述多级环境响应性控释外泌体复合材料的制备方法中，所述步骤(3)可以进一步根据病症调控3级释放外泌体的配比，如在环境敏感连接分子用tcep处理后，4℃下添加1份外泌体共混过夜，另外2份外泌体分别用或不用tcep处理(得到exo-sh和exo)，将随后将响应性释放分子修饰的外泌体，暴露巯基的外泌体和纯外泌体与溶解的hama共混，在紫外光照下制备微凝胶。

19、本发明还提供了一种上述的环境敏感连接分子的应用，其特征在于，将其用于制备外泌体的控制释放材料。

20、本发明还提供了一种上述的环境敏感连接分子的应用，其特征在于，将其用于制备骨关节炎治疗体系。

21、本发明还提供了一种上述的多级环境响应性控释外泌体复合材料的应用，其特征在于，将其用于制备骨关节炎治疗材料体系。

22、本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

23、本发明的有益效果：

24、(1)本发明所述环境敏感连接分子一端的胆固醇能够插入到外泌体的磷脂分子层从而与外泌体实现物理结合，另一端的巯基能够在紫外光激发下与甲基丙烯酸酐改性的透明质酸中的双键发生点击反应而相互结合，从而实现外泌体与透明质酸的响应性结合。另一方面暴露巯基的外泌体也可以在紫外光激发下与甲基丙烯酸酐改性的透明质酸中的双键发生点击反应而相互结合从而实现外泌体与材料的稳定结合，随材料降解而释放，避免进入体内后被快速清除。

25、(2)本发明所述外泌体复合材料具备多级环境响应的控释和缓释效果，进入体内后，由于符合材料液体交换作用下，材料中存在的少量未与材料结合的游离的外泌体会逐步释放，成为组织修复的“先头兵”。其次，在骨关节炎中mmp-13的表达大大加大，其中一种改性的胆固醇分子，即环境敏感连接分子中，mmp酶特异性断裂多肽使随着环境中mmp的增加而断裂，使缓释体系在到达骨关节炎症部位时，能在患区“精准释放”外泌体。最后，其余与材料直接结合的外泌体能随着材料的降解随之释放，起到“长效缓释”的作用。