一种基于细胞外囊泡的功能化递送系统的制备方法和应用

本发明属于生物和医药，涉及一种功能化细胞外囊泡递送系统的制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是由机体细胞释放的具膜结构的异质性囊泡，可分为4个亚群，包括外泌体(exosomes，直径30～150nm)、微泡(microvesicles，直径100～1000nm)、凋亡小体(apoptotic body，直径100～5000nm)和癌小体(oncosomes，直径1～10μm)。其中，外泌体和微泡可由多种细胞分泌，广泛存在并分布在各种体液中，是体内的信息(dna、rna、蛋白质等)传递信使，目前的分离技术还不能将外泌体和微泡完全分离，因此，可统称为小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sevs)。凋亡小体与外泌体、微泡的发生方式不同，其在细胞凋亡过程中产生，内含dna、细胞器等。癌小体特指癌细胞分泌的外泌体。

2、近几年，细胞外囊泡作为药物递送系统的探索取得了令人鼓舞的进展，但仍有许多问题有待解决。首先，大部分细胞分泌细胞外囊泡的产量较低，在用于药物递送载体时，需要大量培养细胞才能满足实验和临床需求；其次，细胞外囊泡装载药物能力有限，对于剂量较高的化学药物、蛋白质、核酸类生物药物常不能达到给药剂量，治疗效果差；不装载药物的空白细胞外囊泡，治疗效果更差。

技术实现思路

1、本发明的目的提供一种基于细胞外囊泡的功能化递送系统的制备方法，该制备方法得到的细胞外囊泡的产量高，小细胞外微囊泡和凋亡小体中负载有活性物质治疗效果好，解决了空白细胞外囊泡治疗效果差的技术问题。

2、本发明提供了一种基于细胞外囊泡的功能化递送系统的制备方法，包括如下步骤：

3、利用药物与亲代细胞共培养，得到小细胞外微囊泡和/或凋亡小体；

4、所述凋亡小体和/或小细胞外微囊泡负载有生物活性物质；所述生物活性物质包括microrna、lncrna、蛋白质和脂质中的一种或几种；

5、将小细胞外微囊泡和/或凋亡小体进行冻干得到细胞外微囊泡功能化递送系统。

6、优选的，所述小细胞外微囊泡的制备方法包括如下步骤：

7、使用第一培养基培养亲代细胞12～48h，得到第一细胞培养液；

8、将所述第一细胞培养液的培养基更换为含低浓度药物的第一培养基，继续培养细胞12～72h，得到第二细胞培养液；

9、含低浓度药物的培养基中药物量以第一细胞培养液中细胞个数为准计，每106～109个细胞培养基中药物量为1～100000nmol；

10、将所述第二细胞培养液离心，得到上清液；

11、将所述上清液进行第一差速离心，沉淀为小细胞外微囊泡；第一培养基为去除小细胞外囊泡且含质量浓度10％胎牛血清的培养基。

12、优选的，所述第一差速离心的温度为2～6℃；所述第一差速离心的方法包括：将所述上清液第一离心得到第一离心上清液，对所述第一离心上清液进行第二离心得到第二离心上清液，对所述第二离心上清液进行第三离心得到第三离心沉淀，对所述第三离心沉淀重悬后进行第四离心得到第四离心沉淀，对所述第四离心沉淀重悬得到所述细胞外囊泡功能化递送系统中的小细胞外微囊泡；所述第一离心的离心力为1500～3000×g，第一离心时间为10min；所述第二离心的离心力为10000×g，第二离心时间为30min；所述第三离心的离心力为100000～200000×g，第三离心时间为60～90min；所述第四离心的离心力为100000～200000×g，第四离心的时间为60～90min。

13、优选的，所述凋亡小体的制备方法包括如下步骤：

14、使用第一培养基培养亲代细胞12～48h，得到第一细胞培养液；

15、将所述第一细胞培养液的培养基更换为含低浓度药物的第一培养基，继续培养细胞12～72h，得到第二细胞培养液；

16、含低浓度药物的培养基中药物量以第一细胞培养液中细胞个数为准计，每106～109个细胞培养基中药物量为1～100000nmol；

17、将所述第二细胞培养液离心，得到细胞沉淀；

18、采用含高浓度药物的第一培养基对所述细胞沉淀培养12～72h，辐射后得到细胞凋亡液；含高浓度药物的第一培养基中药物量以细胞沉淀中细胞个数为准计，每106～109个细胞培养基中药物量为10～100000μmol；

19、对所述细胞凋亡液进行第二差速离心，收集沉淀为凋亡小体；

20、第一培养基为去除小细胞外囊泡且含质量浓度10％胎牛血清的培养基。

21、优选的，所述第二差速离心的温度为2～6℃；所述第二差速离心的方法为：将所述细胞凋亡液第一离心得到第一离心上清液，对所述第一离心上清液进行第二离心得到第二离心沉淀，对所述第二离心沉淀重悬得到所述细胞外囊泡功能化递送系统中的凋亡小体；所述第一离心的离心力为1500×g，第一离心时间为10min；所述第二离心的离心力为20000×g，第二离心时间为30min。

22、优选的，当利用小细胞外微囊泡和凋亡小体制备功能化递送系统时，将所述小细胞外微囊泡和所述凋亡小体第一混合得到混合物后；还包括对所述混合物进行涡旋处理、超声处理和高压均质处理中的一种或多种。

23、优选的，所述亲代细胞包括干细胞、肿瘤细胞和免疫细胞中的一种或多种；所述干细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、皮肤间充质干细胞和胎盘间充质干细胞中的一种或多种；所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、皮肤癌细胞、口腔癌细胞和脑瘤细胞中的一种或多种；所述免疫细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、中性粒细胞和小胶质细胞中的一种或多种。

24、优选的，所述药物包括二苯乙烯苷、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-1，6-二甲醚、淫羊藿苷、雷公藤甲素、雷公藤红素、姜黄素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、维甲酸、阿霉素、环磷酰胺、表阿霉素、依托泊苷、吉西他滨、喷司他汀、藤黄酸、青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、甲氨蝶呤、环孢素、青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、甲氨蝶呤、环孢素、双氯芬酸、吲哚美辛、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、苦参碱、小檗碱、青藤碱、白芷香豆素、槲皮素、甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草素、芍药苷、桔梗皂苷、白藜芦醇、鱼腥草素、雷公藤甲素、雷公藤红素和姜黄素中的一种或多种及衍生物。

25、本发明提供了一种基于细胞外囊泡的功能化递送系统，所述功能化递送系统包括凋亡小体和/或小细胞外微囊泡和生物活性物质；所述凋亡小体和小细胞外微囊泡负载有生物活性物质；所述生物活性物质包括microrna、lncrna、蛋白质和脂质中的一种或几种。

26、本发明提供上述技术方案所述的功能化递送系统在制备如下1)～3)中的一种或几种药物中的应用；

27、1)治疗阿尔兹海默症；

28、2)治疗肿瘤；

29、3)治疗炎性疾病；所述药物的剂型包括注射剂、口服剂和外用剂型中的一种或几种。

30、本发明的有益效果：本发明提供了一种基于细胞外囊泡的功能化递送系统的制备方法，包括如下步骤：利用药物与亲代细胞共培养，得到小细胞外微囊泡和/或凋亡小体；所述凋亡小体和/或小细胞外微囊泡负载有生物活性物质；所述生物活性物质包括microrna、lncrna、蛋白质和脂质中的一种或几种；将小细胞外微囊泡和/或凋亡小体进行冻干得到细胞外微囊泡功能化递送系统。本发明制备的的功能化药物递送系统，其以高效分泌小细胞囊泡或凋亡小体的细胞为亲代细胞，采用药物与细胞共孵育实现小细胞外囊泡和凋亡小体的高效分泌。所得小细胞外微囊泡和/或所述凋亡小体负载有生物活性物质；且所得小细胞外微囊泡和凋亡小体含有磷脂双分子层，该磷脂双分子层保护负载生物活性物质在体循环中不被降解；并且生物活性物质还可以通过其表面蛋白与靶细胞表面受体的相互作用或直接融合增强生物活性物质被靶细胞内吞的效率，使生物活性物质具备穿透体内生物屏障的能力，将小细胞外囊泡和凋亡小体中的生物活性物质直接递送至靶细胞，发挥高效治疗作用。本发明制备的药物调控后的功能化递送系统具有稳定性好、药效提高、毒副作用降低的特征。