双相仿生软骨-骨一体化支架材料及其制备方法、应用

本发明属于生物医学组织工程，具体地，属于骨-软骨组织修复材料，更具体地，涉及一种双相仿生软骨-骨一体化支架材料及其制备方法、应用。

背景技术：

1、骨关节炎是最普遍的慢性关节疾病，它的主要特征是关节软骨的进行性退化，往往累及软骨下骨。由于软骨、骨再生微环境已严重破坏，关节软骨在体内的再生能力极低，损伤后无法自愈，给患者带来巨大的伤痛困扰。因此，如何有效地修复关节软骨缺损一直是外科治疗的研究重点。目前，采用自体组织移植、异体组织移植、人工材料移植等传统治疗手段进行关节软骨的修复，存在创伤大(自体组织)、免疫排斥(异体组织)、缺乏生物学功能及异物排斥(人工材料)等弊端。而如何综合克服上述弊端，实现永久性生理功能重建，一直是科研学者长期探索的医学难题。

2、近年来，基于干细胞与支架材料的生物关节再生技术逐渐受到了人们的关注，其利用自体来源细胞，体外构建为形态可控的活体组织，然后植入生物体进行创伤修复。该技术在进行活体组织植入时引起的创伤小、可控性高，已成为关节损伤治疗的新方向。

3、干细胞负载的支架材料经体外软骨诱导后植入体内不仅能够促进软骨再生，且可通过局部血管长入使其内化为骨组织。尽管如此，目前生物关节再生技术仅在活体骨、软骨组织构建上取得了突破性的效果，而骨-软骨一体化的生物活体关节支架材料构建仍存在较大的技术瓶颈有待突破。例如，目前对于双相仿生支架的策略尚未完善，现有的支架策略往往是采用水凝胶类材料组成上下两层，上层为软骨层，下层为骨层。并且，对于双相支架的构建策略，目前主要是通过3d打印或者冷冻干燥的方式将两层连接起来合成具备刚度梯度的双相仿生支架。但上述支架构建方式也存在一些固有缺陷，例如通过上述方式构建的双相支架存在界面断层的问题，导致双相支架断裂以及界面不连续等问题。此外，也可能存在移植后期软骨层血管化不利于软骨表型维持等缺点，限制了其在临床骨缺损修复中的应用。

4、因此，如何构建一种能够避免界面断层问题，还能够有效诱导预软骨的骨再生，并保证移植后软骨表型维持和软骨再生稳定性的新型支架材料，以有效应用于骨-软骨复合缺损修复的组织工程领域，成为本发明亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的之一是提供一种双相仿生软骨-骨一体化支架材料，其首先通过一体化的设计避免了目前双相仿生支架界面断层的问题。此外，本发明通过设计基于脱钙骨框架的双相仿生支架，并与预软骨诱导后的预软骨化水凝胶微球共同促进骨软骨缺损的修复。本发明的双相仿生软骨-骨一体化支架材料中，通过调控区域血管化的方式在上层(软骨层)释放阿西替尼抑制软骨层血管化来维持预软骨化水凝胶微球的稳定软骨再生，在下层通过促进软骨内骨化的方式诱导预软骨化水凝胶微球的骨再生，有效促进了骨软骨一体化再生与修复。

2、本发明的目的之二是提供上述双相仿生软骨-骨一体化支架材料的制备方法。

3、此外，本发明的目的之三是提供上述双相仿生软骨-骨一体化支架材料的应用。

4、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

5、一种双相仿生软骨-骨一体化支架材料，是将预软骨化水凝胶微球注射到双相仿生支架中制备得到；

6、所述预软骨化水凝胶微球的制备过程是：将gelma水凝胶微球与骨髓间充质干细胞进行共培养，然后进行体外预软骨诱导培养，得到预软骨化水凝胶微球；

7、所述双相仿生支架制备时，是以松质骨为支架基质，将松质骨划分为上、下两层，然后对松质骨上层和下层进行分层脱钙处理，得到上层完全脱钙、下层半脱钙的双相脱钙骨支架；进一步对所述双相脱钙骨支架的上层进行阿西替尼修饰，得到双相仿生支架；

8、所述双相仿生支架包括上层和下层，且为一体化支架材料；双相仿生支架中，上层为完全脱钙且负载阿西替尼的骨材料，下层为半脱钙的骨材料。

9、本发明提供的双相仿生软骨-骨一体化支架材料，将预软骨化水凝胶微球注射到分层脱钙且经过阿西替尼修饰的双相仿生支架上制备得到。该一体化支架中，上层负载抑制血管生成的药物阿西替尼作为软骨层，下层为完全脱钙的脱钙骨支架。具有该结构的一体化支架材料能够通过区域血管形成调控的方式，在上层促进稳定软骨生成，在下层促进预软骨化水凝胶微球形成的软骨再生单元内化为骨组织，有效促进了骨软骨一体化再生与修复，具有广阔的临床应用前景。

10、作为进一步优选的方案，对所述双相脱钙骨支架的上层进行阿西替尼修饰时，先在双相脱钙骨支架上层进行聚多巴胺桥接，然后再修饰阿西替尼；通过阿西替尼修饰，以实现区域血管化的调控。本发明通过分层脱钙和区域药物负载的方式，有效保留了天然松质骨的多孔结构、良好的生物可降解性以及与天然骨软骨组织相似的力学性能和微环境，能够通过调控区域血管化的方式实现骨软骨复合缺损的修复。

11、本发明对于松质骨的种类不进行特别的限定，本领域技术人员可以选择生物组织工程支架领域常规的大型动物的松质骨材料即可。作为进一步优选的方案，所述松质骨选自猪松质骨、牛松质骨、羊松质骨、人松质骨中的一种。

12、松质骨具有天然的多孔结构，本发明进行分层脱钙处理后得到的双相仿生支架也具有多孔结构。作为优选的方案，所述双相仿生支架为多孔材料，多孔材料的孔径为300-400μm。具体该孔径范围的双相仿生支架，能够为预软骨化水凝胶微球提供足够的容纳空间。

13、gelma水凝胶微球具有良好的光固化性能，能够满足生物支架材料的制备需求。作为进一步优选的方案，所述gelma水凝胶微球的直径为80～120μm。

14、上述双相仿生软骨-骨一体化支架材料的制备方法，包括以下步骤：

15、(1)以松质骨作为支架基质，先对松质骨进行预处理，然后将松质骨划分为上、下两层，对松质骨上层和下层进行分层脱钙处理，得到上层完全脱钙、下层半脱钙的双相脱钙骨支架；该双相脱钙骨支架为具有不同基质刚度的双相脱钙骨支架；

16、将所述双相脱钙骨支架的下层进行包埋，然后采用聚多巴胺对双相脱钙骨支架进行桥接，再采用阿西替尼溶液进行浸泡处理，实现阿西替尼在双相脱钙骨支架上层的修饰，得到所述双相仿生支架；

17、(2)将gelma水凝胶微球与骨髓间充质干细胞进行共培养，得到表面负载有骨髓间充质干细胞的水凝胶微球，然后进行预软骨诱导，得到预软骨化水凝胶微球；

18、(3)将步骤(2)制备得到的预软骨化水凝胶微球以微注射的方式注入到步骤(1)制得的双相仿生支架的孔隙中，通过反复注射保证预软骨化水凝胶微球与双相仿生支架的有效结合，直至双相仿生支架中完全填充预软骨化水凝胶微球，即得所述双相仿生软骨-骨一体化支架材料；其中，步骤一和步骤二不区分先后顺序。

19、本发明提供的双相仿生软骨-骨一体化支架材料的制备方法，通过分层脱钙和多巴胺桥接抑制血管化的药物阿西替尼，得到上层完全脱钙及阿西替尼修饰、下层半脱钙的双相仿生支架。同时，将骨髓间充质干细胞负载到水凝胶微球上，并在体外培养成为一种预软骨化水凝胶微球。最后，本发明将预软骨化水凝胶微球作为预软骨化再生单元，注射到分层脱钙的双相支架上，制备得到双相仿生软骨-骨一体化支架材料。该一体化支架材料在具有调控区域血管化功能的同时能够促进骨软骨一体化再生，在组织工程骨-软骨修复支架材料领域具有广阔的应用前景。

20、作为进一步优选的方案，步骤(1)中，所述预处理是对新鲜的松质骨进行脱细胞、脱脂、dna酶处理。通过对松质骨进行预处理，能够得到没有免疫原性的松质骨框架，以满足支架材料的制备和应用需求。

21、作为进一步优选的方案，步骤(1)中，松质骨划分后的上层、下层的高度比为1∶3～10；更优选为1∶3～7。

22、作为进一步优选的方案，步骤(1)中，所述分层脱钙处理是：将松质骨下层进行石蜡包埋，然后置于脱钙液中脱钙处理3-5天，再去除下层包埋的石蜡，再次放在脱钙液中脱钙处理1-2天，最后清洗、冷冻干燥，得到上层完全脱钙、下层半脱钙的双相脱钙骨支架。进一步优选地，去除下层包埋的石蜡是采用二甲苯或酒精作为石蜡去除溶剂。所述清洗是采用pbs进行清洗。在该步骤中，上层实现了完全脱钙，下层由于石蜡包封实现了半脱钙处理，由此得到具有不同基质刚度的双相脱钙骨支架。

23、作为进一步优选的方案，步骤(1)中，将所述双相脱钙骨支架的下层进行包埋，具体是采用石蜡包埋双相脱钙骨支架的下层。该步骤中，通过对双相脱钙骨支架下层进行蜡封，单独对支架上层进行抑血管化的药物阿西替尼修饰，实现区域血管化调控的目的。

24、作为进一步优选的方案，步骤(1)中，所述表面桥接是采用聚多巴胺溶液对双相脱钙骨支架进行浸泡从而实现表面桥接；聚多巴胺溶液的浓度为0.8～1.2mg/ml；浸泡时间为20～30h。

25、作为进一步优选的方案，步骤(1)中，采用阿西替尼溶液进行浸泡处理具体是：将桥接聚多巴胺的支架材料置于阿西替尼溶液中进行浸泡处理，实现阿西替尼在双相脱钙骨支架上层的负载修饰。所述阿西替尼溶液的浓度为0.8～1.2mg/ml。采用阿西替尼溶液浸泡处理的时间为10～15h。

26、作为进一步优选的方案，步骤(2)中，所述预软骨诱导的时间为25～30天。更优选地，所述预软骨诱导的时间为28天。通过预软骨诱导后的微球与双相仿生支架结合，能够有效调控血管化微环境从而实现软骨和骨的双相分化。

27、作为进一步优选的方案，步骤(2)中，所述gelma水凝胶微球采用微流控技术或乳化技术制备。进一步优选地，所述gelma水凝胶微球采用微流控技术制备，其制备方法包括以下步骤：将10wt/v％的gelma水凝胶溶液作为水相，并将含2wt/v％表面活性剂的氟化油作为油相，将水相和油相分别注入微流控通道中，调节油相和水相的流出速度，制备出直径80～120μm的微球，然后采用紫外光固化，再进行清洗，得到gelma水凝胶微球。进一步地，所述紫外光的波长为405nm；所述清洗是先采用破乳剂清洗两次，然后采用pbs清洗三次。

28、如上所述的双相仿生软骨-骨一体化支架材料的应用，在制备用于骨-软骨复合缺损修复的组织工程支架材料中的应用。

29、作为进一步优选的方案，所述双相仿生软骨-骨一体化支架材料通过区域调控血管化和软骨内骨化，使得骨-软骨协同再生，以实现骨-软骨复合缺损的修复。

30、本发明的综合有益效果在于：

31、本发明提供的双相仿生软骨-骨一体化支架材料，通过对松质骨进行分层脱钙处理，然后在表面修饰抑血管化药物得到双相仿生脱钙骨框架，最后与预软骨化水凝胶微球结合制备骨软骨一体化支架。通过双相仿生支架负载预软骨化微球再生单元，用于关节骨-软骨一体化再生，有效促进了骨软骨的再生与修复。

32、本发明的双相仿生软骨-骨一体化支架材料的制备方法，工艺简单且操作方便，首先通过一体化的设计避免了目前双相仿生支架界面断层的问题。并且相比双相水凝胶支架而言，本发明制备的双相仿生支架具有可控的力学强度和适宜的降解速度，避免了水凝胶力学性能差以及降解过快的缺点。尤其是，由于软骨组织和骨组织的生长微环境差异，软骨组织无血管而骨组织血管丰富，因此本发明通过在支架上层修饰区域修饰抑血管化的药物能够预防软骨层血管化，从而实现稳定软骨再生的目标，这种区域血管化调控亦能促进软骨内骨化实现骨再生，为骨-软骨这种复杂的复合骨缺损的修复提供了一种新的治疗策略。

33、本发明上述方案中，通过分层脱钙处理得到一种能够调控区域血管化并协同促进骨软骨再生的双相仿生一体化支架。该双相仿生一体化支架所采用的材料均为临床上可使用的安全材料，具有良好的细胞相容性、合适的力学性能以及与天然骨软骨组织类似的微环境，能够协同实现软骨-骨一体化再生，并且由于独特的区域血管化调控和预软骨再生单元的添加，能够通过抑制软骨层血管生成实现稳定软骨生成，并通过软骨内骨化的方式有效促进骨再生。因此，本发明能够为临床治疗骨-软骨复合缺损提供一种新的策略，具有非常广阔的临床应用前景。