一种靶向联合治疗纳米载体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医用纳米材料，特别是涉及一种靶向联合治疗纳米载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,rb)是儿童早期最常见的原发性眼内恶性肿瘤，约占51岁儿童肿瘤的6％。随着诊断和治疗的急剧发展，这种毁灭性和危及生命的恶性肿瘤的预后已从一个世纪前的几乎100％死亡率显著改善到现在的95％以上存活率。目前，靶向化疗，特别是动脉或玻璃体内化疗已逐渐被接受为一线治疗方式，辅以放疗或局灶治疗。虽然靶向化疗能有效地阻止肿瘤生长和保护眼球，但由于药物毒性或手术本身，往往会发生严重的术后并发症，如全身性症状、视网膜脱离和血管事件。因此，开发一种新的治疗策略对rb治疗至关重要。

2、理想的肿瘤治疗模式应该包括两个关键要素，即有效的肿瘤消除和治疗后持久的肿瘤抑制。目前的治疗干预措施，如放疗、化疗、光热疗法(ptt)和光动力疗法(pdt)，在治疗肿瘤疾病方面还远远不能令人满意。例如，大多数纳米疗法由于难以进入肿瘤深度而无法完全根除深部肿瘤细胞。局部干预(光疗、放疗等)不能处理全身弥散性肿瘤转移。因此，一旦停止治疗，通常会出现预后不良并伴有肿瘤复发和/或转移。t肿瘤特异性免疫治疗是新一代肿瘤治疗方法，通过训练和刺激先天免疫系统对肿瘤进行抑制，具有持久抑制肿瘤的固有优势，有利于与常用治疗手段合作进行联合治疗。然而，这种治疗测量需要协调两种治疗方法基本原则之间的明显偏差，得到最佳组合需要复杂的实验设计。

3、树突状细胞(dendritic cells,dc)专门识别肿瘤细胞表达的肿瘤抗原，然后以抗原肽-主要组织相容性复合体(antigen peptide-major histocompatibility complex,pmhc)分子的形式加工和预送肿瘤抗原到细胞表面。然后，成熟的树突状细胞启动不同的抗原特异性t细胞亚群来杀死同质肿瘤细胞。到目前为止，最流行的癌症免疫治疗方法是用肿瘤抗原对患者进行免疫。经常递送一种或几种肿瘤抗原以引起抗肿瘤免疫。然而，由于免疫抑制和肿瘤异质性，对肿瘤的免疫应答通常处于低水平。事实上，肿瘤细胞含有多种类型的肿瘤抗原，通常分为肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。由于已知的肿瘤抗原非常稀少，其免疫机制仍然不明确，因此难以确定用于免疫治疗的最佳肿瘤抗原。目前，同时使用多种患者来源的肿瘤抗原似乎是促进肿瘤特异性免疫反应的基本解决方案。但是由于肿瘤抗原的利用能力有限，这一目标很难实现。此外，将多种肿瘤抗原合并到一个系统中也是很难实现的，因为制备过于昂贵和费力，特别是当免疫治疗需要与其他治疗手段联合使用时。

4、两种不同的细胞系可以融合在一起形成杂种细胞，它们共享统一的细胞质，但在刺激下保持双核的特性。由于肿瘤细胞和dc在免疫过程中密切相关，肿瘤抗原可以加工并呈递到融合细胞(fc)的细胞膜上。与下调肿瘤抗原表达以逃避免疫的肿瘤细胞不同，fc在细胞膜上携带了一系列高表达的肿瘤抗原(包括已知的和未知的)和dc衍生的共刺激分子(b7家族成员)，从而产生强烈的免疫反应。然而，这种活细胞疫苗的临床应用存在致癌性风险、杂交细胞存活率低、使用前储存困难等问题。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明构建了一种靶向肿瘤细胞的杂交膜仿生纳米药物载体，用于视网膜母细胞瘤的联合治疗。

2、本发明的一方面提供了一种靶向联合治疗纳米载体fm@mpda/dox/jq-1，所述纳米载体包括负载阿霉素(dox)和jq-1抑制剂的介孔多巴胺载体mpda/dox/jq-1，及包裹在其表面的杂交细胞膜(fm)，所述杂交细胞膜包括树突状细胞膜(dcs细胞膜)和视网膜母瘤细胞膜(weri-rb-1)。

3、本发明的靶向联合治疗纳米载体，以介孔的多巴胺为载体，利用其空腔结构负载化疗药物dox和抑制剂jq-1，并在其表面包裹dcs细胞膜和肿瘤细胞膜weri-rb-1杂化而成的杂交细胞膜，该载体为具有同源靶向的纳米药物递送载体；由于杂交膜的内源性特性，载体能够表现出长时间的系统循环和免疫逃避，同时由于母细胞的归巢作用，肿瘤细胞膜提供的掩膜能够使该载体靶向视网膜母细胞瘤，在酸性条件下释放出dox和jq-1，利用dox和jq-1的治疗作用，该纳米体系在抑制肿瘤细胞增殖中具有良好的细胞毒性。此外dcs膜可以刺激肿瘤部位t细胞活化并分泌细胞因子tnf-α，从而降低肿瘤部位hsp70的表达量；在低温光热治疗过程中，肿瘤细胞表现出更高的热敏感性，从而被大量杀伤，从而达到抑制肿瘤增殖的目的。

4、优选地，介孔多巴胺的粒径为100-200nm。

5、优选地，阿霉素dox、jq-1抑制剂和介孔多巴胺mpda的重量比为1～2：1～3：2～6，进一步优选地，阿霉素dox、jq-1抑制剂和介孔多巴胺mpda的重量比为1.2：2：4。

6、优选地，所述的杂交细胞膜fm与负载阿霉素和jq-1抑制剂的介孔多巴胺载体mpda/dox/jq-1的质量比为0.1：1～1.5：1，进一步优选地为1：1。

7、本发明的另一方面还提供了所述靶向联合治疗纳米载体fm@mpda/dox/jq-1的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)利用模板法制备介孔多巴胺mpda；

9、(2)在介孔多巴胺上负载阿霉素和jq-1抑制剂，得到负载阿霉素和jq-1抑制剂的介孔多巴胺载体mpda/dox/jq-1；

10、(3)在mpda/dox/jq-1表面包裹杂交细胞膜，所述杂交细胞膜由树突状细胞膜和视网膜母瘤细胞膜杂化而成。

11、优选地，所述步骤(1)中，将f127乙醇溶液加入盐酸多巴胺水溶液中，混合均匀得到混合液，在混合液中加入1,3,5-三甲基苯(tmb)，超声分散，然后加入氨水，室温搅拌反应，离心洗涤干燥得到介孔多巴胺。

12、优选地，所述f127乙醇溶液的浓度为13～53.4mg/ml；所述盐酸多巴胺水溶液的浓度为3～15mg/ml；所述f127乙醇溶液和盐酸多巴胺水溶液的体积比为1:1；所述tmb与混合液的体积比为1.6～11.7：1000；所述氨水与混合液的体积比为体积为16.6～43.3：1000；所述的反应时间1～2h。

13、进一步优选地，步骤(1)中，f127乙醇溶液的浓度为33.3mg/ml；盐酸多巴胺水溶液的浓度为10mg/ml；1,3,5-三甲基苯与f127乙醇溶液和盐酸多巴胺水溶液混合液的体积比为6.7：1000；氨水与f127乙醇溶液和盐酸多巴胺水溶液混合液的体积比为3:100；反应时间为1h。

14、优选地，所述步骤(2)中，分别将，步骤(1)得到介孔多巴胺分散在pbs中得到mpda溶液，阿霉素dox溶于pbs中得到阿霉素溶液；jq-1抑制剂溶于dmso中得到jq-1溶液；然后，将dox溶液和jq-1溶液依次滴入mpda溶液中，避光搅拌反应；反应结束后离心、洗涤、干燥，得到负载阿霉素和jq-1抑制剂的介孔多巴胺载体mpda/dox/jq-1。

15、优选地，步骤(2)中，阿霉素、jq-1抑制剂和介孔多巴胺的重量比为1～2：1～3：2～6；mpda溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml，阿霉素溶液浓度为1～3mg/ml，jq-1溶液浓度为1～3mg/ml；反应时间为12～36h，优选24h；离心转速为8000～12000rpm，优选为10000rpm。

16、进一步优选地，步骤(2)中，阿霉素、jq-1抑制剂和介孔多巴胺的重量比为1.2：2：4；mpda溶液的浓度为1mg/ml，阿霉素溶液浓度为2mg/ml，jq-1溶液浓度为2mg/ml；反应时间为24h；离心转速为10000rpm。

17、优选地，所述步骤(3)中，采用挤出法在mpda/dox/jq-1表面包裹杂交细胞膜，杂交细胞膜与mpda/dox/jq-1的质量比为0.1：1～1.5：1。

18、进一步优选地，步骤(3)中，采用脂质体挤出机挤出包覆，将细胞膜碎片和mpda/dox/jq-1在去离子水中混合均匀，混合物依次通过孔径为1μm，0.8μm，0.45μm的聚碳酸酯滤膜共挤出；最后，将挤出的混合物离心以收集产物；离心转速为8000～12000rpm，优选为10000rpm。

19、本发明的第三方面还提供了上述的纳米载体mpda/dox/jq-1，及上述制备方法制备得到的纳米载体mpda/dox/jq-1在视网膜母细胞瘤药物制剂中的应用。

20、相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明的靶向联合治疗纳米载体多种物质复合，保持了原物质的优点，解决了单一原有材料性能的不足；具有同源靶向性，酸响应性，能够递送dox和jq-1，具有光热/化疗/免疫三重疗法，用于癌症的治疗具有优异的抗肿瘤效果，可以克服现有用于治疗癌症的纳米材料所欠缺的一些问题。本发明的靶向联合治疗纳米载体具有良好生物安全性，可用于视网膜母细胞瘤治疗。

22、本发明的制备方法，操作简单，所需的原材料易得，首先利用模板法合成介孔多巴胺，得到的介孔多巴胺分散均匀、粒径均一，进而通过亲疏水作用负载dox和jq-1在mpda介孔中，然后通过挤出法将细胞膜的包裹在载体外面，得到的纳米载体具有完整而紧密的膜涂层，以及均匀分散性。