一种融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒及其制备方法

本发明属于医药制剂领域，涉及一种融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒及其制备方法。

背景技术：

1、高尿酸血症是由体内尿酸生成和排泄之间的平衡失调引起的，当体内尿酸浓度持续升高时，大量尿酸单钠晶体沉积在关节，引发痛风性关节炎，导致关节的红肿、发热和剧烈疼痛。因此，高尿酸血症可视为痛风性关节炎的生化基础。痛风性关节炎的发病机制涉及多个方面，包括尿酸代谢异常、炎症反应和细胞信号通路的激活等。由于这些病理过程的复杂性，单靶点药物仅影响特定的生物学通路，治疗不够全面。目前，临床上用于治疗痛风性关节炎的药物往往作用于单一靶点，且伴随着严重的不良反应。秋水仙碱通过抑制炎症反应缓解关节疼痛，但其治疗窗口较窄，患者易出现严重的肝、肾损害和骨髓抑制。非布司他和别嘌醇通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性进而抑制尿酸的合成，但患者可能面临心血管风险和肝功能异常等毒副作用。丙磺舒等药物通过抑制尿酸重吸收促进尿酸排泄，但可能导致肾功能损害等不良反应。尿酸酶通过分解尿酸使其成为可溶性产物排出，但存在体内活性低、稳定性差和免疫原性高等缺陷。碳酸氢钠通过碱化尿液来保护肾脏，但长期大量服用可能导致代谢性碱中毒等不良反应。因此，迫切需要开发作用于多个靶点、毒副作用小的新型降尿酸活性物质。咖啡酸苯乙酯可通过调节炎症因子水平缓解痛风炎症，同时能抑制尿酸生成和促进尿酸排泄以降低尿酸浓度，且对肝肾几乎无毒。白藜芦醇可抑制尿酸生成和促进尿酸排泄，同时降低炎症反应。但咖啡酸苯乙酯和白藜芦醇存在水溶性差、稳定性差、靶向性差和半衰期短等缺点，极大地限制了临床应用。纳米粒可将有效成分封装在内部，具有增强药物稳定性，延长药物体内滞留时间及提高疗效等优点。硫化铜纳米粒可在近红外光照射下温和升温，在不损伤周围组织的情况下缓解局部炎症。细胞膜包裹纳米粒能够使纳米粒具备细胞膜生物特性。

2、经查询专利及文献，目前尚无咖啡酸苯乙酯联合白藜芦醇、光热剂(包括硫化铜纳米粒)、纳米酶(包括硫化铜纳米粒)中的一种或多种物质的任何报道，当然，也尚无咖啡酸苯乙酯/小分子药物(包括白藜芦醇)/光热剂或纳米酶(包括硫化铜纳米粒)复方制剂的任何报道，尚无咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇/硫化铜纳米粒复方制剂的任何报道。目前，尚无聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒的任何报道，当然，也尚无聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒负载咖啡酸苯乙酯、小分子药物(包括白藜芦醇)、光热剂或纳米酶(包括硫化铜纳米粒)中的一种或多种物质的任何报道，尚无聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒负载咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇、硫化铜纳米粒中的一种或多种物质的任何报道。目前，尚无红细胞/巨噬细胞融合膜包裹的聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒的任何报道，尚无红细胞/巨噬细胞融合膜包裹的聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒负载咖啡酸苯乙酯、小分子药物(包括白藜芦醇)、光热剂或纳米酶(包括硫化铜纳米粒)中的一种或多种物质的任何报道，尚无红细胞/巨噬细胞融合膜包裹的聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒负载咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇、硫化铜纳米粒中的一种或多种物质的任何报道。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒(聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒)可同时干预多个靶点，咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇可以发挥协同作用，抑制尿酸的生成、促进尿酸的排泄、抑制炎症反应。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒负载了硫化铜纳米粒，硫化铜纳米粒是一种优良的光热剂，可在近红外光照射下温和升温，在不损伤周围组织的情况下缓解局部炎症；同时硫化铜纳米粒也是一种纳米酶，具有类过氧化氢酶活性，可消除炎症部位过量的过氧化氢。本发明中的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒外有聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖的双重修饰，可提高药物的水溶性和稳定性、减少氧化应激对细胞和组织的损伤、抑制炎症介质的释放以及调节免疫细胞活性。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒保留了红细胞膜和巨噬细胞膜的表面功能蛋白，可同时表现出良好的生物相容性、较长的血液循环时间、良好的免疫逃逸能力，可将药物、光热剂主动蓄积于炎症部位，联合发挥多靶点疗法-光热疗法-免疫疗法，从而提高药物对痛风性关节炎和高尿酸血症的治疗效果。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒(聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒)及其制备方法。融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒克服了咖啡酸苯乙酯和白藜芦醇水溶性差、稳定性差、靶向性差和半衰期短等缺点。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒可同时干预多个靶点，咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇可发挥协同作用，抑制尿酸的生成、促进尿酸的排泄、抑制炎症反应。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒负载了硫化铜纳米粒，可在不损伤周围组织的情况下缓解局部炎症和消除炎症部位过量的过氧化氢。本发明中的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒外有聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖的双重修饰，可提高药物的水溶性和稳定性、减少氧化应激对细胞和组织的损伤、抑制炎症介质的释放以及调节免疫细胞活性。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒保留了红细胞膜和巨噬细胞膜的表面功能蛋白，可同时表现出良好的生物相容性、较长的血液循环时间、良好的免疫逃逸能力，可将药物、光热剂主动蓄积于炎症部位，联合发挥多靶点疗法-光热疗法-免疫疗法，从而提高药物对痛风性关节炎和高尿酸血症的治疗效果。本发明提供的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒制备工艺简单，成本较低，易于控制和工业化生产。本研究为咖啡酸苯乙酯和白藜芦醇提供了可供选择的新型制剂，可用于高尿酸血症、痛风性关节炎的治疗。

2、本发明提供的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒，其特征在于，包括咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒、红细胞/巨噬细胞融合膜包裹层，所述的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒中包含硫化铜纳米粒，硫化铜纳米粒包括以下各组分，其各组分质量比为：二水合氯化铜1-50份，九水合硫化钠5-250份，聚乙烯吡咯烷酮40-2000份，超纯水1为100-900份，超纯水2为100-900份，超纯水3为400-20000份，制剂中缓冲液1和缓冲液2在同一个配方中是同一种类型的缓冲液，浓度相等均为50-160mm，ph相同均为6.0-9.0，其各组分质量比为：咖啡酸苯乙酯10-40份，白藜芦醇10-40份，硫化铜纳米粒1-4份，磷脂200-800份，胆固醇60-240份，壳寡糖2-8份，聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯16-66份，缓冲液1为1000-4000份，缓冲液2为1000-4000份，所述的缓冲液1和缓冲液2，在同一配方中类型相同，包括双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷-盐酸盐缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-氢氧化钠缓冲液的一种。所述的一种融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒的制备方法包括下列步骤：(1)硫化铜纳米粒的制备方法：将处方量的二水合氯化铜溶于超纯水1中得到液体a，将九水合硫化钠溶于超纯水2中得到液体b，将聚乙烯吡咯烷酮溶于超纯水3中得到液体c；将液体a和液体b加入液体c中，20-30℃搅拌2-8min，90-100℃继续搅拌10-20min，得到液体d；待液体d冷却后，透析12-36h，干燥，得到硫化铜纳米粒；(2)咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒的制备方法：将处方量的硫化铜纳米粒溶于缓冲液1中得到液体e；将磷脂、胆固醇、聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯、咖啡酸苯乙酯和白藜芦醇溶于二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、乙醚中的一种或多种溶剂中，旋转蒸发形成均匀薄膜，加入液体e，20-30℃水合1-3h，得到液体f；将壳寡糖溶于缓冲液2中得到液体g，将液体f加入液体g中，搅拌1-3h，得到咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：取抗凝全血静置，离心5-10min，收集沉淀，用10mm的ph 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤3-5次，加入2.5mm的ph 7.4的磷酸盐缓冲液，离心收集沉淀，得到红细胞膜；(4)巨噬细胞膜的制备方法：收集(1e+7)至(4e+7)个/ml的raw264.7、thp-1、j774、nr8383巨噬细胞中的一种，按照细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒说明书方法提取，得到巨噬细胞膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的巨噬细胞膜按膜蛋白质量比1:2至2:1混匀，超声10-20min，得到融合膜；(6)将步骤(2)得到的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒和步骤(5)得到的融合膜以体积比1:2至2:1混匀，超声10-20min，得到融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒。

3、本发明提供的硫化铜纳米粒平均粒径小于10nm(图1a)，融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒平均粒径小于200nm(图1b)。本发明提供的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒提高了药物的炎症靶向能力。本发明制备的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒、红细胞/巨噬细胞融合膜和巨噬细胞膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳(图2a)和蛋白质免疫印迹(图2b)结果均显示巨噬细胞膜特征蛋白tnfr2(48kda)、cd36(53kda)和f4/80(102kda)；本发明制备的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒、红细胞/巨噬细胞融合膜和红细胞膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳(图2a)和蛋白质免疫印迹(图2b)结果均显示红细胞膜特征蛋白cd47(50kda)。融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒具有炎症靶向性的原因分析如下：(1)巨噬细胞是免疫系统中的重要成分，其膜表面的受体和分子能够特异性识别炎症部位释放的趋化因子和信号分子，从而迁移到炎症部位；(2)融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒继承了生物膜的表面功能蛋白，赋予纳米粒独特的炎症靶向能力。

4、本发明提供的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒可显著降低尿酸单钠晶体诱导的巨噬细胞活性氧的产生(图3)。融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒组的活性氧水平是模型组的40.73％，是咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇(以下简称：混合游离药物)组的62.50％，是咖啡酸苯乙酯组的54.07％，说明融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒能够显著降低尿酸单钠晶体诱导的巨噬细胞活性氧的产生，效果强于混合游离药物，且咖啡酸苯乙酯和白藜芦醇联合使用可协同降低活性氧的产生。激光照射后，融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒组的活性氧水平略有升高，但仍远低于模型组和混合游离药物组。

5、本发明提供的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒能促进痛风性关节炎大鼠尿酸排泄和降低血尿酸水平。融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒组尿液的尿酸水平是模型组的159.53％，是混合游离药物组的127.53％(图4a)。融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒组的血尿酸水平与正常组血尿酸水平接近，是模型组的30.71％，是混合游离药物组的61.39％(图4b)。说明融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒能够显著促进尿酸排泄，降低血尿酸水平，且效果强于混合游离药物。

6、本发明提供的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒联合光热疗法对痛风性关节炎大鼠治疗效果最佳(图5)。融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒体内给药后，显著减轻脚踝肿胀程度，且关节消肿速度快于混合游离药物组。炎症关节6h时进入慢性炎症状态，此时给予多次激光重复照射(6、24、48h)后，关节肿胀显著减轻，36h即与正常关节相近，48h关节恢复至正常状态，炎性缓解效果优于不加激光的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒。融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒联合光热治疗有助于减轻炎症反应的原因可能如下：(1)光热疗法可以导致局部组织升温，这会引起炎症区域内的一些炎症介质的变性或损伤，有助于减轻炎症症状，减少疼痛和肿胀；(2)在炎症反应中，细胞会释放炎症介质导致炎症症状，局部高温可以抑制某些细胞的活性，减少炎症介质的生成，从而减轻炎症的程度；(3)融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒相较于混合游离药物在体内具有更高的稳定性，能够较长时间发挥作用。

7、本发明不同于通常研究报道的含有咖啡酸苯乙酯或白藜芦醇或硫化铜纳米粒中的一种或多种药物的纳米粒递送载体和制备工艺。咖啡酸苯乙酯或白藜芦醇的递送载体研究报道的有：常规脂质体、无机纳米粒、聚合物纳米粒及纳米胶束等。本发明中的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒是一种新型纳米粒，目前尚无咖啡酸苯乙酯联合白藜芦醇、光热剂(包括硫化铜纳米粒)、纳米酶(包括硫化铜纳米粒)中的一种或多种物质的任何报道，当然，也尚无咖啡酸苯乙酯/小分子药物(包括白藜芦醇)/光热剂或纳米酶(包括硫化铜纳米粒)复方制剂的任何报道。目前，尚无红细胞/巨噬细胞融合膜包裹的聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒负载咖啡酸苯乙酯、小分子药物(包括白藜芦醇)、光热剂或纳米酶(包括硫化铜纳米粒)中的一种或多种物质的任何报道。本发明首次将咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇和硫化铜纳米粒制成复方制剂。首次用聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒。首次用聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒负载咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇、硫化铜纳米粒。首次用红细胞/巨噬细胞融合膜包裹聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒；首次用红细胞/巨噬细胞融合膜包裹咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇、硫化铜纳米粒；首次用红细胞/巨噬细胞融合膜包裹聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰脂质纳米粒负载咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇、硫化铜纳米粒。本发明首次将咖啡酸苯乙酯、白藜芦醇、硫化铜纳米粒负载于聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖双重修饰的脂质纳米粒中，再包裹于红细胞/巨噬细胞融合膜中。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒可抑制尿酸的生成、促进尿酸的排泄、抑制炎症反应。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒负载了硫化铜纳米粒，可在不损伤周围组织的情况下缓解局部炎症和消除炎症部位过量的过氧化氢。聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯/壳寡糖对脂质纳米粒的双重修饰，可提高药物的水溶性和稳定性、减少氧化应激对细胞和组织的损伤、抑制炎症介质的释放以及调节免疫细胞的活性。本发明制备得到的融合膜包裹的咖啡酸苯乙酯/白藜芦醇纳米粒保留了红细胞膜和巨噬细胞膜的表面功能蛋白，可同时表现出良好的生物相容性、较长的血液循环时间、良好的免疫逃逸能力，可将药物、光热剂主动蓄积于炎症部位，联合发挥多靶点疗法-光热疗法-免疫疗法，从而提高药物对痛风性关节炎和高尿酸血症的治疗效果。