一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球及其制备方法与应用。

背景技术：

1、外泌体是由细胞分泌的直径30–150nm的膜性囊泡，包含母体细胞的rna、dna、蛋白质等物质，是细胞间物质通讯的重要媒介。近年来，干细胞(多能干细胞、间充质干细胞等)来源的细胞外囊泡表现出了替代干细胞治疗的巨大潜力。广泛的研究显示，干细胞分泌的外泌体可通过向受体细胞传递干细胞物质，以调控细胞稳态、延缓细胞衰老、抑制组织炎症等，进而实现促进组织修复、缓解疾病症状的治疗功能。鉴于干细胞外泌体丰富的治疗功能和其良好的生物安全性，它们极具临床转化应用价值。然而，目前如何实现干细胞外泌体在治疗部位的长效作用仍然是阻碍其转化应用的关键技术问题。

2、水凝胶材料为外泌体的长效控释提供了潜在的载体。水凝胶是一种亲水性交联聚合物，具有良好的生物相容性，可以通过骨架材料、降解速度、交联密度等参数的优化实现所负载物质的长效控释。近年来，研究人员开发了多种外泌体控释水凝胶材料(cn202110203774.4、cn201810643146.6等)。然而这些水凝胶面临着材料制备复杂、难以通过微创方法给药、交联方法反应活性高、难以在作用部位有效粘附等问题。因此，目前亟需设计新型的水凝胶载体以实现干细胞外泌体的在治疗部位的长效控释。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术中提及的水凝胶面临着材料制备复杂、难以通过微创方法给药、交联方法反应活性高、难以在作用部位有效粘附等问题，本发明提供一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球及其制备方法与应用，以提高干细胞外泌体促进组织损伤修复、炎性疾病治疗效率的目的，为干细胞外泌体的转化应用提供更实用的给药形式。

2、本发明公开了一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，以通过无创方式进行给药，实现外泌体在作用部位的长效控释。

3、本发明中，将具有良好生物相容性、fda批准的水溶性聚合物(透明质酸和聚乙二醇)通过温和的diels-alder反应实现水凝胶微球的制备。同时，多巴胺修饰的透明质酸可以通过与组织或外泌体表面蛋白的氢键、π-π作用等非共价键作用实现水凝胶微球在组织表面的粘附和外泌体的长效释放。此外，水凝胶微球可通过注射器针头，因此可以通过注射的无创方式进行给药。

4、肌腱病是一种常见的运动系统疾病，通常由肌肉纤维的过度使用和反复强烈牵拉导致肌腱胶原纤维发生退行性病变。目前，相关研究显示，干细胞分泌的外泌体可有效缓解肌腱疼痛和炎症，是一种潜在的肌腱病治疗因子。然而，如何保证干细胞来源的外泌体在肌腱部位的长效释放是其治疗肌腱病的关键技术挑战。只有与组织形成良好、强力的粘附界面，才能保证水凝胶微球在肌腱组织表面稳定粘附、防止微球在肌肉运动过程中脱落或移动。因此，本发明进一步将所制备的具有良好组织粘附性能的水凝胶微球用于肌腱部位干细胞外泌体的长效释放以缓解肌腱病症状。

5、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

6、本发明首先提供一种可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球，由以下组分组成：

7、2-呋喃甲胺修饰的透明质酸，结构式i，简写为fha；

8、端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇，结构式ii，简写为mal-peg-mal；

9、多巴胺修饰的透明质酸，结构式iii，简写为daha；和，

10、干细胞分泌的外泌体，简写为sc-sevs。

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13、上述外泌体控释水凝胶微球组分中，fha和mal-peg-mal主要用于通过diels-alder交联反应形成水凝胶微球；daha主要通过多巴胺基团介导的与组织蛋白、多糖等分子间的多种非共价键结合作用实现水凝胶微球与组织界面的粘附并延长外泌体的缓释时间；干细胞外泌体主要发挥疾病的治疗功能。

14、在本发明的一个实施方式中，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为1％～10％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1％～5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/ml～5×1011/ml。

15、在本发明的一个实施方式中，水凝胶微球中，2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为2.5％，端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的质量浓度分数为5％，多巴胺修饰的透明质酸的质量浓度分数为1.5％，干细胞分泌的外泌体的颗粒浓度为1×109/ml～5×1011/ml。

16、在本发明的一个实施方式中，所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸中2-呋喃甲胺的修饰率为透明质酸羧基总数的20％～80％，优选为40％～60％。

17、在本发明的一个实施方式中，所述端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇的分子量为1kda～10kda，优选为2kda。

18、在本发明的一个实施方式中，多巴胺修饰的透明质酸中，多巴胺的修饰率为透明质酸羧基总数的20％～80％，优选为60％。

19、在本发明的一个实施方式中，所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸(结构式i，fha)的制备方法为：

20、室温下，将透明质酸(质均分子量100kda)充分溶解于4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝6.0)，配置成质量分数1％的溶液。随后，向溶液中加入一定质量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)，室温搅拌。充分反应30min后，加入一定质量的2-呋喃甲胺，反应溶液室温下搅拌24h。随后，将反应液按1:5的体积比加入到无水乙醇中进行沉淀。将沉淀物用水再次溶解，室温透析后冷冻干燥，获得结构式i所示的物质。

21、所述2-呋喃甲胺修饰的透明质酸的制备过程中，通过调控dmtmm、2-呋喃甲胺的投料量的变化，以控制最终产物中2-呋喃甲胺的修饰率。

22、在本发明的一个实施方式中，所述端基马来酰亚胺修饰的聚乙二醇(结构式ii，mal-peg-mal)可以通过商业化途径获得。

23、在本发明的一个实施方式中，所述多巴胺修饰透明质酸(结构式iii，daha)的制备方法为：

24、室温下，将透明质酸(质均分子量400kda)充分溶解于4-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝6.0)，配置成质量分数1％的溶液。随后，向溶液中加入一定质量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)，室温搅拌。充分反应30min后，加入一定质量的盐酸多巴胺，反应溶液在4℃下搅拌24h。随后，将反应液按1:5的体积比加入到无水乙醇中进行沉淀。将沉淀物用水再次溶解，4℃透析后冷冻干燥，获得结构式iii所示的物质。

25、通过调控dmtmm、盐酸多巴胺的投料量改变以控制最终产物中多巴胺的修饰率。

26、在本发明的一个实施方式中，所述干细胞分泌外泌体(sc-sevs)的收集和纯化方法如下：

27、标准条件下(37℃，5％ co2)，利用无血清培养基在细胞培养瓶中扩增多能干细胞(胚胎干细胞、诱导多能干细胞等)、间充质干细胞、多能干细胞诱导的间充质干细胞等。收集细胞培养基，进行差速离心，以去除细胞、细胞残片等。利用超速离心、切向流过滤等纯化方法获取sc-sevs。利用透射电子显微镜、免疫印记、纳米流式分析仪等方法对收集的干细胞外泌体进行鉴定。

28、本发明进一步提供了所述可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球的制备方法，具体如下：

29、无菌条件下，将一定质量的fha、mal-peg-mal和daha充分溶解于生物相容性介质中，配置成水凝胶前体溶液，并与sc-sevs的生物相容性介质悬液充分混合，得到水凝胶前体溶液；

30、随后，37℃将上述水凝胶前体溶液按照一定体积比滴加到含有一定浓度span80的矿物油中，300rpm/min条件下搅拌一定时间，得到负载sc-sevs的水凝胶微球；

31、4℃离心沉降水凝胶微球，用乙醚对水凝胶微球进行清洗，去除残余矿物油和表面活性剂span 80，将水凝胶微球在室温无菌条件下静置，使乙醚挥发，最终获得负载sc-sevs的水凝胶微球，即为可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球。

32、在本发明的一个实施方式中，所述的生物相容性介质为生理盐水、生理缓冲液或细胞培养基。

33、在本发明的一个实施方式中，含有sc-sevs的水凝胶前体溶液与矿物油的体积比1:1000～1:20，优选为1:100。

34、在本发明的一个实施方式中，span 80的体积分数为0.1％～10％，优选为2.5％。

35、在本发明的一个实施方式中，搅拌时间为2h～24h，优选为7h。

36、本发明进一步提供了含有所述可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球的试剂盒。该试剂盒由两部分组成：装载于一次性注射器中的可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球和生理盐水。

37、在本发明的一个实施方式中，所述一次性注射器为1ml，可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球的容量为250μl，多能干细胞来源外泌体的负载量为1×1011/ml，生理盐水的容量为500μl。

38、本发明进一步提供所述可注射、组织粘附性的外泌体控释水凝胶微球在制备治疗肌腱疾病的药物中的应用。

39、与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

40、1.本发明公开的负载sc-sevs的水凝胶微球制备简单、成本低廉；

41、2.本发明公开的负载sc-sevs的水凝胶微球可有通过注射方式进行给药，使用便捷；

42、3.本发明公开的负载sc-sevs的水凝胶微球可以有效粘附于注射部位附近组织，进而实现sc-sevs在作用目标部位的有效释放；

43、4.本发明公开的负载sc-sevs的水凝胶微球可以实现sc-sevs的长效释放，提高sc-sevs治疗肌腱疾病的效率。