一种基于包埋IgY的W1OW2型双重乳液的制备方法与应用

本发明属于生物，尤其涉及一种包埋igy的w1ow2型双重乳液的制备方法及应用。

背景技术：

1、脂多糖（lipopolysaccharides, lps）作为重要的细菌毒素之一，可通过接触直接诱导小肠炎症的发生。小肠的炎症直接影响到动物机体对营养的吸收，引发系统性炎症及多器官功能衰竭，甚至导致死亡。

2、鸡卵黄免疫球蛋白( egg yolk immunoglobulins，igy)作为禽蛋中重要的免疫活性成分，具有免疫活性强、不会引发耐药性、安全性高、易获得、廉价等优点。igy抗体能与革兰氏阴性菌表面暴露的成分脂多糖相结合，从而抑制病原菌在宿主体内的黏附、定植及生长，抑制细菌的活性和毒素的释放。然而，由于igy是蛋白质，其在小于3的ph值下发生变性并被胃蛋白酶消化，导致抗体活性降低。这些特性使得克服各种消化障碍定点递送食源性igy形成了挑战。

3、为了保持igy的治疗潜力，考虑免疫球蛋白在储存和加工期间以及在摄入时的稳定性是十分重要的。多重乳液（w1/o/w2乳液）已被用于将生物活性化合物包封在内水相中。采用多重乳化包埋igy比起使用需要大规模生产包封igy的脂质体在技术上和经济上更可行。采用w1/o/w2乳液包封igy具有许多优点，包括：①功能性成分可以被捕获在内部水滴内并且以受控的速率响应于特定的环境触发物（例如，口腔、胃或小肠）; ②通过将功能性成分与它们通常可能与之反应的其它水溶性成分分离，可以保护功能性成分免于化学降解;③具有不期望的感官品质的水溶性功能性成分（例如，苦味、涩味或金属味）可被截留在内水相中，使得这些不希望的感官属性在咀嚼期间在口中感觉不到。

4、本发明的目的在于采用多重乳化的方法增加食源性igy在定点递送过程中的稳定性。通过对界面膜结构进行调控以保证多重乳化包埋的igy在递送过程中不受ph和胃蛋白酶影响，定点递送到达肠道，发挥其免疫活性，对由lps引起的小鼠肠炎进行治疗。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于包埋igy的w1/o/w2型双重乳液的制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

2、本发明开发出了一种新型包载igy的乳液体系，可用于对lps导致的小鼠肠炎进行治疗，解决了igy在胃肠道中容易失活的问题，保存了igy的免疫活性和贮藏稳定性，有利于igy更好地发挥其生理活性作用。

3、本发明的第一个方面是提供一种包埋igy的w1/o/w2型双重乳液的制备方法，包括以下步骤:

4、s1:内水相w1制备：将igy与保护剂混合后,涡旋使其均匀分散形成内水相w1;

5、s2:油相o制备：将油溶性乳化剂溶于食用油中，经过磁力搅拌形成油相o；

6、s3:初乳w1/o制备：将油相o与内水相w1初步混合，后经搅拌，低能乳化法或高能乳化法乳化，得到油包水型初乳w1/o;

7、s4:外水相w2制备：以亲水性乳化剂加入到去离子水中，搅拌溶解后置于低温中过夜充分水合，获得外水相w2；

8、s5：w1/o/w2型双重乳液制剂的制备：向所述初乳w1/o中加入外水相w2，经搅拌、低能乳化法或高能乳化法乳化，得到w1/o/w2型双重乳液，低温保存，即可得到包埋igy的w1/o/w2型双重乳液。

9、在一个具体的实施方式中，其中，步骤s1中内水相w1中igy的负载量≥0.2%;

10、在另外一个具体的实施方式中，所述igy保护剂为山梨醇;内水相中保护剂的比例为10~30%。

11、在另外一个具体的实施方式中，步骤s2中所述食用油为玉米油黄油混合溶液。

12、在另外一个具体的实施方式中，步骤s2中油溶性乳化剂包括但不限于油溶性小分子乳化剂、油溶性蛋白质乳化剂、油溶性聚合物和复合物中的至少一种;优选地，包括但不限于聚甘油蓖麻醇酸酯(pgpr)、司班20司班60、司班65、司班80、司班85、乙二醇脂肪酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、玉米醇溶蛋白等油溶性乳化剂；优选的为聚甘油蓖麻醇酸酯(pgpr)。

13、在另外一个具体的实施方式中，步骤s2中所述油溶性乳化剂的添加量为油相o质量的1~15%;优选为3%~10%;最优选的4%。

14、在另外一个具体的实施方式中，步骤s2中磁力搅拌条件为:以200~800rpm磁力搅拌5~45min。

15、在另外一个具体的实施方式中，步骤s3中为将内水相w1边搅拌边滴入油相o中，所述油相o与内水相w1的质量比为1~4:1；其中搅拌的速度为500rpm~2000rpm；优选为800~1500rpm，最优选为1000rpm；滴加的流速为速度为10~100ml/min，后继续搅拌2~5min。

16、在另外一个具体的实施方式中，步骤s3中所述低能乳化法包括但不限于相转变法、自发乳化法、膜乳化法;所述高能乳化法包括但不限于高速剪切、高压均质乳化、微射流乳化；优选的，其中所述的高能乳化法为10000~18000rpm的转速剪切8~15min。

17、在另外一个具体的实施方式中，所述的s4中，w2的制备是将亲水性乳化剂加入到去离子水中，搅拌充分溶解，低温过夜得到外水相；其中，所述亲水性乳化剂包括但不限于小分子乳化剂、多糖乳化剂、多肽乳化剂、蛋白质乳化剂、聚合物和复合物中的至少一种；优选的所述亲水性乳化剂包括但不限于卵磷脂、单苷脂；乳清蛋白、酪蛋白酸钠；酪蛋白凝胶颗粒、球蛋白中的至少一种；最优选的，所述的亲水性乳化剂为乳清分离蛋白；更优选的，所述的w2含有亲水性乳化剂的浓度为0.1~1.5%(w/v);优选的为0.12%；所述溶解为搅拌2-4h，低温过夜是置于0~4℃环境中过夜。

18、在另外一个具体的实施例中，其中步骤s5中，外水相w2与初乳w/o的体积比为4~6:3；优选为2~4:1；

19、在另外一个具体的实施方式中，所述步骤s5中，低能乳化法包括但不限于相转变法、自发乳化法、膜乳化法;所述高能乳化法包括但不限于高速剪切、高压均质乳化、微射流乳化；优选的，其中所述的高能乳化法为10000~18000rpm的转速剪切2~5min；在另外一个具体的实施方式中，所述的低温保存的条件为-20~4℃低温保存。

20、本发明的第二个方面还提供一种基于包埋igy的w1/o/w2型双重乳液，其特征在于:利用本发明第一方面所述的方法制得。

21、本发明的第三个方面是提供第二方面所述的基于包埋igy的w1/o/w2型双重乳液在制备治疗炎症的药物中的应用；在一个具体的实施方式中，所述的炎症为肠炎。

22、本发明的有益效果包括：

23、1）以负载pgpr的黄油和玉米油混合溶液作为油相，以负载igy的溶液作为内水相，之后将所述油相与内水相混合并经剪切均质处理，获得 w/o乳液;将作为外水相的多糖的分散液与所述w/o乳液混合并经剪切均质处理，获得共包埋igy的双重乳液；

24、2）所述的方法中获得的双重乳液中igy的活性更高；

25、3）本发明中提供的igy包埋的双重乳液(w/o/w)能够显著提高igy的肠道粘附性和在胃肠道中的存活率;

26、4）同时该产品的制备条件温和安全、工艺简单高效、原料易得、成本低廉，适用于大规模生产。