专利名称:3′－[(2z)－[1－(3,4－二甲基苯基)－1,5－二氢－3－甲基－5－氧代－4h－吡唑－4 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的血小板生成素(以下简称为TPO)类似物，其为3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基(ylidene)]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸的二-(单乙醇胺)盐。该化合物以结构式I表示 本发明化合物用作TPO受体激动剂，特别是用于促进血小板的生成。
发明详述3’-[N’-[1-(3，4-二甲基苯基)-3-甲基-5-氧代-1，5二氢吡唑-4-亚基]肼基}-2’-羟基-联苯基-3-羧酸及其可药用盐、水合物、溶剂合物，及其酯用作TPO受体激动剂，特别是用于促进血小板的生成及治疗血小板减少症已在国际申请PCT/US01/16863中公开并要求保护，该申请的国际申请日为2001年5月24日，国际公开号为WO01/89457，国际
公开日为2001年11月29日，其所有公开在此引入，作为参考。国际申请PCT/US01/16863没有具体公开其中任何一个化合物的盐的形式。
如今，我们惊奇地发现3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸的二-(单乙醇胺)盐比其游离酸具有许多优点。游离酸水溶性很差(约5μg/ml)，不利于被制备成药用剂型，并降低了化合物的体内生物利用度。
然而，该游离酸作为TPO受体的激动剂特别有用，特别是用于促进血小板的生成及治疗血小板减少症。3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸的二-(单乙醇胺)盐具有溶解度及生物利用度提高的其他优点。
本发明化合物3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸的二-(单乙醇胺)(以下简称为-″活性成分″)用作TPO受体的激动剂特别有用，特别是用于促进血小板的生成及治疗血小板减少症。活性成分可以常用剂型给药，其制备可按照本领域已知的技术，如国际申请PCT/US01/16863所述，将活性成分与常用药用载体或稀释剂结合。给药途径可以是口服，非肠胃给药或局部给药。此处的术语非肠胃给药包括静脉内、肌肉内、皮下、鼻腔内、直肠内、阴道内或腹膜内给药。通常优选口服给药。
此处术语″单乙醇胺″指“2-氨基乙醇”。
上述药用剂量单元的中本发明活性成分的剂量为有效、无毒剂量，优选0.001-100mg/kg总体重，优选0.001-50mg/kg。当治疗需要TPO类似物治疗的患者时，优选口服或非肠胃给药选定剂量1-6次每日。优选的非肠胃给药包括局部、直肠，经皮、注射或持续输液。人类口服给药剂量单元优选包括0.05～3500mg活性成分，最优选0.5～1,000mg活性成分。使用较低剂量的口服给药形式为优选。然而，在对患者安全方便时，也可以施用高剂量非肠胃给药。上述剂量涉及优选的以游离酸表示的活性成分的量。
本领域技术人员应当肯定，活性成分个体剂量的最佳给药数量及间隔视治疗疾病的性质及程度，给药剂型、途径及部位，治疗的具体患者而定，并且该最佳方案可通过常用技术确定。本领域技术人员也应当明白，最佳疗程，即既定时间内每天给予活性成分的剂量次数可经本领域技术人员使用常用的确定疗程的试验进行确定。
一般而言，本发明化合物的制备可通过将游离酸3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸溶解于合适的有机溶剂中，优选四氢呋喃(以下简称为THF)或乙醇/IMS(工业用甲醇变性酒精)，过滤所得混合物以去除杂质，然后将此溶液加入到2或大于2当量的乙醇胺的有机溶剂溶液中，优选水溶性溶剂，该溶剂可包含一定量的水，优选达5倍游离酸体积的水。本发明化合物过滤后干燥，例如真空或高温空气干燥。
乙醇胺，99％，购自Aldrich Chemical Company，Milwaukee，Wisconsin。
四氢呋喃(THF)及工业用甲醇变性酒精74 O.P.(IMS)购自BDHLaboratory Supplies，Poole，England。
下述实施例进一步阐释本发明。实施例不能理解为限制上述
发明内容
及权利要求
所述的本发明范围。
实施例13’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸-羧酸二-(单乙醇胺)的制备 将1g的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸橙色粗品加入16.75mlTHF中，在约30℃搅拌。缓慢加入水(2.0ml)并控制温度高于28℃。加水完毕，将温度恢复至30℃，以玻璃纤维垫(2xWhatman GFC滤器)过滤溶液以除去粒状物质。THF(2.0ml)洗涤滤器，洗涤液加入滤液中。滤液冷却至室温。将乙醇胺(0.324g，2.35mol.当量)溶解于IMS(26ml)并于室温氮气氛下搅拌。将含游离酸的滤液用20～30分钟加入至乙醇胺溶液中。搅拌所得深红色悬液3小时，过滤分离固体并于50℃真空烘箱干燥过夜得1.22g(96％)目标化合物。
HNMR(400MHz，DMSO-d6+20ul TFA，内标DMSO-d5δ2.5)δ2.21(s，3H)，2.26(s，3H)，2.31(s，3H)，2.85(m，4H)，3.57(t，4H)，7.07(m)，7.14(s)，7.18(d，重叠的3H)，7.61(t)，7.63(dd，重叠的2H)，～7.7(m，重叠的2H)，7.79(d)，～7.8(br.s，重叠的2H)，7.96(d，2H)，8.13(s，1H)，13.8(br.s，不可测，与TFA共振重叠)，THF信号为1.76(m)，3.60(为乙醇胺信号掩盖)，在1.05％w/w积分，乙醇信号为1.06(t)，3.44(q)，在1.3％w/w积分.
IR数据1636，1506，1466，1378，1348，1294，1273，1255，1228，1194，1127，1118，1066，1015，767，747cm-1.
实施例23’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)的制备氮气氛下，将8g 3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸橙色粗品室温下溶解于盛有THF(240ml)的500ml圆底三颈烧瓶中。用5分钟以注射器加入乙醇胺(2.2ml，2摩尔当量)。室温搅拌所得深红色悬液1.5小时，过滤分离固体并以THF(16ml×2)洗涤，于50℃真空烘箱干燥过夜得10.37g目标化合物(大于定量产率，是由于含有残留溶剂-经NMR测定约2.4％w/w的残留THF，其它同实施例1)。
实施例33’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)的制备氮气氛下，将8g 3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸橙色粗品室温下悬浮于乙醇(800ml)中。用5分钟以注射器加入乙醇胺(2.2ml，2摩尔当量)。室温搅拌所得深红色悬液45小时，过滤分离固体并以乙醇(10ml×2)洗涤，于50℃真空烘箱干燥过夜得9.83g(96％)目标化合物。NMR同实施例1；乙醇含量为1.3％w/w，无THF存在。
实施例43’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)的制备室温下，将1g的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸(259.0g)加入THF(4660ml)中搅拌直至完全溶解。过滤溶液，通过滤器用THF(520ml)洗涤反应容器(合并滤液得溶液1)。
同时，准备另一个顶部装有搅拌器的反应器装置用于常压蒸馏。依次向反应器中加入IMS74 O.P.(7770ml)、乙醇胺(354ml)。剧烈搅拌溶液，同时加热直至内容物开始蒸馏(BP.76-77C)。
将溶液1转移至反应器上装有的滴液漏斗中。当反应器内容物恒速(约收集50ml蒸馏液时)蒸馏时，自滴液漏斗以与蒸馏速度相当或略低的速度滴加入溶液1。加料完毕，以IMS(260ml×2)洗涤滴液漏斗确保将所有游离酸洗入反应液。重搭仪器装置回流，在氮气氛下回流搅拌所得深红色悬液30分钟。氮气氛下，搅拌使其缓慢(过夜)冷却至室温(约20℃)。
过滤悬液，于滤器上以IMS(520ml×2)洗涤所得深紫色固体。室温真空干燥，然后50℃真空烘箱干燥过夜。产率323.9g，98％。残留溶剂(GCS)THF＝＜0.05％，乙醇＝0.12％。
除微量的残留溶剂存在，目标化合物的NMR及IR图谱基本上同实施例1所示。
实施例5相对溶解度3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸的游离酸(化合物A)及二-(单乙醇胺)盐(化合物B)在三种不同的系统中测其溶解度水，0.1HCl及甲醇中。数据总结于下表1。
表1溶剂 化合物A mg/ml 化合物B mg/ml溶解度25℃ mg/ml mg/ml水 ＜0.001 14.20.1％HCl ＜0.001 ＜0.001甲醇 1.9 6.4本发明范围包括药物组合物，该组合物包括作为活性成分的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)，以及可药用的载体及稀释剂。本发明化合物可口服或非肠胃给药，可制成合适剂型包括片剂、丸剂、粉剂及颗粒剂用于各种给药途径。在这些固体剂型中，活性成分至少与一种惰性稀释剂相混和。按照常规操作，口服制剂也可包括除惰性稀释剂以外的其它物质，如润滑剂、助流剂及抗氧化剂。若制成胶囊、片剂及丸剂，制剂中可包括缓冲剂。片剂及丸剂还可制成持续释放剂型。
尽管也可采用乳剂的非水悬液，本发明的非肠胃给药制剂包括无菌水溶液。这些剂型也可包括佐剂，如防腐剂、润湿剂、渗透剂、缓冲剂、乳化剂及分散剂。其灭菌可采用细菌截留滤器(bacteria retaining filter)过滤，向组合物中加入灭菌剂，照射组合物或加热组合物的方法灭菌。
下述实施例进一步阐释具有本发明特征的药物组合物。
实施例6片剂组合物将乳糖、微晶纤维素、羟基乙酸淀粉钠，硬脂酸镁及3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)按照下表2的比例混和。然后将化合物压成片剂。
表2
实施例7可注射的非肠胃给药组合物可注射给药的3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)制剂的制备方法为，将5.0mg化合物于1.0ml生理盐水中搅拌。
本发明的优选实施方案如上所述，然而应当明白，本发明不局限于此处公开的具体说明，我们保留所有在权利要求
范围内修改的权利。
权利要求
1.化合物3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)。
2.一种药物组合物，包括3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸二-(单乙醇胺)及可药用载体或稀释剂。
3.一种治疗哺乳动物包括人类中血小板减少症的方法，所述哺乳动物需要该治疗，所述方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的权利要求
1所述的化合物。
4.权利要求
3所述的方法，其中哺乳动物为人。
5.一种提高哺乳动物包括人类中血小板生成的方法，所述哺乳动物需要提高血小板生成，所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的权利要求
1所述的化合物。
6.权利要求
5所述的方法，其中哺乳动物为人。
7.权利要求
3所述的方法，其中化合物为口服给药。
8.权利要求
3所述的方法，其中化合物为非肠胃方式给药。
9.一种激动受处理对象中TPO受体的方法，包括施用有效量的权利要求
1所述的化合物。
10.一种制备组合物的方法，该组合物包含可药用载体或稀释剂及有效量的权利要求
1所述化合物，所述方法包括将权利要求
1所述的化合物与可药用载体或稀释剂联合。
11.权利要求
3所述的方法，进一步包括共同施用治疗有效量的药物，该药物选自集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白介素或细胞因子受体激动剂或拮抗剂、可溶性受体、受体激动剂或拮抗剂抗体、或与一个或多个所述药物具有同样作用机制的小分子或肽类。
12.权利要求
11所述的方法，其中药物选自G-CSF、GM-CSF、TPO、M-CSF、EPO、Gro-beta、IL-11、SCF、FLT3配体、LIF、IL-3、IL-6、IL-1、Progenipoietin、NESP、SD-01、IL-8、或IL-5或任何一种所述药物的具有生物活性的衍生物。
13.权利要求
2所述的药物组合物，进一步包括共同施用治疗有效量的药物，该药物选自集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白介素或细胞因子受体激动剂。
14.权利要求
13所述的组合物，其中药物选自G-CSF、GM-CSF、TPO、M-CSF、EPO、Gro-beta、IL-11、SCF、FLT3配体、LIF、IL-3、IL-6、IL-1、IL-5或任何一种所述药物的具有生物活性的衍生物。
15.一种增加捐献者血小板生成的方法，包括在血小板提取、献血或献血小板之前向该捐献者施用治疗有效量的权利要求
1所述的化合物。
16.一种增加捐献者外周血干细胞数量的方法，包括在白细胞分离之前向该捐献者施用治疗有效量的权利要求
1所述的化合物。
17.权利要求
16所述的方法，进一步包括共同施用治疗有效量的动员造血细胞的药物，该药物选自集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白介素或细胞因子受体激动剂、粘附分子拮抗剂或抗体。
18.权利要求
17所述的方法，其中动员药物选自G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、Gro-beta、IL-8、环磷酰胺、VLA-4抑制剂、SCF、FLT3配体或G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、Gro-beta或IL-8的具有生物活性的衍生物。
19.一种体外提高刺激巨核细胞成熟和/或血小板生成的方法，包括向培养表达TPO受体的细胞培养基中加入有效量的权利要求
1所述化合物。
20.一种体外提高刺激巨核细胞成熟和/或血小板生成的方法，包括向培养干细胞、骨髓细胞、脐血细胞或外周血细胞的培养基中加入有效量的权利要求
1所述化合物。
21.权利要求
20所述的方法，其中巨核细胞或血小板在化疗或放疗后回输于哺乳动物体内。
22.一种体外促进培养的干细胞、骨髓细胞、脐血细胞、外周血细胞或其它类型表达TPO受体的细胞存活和/或增殖的方法，包括在含有有效量的权利要求
1所述化合物的培养基中培养所述细胞。
23.权利要求
22所述的方法，进一步包括共同施用治疗有效量的集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白介素或细胞因子受体激动剂。
24.权利要求
22所述的方法，其中干细胞在化疗或放疗后回输于哺乳动物体内。
25.一种治疗哺乳动物包括人类中性白细胞减少症的方法，所述哺乳动物需要该治疗，所述方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的权利要求
1所述的化合物。
26.一种体外促进刺激中性粒细胞生成的方法，包括向培养干细胞、骨髓细胞、脐血细胞、外周血细胞或其它类型表达TPO受体的细胞的培养基中加入有效量的权利要求
1所述化合物。
27.权利要求
26所述的方法，其中中性粒细胞在化疗或放疗后回输于哺乳动物体内。
28.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于化疗或放疗后的骨髓抑制。
29.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于器官移植。
30.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于骨髓、干细胞或肝移植。
31.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于特发性血小板减少性紫癜(ITP)。
32.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于骨髓异常增生综合征(MDS)、再生障碍性贫血或白血病。
33.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于病毒、真菌、微生物或寄生虫感染。
34.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于肝功能障碍。
35.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于外科手术。
36.权利要求
3所述的方法，其中血小板减少症源于抗病毒或抗生素药物的治疗。
37.一种制备权利要求
1所述化合物的方法，该方法包括i)将3’-[(2Z)-[1-(3，4-二甲基苯基)-1，5-二氢-3-甲基-5-氧代-4H-吡唑-4-亚基]肼基]-2’-羟基-[1，1’-联苯基]-3-羧酸溶解于合适的有机溶剂中，得到溶液；ii)向上述溶液中加入2或大于2当量的乙醇胺；及iii)分离制备的化合物。
专利摘要
本发明涉及一种改进的血小板生成素类似物，其为3′－[(2Z)－[1－(3，4－二甲基苯基)－1，5－二氢－3－甲基－5－氧代－4H－吡唑－4－亚基]肼基]－2′－羟基－[1，1′－联苯基]－3－羧酸二－(单乙醇胺)盐。
文档编号C12N5/06GKCN1652842SQ03811370
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月21日
发明者斯蒂芬·穆尔 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan