含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法

专利名称:含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法
技术领域：
本发明涉及含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，其特征在于，以糖化淀粉作为培养基碳源培养具有高度不饱和脂肪酸生成能力的被孢霉(Mortierella)属的微生物(下面称作被孢霉属微生物)，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
背景技术：
在本说明书中，不饱和脂肪酸是指碳链中含有1个或1个以上双键的脂肪酸，其中碳数为18以上而且具有2个或2个以上双键的脂肪酸一般称作“高度不饱和脂肪酸”。高度不饱和脂肪酸，例如有γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十碳三烯酸(mead acid)、6、9-十八碳二烯酸、8、11-二十碳二烯酸等。利用不同的被孢霉属微生物制成的高度不饱和脂肪酸，其大部分为甘油三酸酯的构成脂肪酸，除此之外也生成构成甘油二酸酯、甘油一酸酯、游离脂肪酸、磷类脂物等各种各样的类脂物的脂肪酸。本说明书中的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物是指含有各种各样高度不饱和脂肪酸的类脂物的混合物，所述花生四烯酸生成量是将以所述的各种各样的类脂物的构成脂肪酸存在的花生四烯酸的量换算成游离脂肪酸量得到的值。另外，将由淀粉酶等的糖化酶处理淀粉得到的低聚葡萄糖以及葡萄糖的混合物称为“糖化淀粉”，将用于配制糖化淀粉的淀粉酶等的糖质分解酶称为“糖化酶”，将用该酶处理淀粉称为“糖化处理”。由糖化处理得到的淀粉的分解度称为“糖化度”，糖化度用糖化淀粉的还原糖/全糖表示，例如还原糖/全糖(％)为50％是表示糖化淀粉中的α-葡聚糖的平均链长为2。
从营养学角度考虑，花生四烯酸等高度不饱和脂肪酸作为婴儿发育的必要成分和DHA(二十二碳六烯酸)同时受到了关注。Lanting等跟踪调查出生后3周以上至9岁用母乳喂养和用婴儿奶粉喂养的婴儿，从行动等方面研究脑神经的小的障碍发生率，报告显示用婴儿奶粉喂养的儿童的脑障碍发生率为母乳喂养的儿童的2倍(LANCET，vol.344，1319-1322(1994))。该结果表明母乳中存在而婴儿奶粉中几乎不存在的DHA及花生四烯酸等高度不饱和脂肪酸与婴儿的脑发育有关。除此之外还相继报告了高度不饱和脂肪酸与新生儿的脑和网膜发育有关的结果(Carlson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.901073-1077(1993))、从未成熟儿童和新生儿中的营养学观点考虑这些高度不饱和脂肪酸的重要性受到了重视。
高度不饱和脂肪酸广泛分布在动物界，例如花生四烯酸可以从动物的副肾腺及肝脏中萃取出的类脂物中分离出。但是，由于这些动物内脏中的高度不饱和脂肪酸的含量少，因而认为从动物内脏中萃取分离高度不饱和脂肪酸不是大量提供高度不饱和脂肪酸的有效方法。为此开发了培养各种微生物得到高度不饱和脂肪酸的方法。其中被孢霉属微生物已知是生产含有花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳五烯酸等高度不饱和脂肪酸的类脂物的微生物，开发了使用该微生物的发酵法制造含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的方法(特开昭63-44891、特开昭63-12290、特开昭63-14696、特开昭63-14697)。而且，还知道使用被孢霉属微生物的Δ12不饱和化酶活性低下或丧失的变异株制造二十碳三烯酸的方法(特开平5-91888)。还知道使用对被孢霉属微生物进行变异处理可以得到的，Δ5不饱和化酶活性低下或丧失的变异株，制造二高-γ-亚麻酸的方法(特开平5-91887)。
已知被孢霉属微生物具有淀粉同化能力，但是由于该同化能力比不上葡萄糖同化能力，故葡萄糖作为培养基碳源被广泛使用(Shinmen etal.，Appl.Microbiol.Biotechnol.3111-16(1989)、Aki et al.，JAOCS 78599-604(2001))。另外研究了被孢霉属微生物的淀粉同化能力，结果显示单独分离精制分泌出的淀粉分解酶，这样的淀粉分解酶是α-葡糖苷酶(田中等农艺化学会要旨集1999年3月)。但是α-葡糖苷酶是从α-葡聚糖的非还原末端切出葡萄糖单元的具有分解形式的外型葡萄糖酶，淀粉中代表的高分子量α-葡聚糖的分解活性低，由多个葡萄糖构成的低聚葡萄糖的分解活性高。认为这是被孢霉属微生物的淀粉同化能力比葡萄糖同化能力差的原因之一。另外一方面，在使用葡萄糖作为碳源时，由于培养基中的高浓度葡萄糖产生的渗透压上升，对被孢霉属微生物的菌体增殖及含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的生产性产生不良的影响，因此广泛采用用低浓度葡萄糖培养，为了补足被同化的葡萄糖而在培养基中逐渐添加葡萄糖的方法(流加培养法)(Shinmen et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.3111-16(1989))。另外，也有使用对高浓度的葡萄糖具有耐性的被孢霉属微生物，生产含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的尝试(国际公开号WO98/39468)。
培养基碳源占培养基的原材料费中的大部分，如果能够将其改变成比葡萄糖更廉价的原料，就可以减少含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造经费。使用作为葡萄糖原料的淀粉作为培养基碳源，可以消减原材料费，但是被孢霉属微生物生产的α-葡糖苷酶如上所述分解淀粉的活性低，因此不能充分地同化淀粉。另外，高浓度地含有葡萄糖的培养基使渗透压增高，可能会导致被孢霉属微生物的增殖延迟、含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的生产性低下以及菌形态的变化等。因此使用不在培养中逐渐添加葡萄糖，而使培养开始时就含有高浓度的葡萄糖的分批培养法，难以廉价地制造含有高浓度不饱和脂肪酸类脂物。作为解决该问题的方法，通常使用在培养中逐渐添加葡萄糖的流加培养法，但是流加培养法需要增加用于逐渐添加葡萄糖的装置，而且需要增加培养工序中的操作次数及操作时间，因而增加含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造成本。另外，使用各种淀粉酶酶分解淀粉可以制造葡萄糖，但是酶处理之后需要单独分离·精制葡萄糖，酶处理及单独分离·精制的成本使葡萄糖比淀粉的价值更高。
尽管有报告中提出使用淀粉或可溶性淀粉作为培养基碳源的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的生产(Shinmen et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.3111-16(1989)、Aki et al.，JAOCS 78599-604(2001))，但是含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的生产量比利用每个培养基中的糖质、以同量的葡萄糖作为碳源时低，这是由于淀粉或可溶性淀粉没有完全被同化的缘故。

发明内容
本发明提供一种比现有方法廉价的制造含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的方法，该方法使用比葡萄糖廉价、不使培养基的渗透压上升、而且被孢霉属微生物可以同化的培养基碳源。
被孢霉属微生物生产的α-葡糖苷酶，如上所述分解淀粉的活性低。由于使用淀粉作为培养基碳源，需要将淀粉分解成被孢霉属微生物生产的α-葡糖苷酶容易分解的糖化淀粉。但是当淀粉完全分解成葡萄糖时，由于单糖增加使渗透压上升，对如上的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的生产产生各种不良影响。因此本发明者试想通过选择糖化处理淀粉的糖质分解酶和该酶进行糖化处理的条件，将糖化淀粉中的低聚葡萄糖的平均链长控制在被孢霉属微生物生产的α-葡糖苷酶容易分解的适当的长度。并且本发明者以根据各种糖质分解酶在各种条件下糖化处理淀粉得到的糖化淀粉作为培养基碳源，培养被孢霉属微生物得到的菌体中提取的含有不饱和脂肪酸类脂物的生产性，和作为培养基碳源使用同量的淀粉或葡萄糖进行成批培养时，以及作为培养基碳源添加同量的葡萄糖进行流加培养时的生产性进行比较。结果发现利用糖化淀粉作为碳源培养时比淀粉或葡萄糖作为培养基碳源的成批培养的生产性高，与葡萄糖作为培养基碳源进行流加培养时具有同等的生产性，进而进行了研究直至完成本发明。
本发明也就是涉及(1)一种含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，其特征在于，使用含有糖化淀粉的培养基，培养属于被孢霉(Mortierella)属的微生物，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
(2)如前述(1)记载的制造方法，糖化淀粉是用糖化酶处理淀粉或可溶性淀粉得到的糖化淀粉。
(3)一种含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，其特征在于，使用含有(a)淀粉或可溶性淀粉和(b)糖化酶的培养基，培养属于被孢霉(Mortierella)属的微生物，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
(4)一种含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，其特征在于，使用含有淀粉或可溶性淀粉的培养基，混合培养被孢霉(Mortierella)属微生物和具有糖化酶生产能力的微生物，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
(5)如前述(4)记载的制造方法，其中具有糖化酶生产能力的微生物是属于曲霉(Aspergillus)属的微生物。
(6)如前述(5)记载的制造方法，其中属于曲霉(Aspergillus)属的微生物是米曲霉(Aspergillus oryzae)或川地曲霉(Aspergillus kawachii)。
(7)如前述(1)～(6)记载的制造方法，其中属于被孢霉(Mortierella)属的微生物是属于被孢霉属被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物。
(8)如前述(7)记载的制造方法，其中属于被孢霉亚属(subgenusMortierella)的微生物是高山被孢霉(Mortierella alpina)或葱状被孢霉(Mortierella alliacea)。
(9)如前述(1)～(8)记载的制造方法，其中高度不饱和脂肪酸是选自γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十碳三烯酸、6、9-十八碳二烯酸以及8、11-二十碳二烯酸中的1种或1种以上的脂肪酸。
具体实施方式
本发明中使用的微生物只要是属于能够生产含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的被孢霉(Mortierella)属的微生物，任何一种微生物都可以。这样的微生物可以使用例如MYCOTAXON，Vol.XLIV，No.2，pp.257-265(1992)记载的菌株，具体例如长形被孢霉(Mortierellaelongata)IF08570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierellaalpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属于被孢霉亚属(subgenusMortierella)的微生物；深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、矮被孢霉(Mortierella nana)IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)IFO5426、IFO81 86、CBS1 12.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡萄酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236.82等属于微小毛霉亚属(subgenus Micromucor)的微生物。
这些菌株都可以从大阪市财团法人发酵研究所(IFO)以及美国American Type Culture Collection(ATCC)以及荷兰Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)无限制地得到。也可以使用本发明者从土壤中分离的菌株长形被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703号)(微工研条寄第1239号)。这些属于培养基型(type cultures)的菌株或者从自然界分离的菌株可以直接使用。另外，本发明中使用的上述微生物也可以是被孢霉属微生物(野生株)的变异株或基因改组株。其中，优选变异株或基因改组株，其在与野生株相同的培养条件下培养时，和原来的野生株生产的高度不饱和脂肪酸类脂物的量相比，类脂物中的特定的或全部的高度不饱和脂肪酸含量增多，或者总类脂物量增多，或者可以实现两者。类脂物中的特定的高度不饱和脂肪酸含量增多的变异株，例如Δ12不饱和化酶活性丧失的高山被孢霉SAM1861(微工研条寄第3590号、FERM BP-3590)、Δ5不饱和化酶活性丧失的高山被孢霉SAM1861(微工研条寄第3589号、FERM BP-3589)。另外，也可以使用对高浓度葡萄糖具有耐性的被孢霉属SAM2197(FERM BP-6261)。
本发明中所述的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，例如有三种方式(i)使用含有糖化淀粉的培养基培养上述的被孢霉属微生物，从培养物提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物；或者(ii)使用含有(a)淀粉或可溶性淀粉以及(b)糖化酶的培养基培养上述被孢霉属微生物，从培养物提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物；或者(iii)使用含有淀粉或可溶性淀粉的培养基，混合培养上述的被孢霉属微生物和具有糖化酶生产能力的微生物(下面称作生产糖化酶微生物)，从培养物提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。下面对各种方式分别进行说明。
下面说明本发明的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法中的第一方式，该方式的特点在于，使用含有糖化淀粉的培养基培养上述的被孢霉属微生物，从培养物提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。其优点在于，通过使用预先糖化处理淀粉得到的糖化淀粉作为培养基碳源，容易被被孢霉属微生物同化，而且抑制培养基的渗透压上升，可以使每个同等碳源的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的收率提高。
本方式中的被孢霉属微生物的单一培养，除使用糖化淀粉作为培养基碳源之外，可以按照通常的方法进行。例如，将上述被孢霉属微生物的孢子、菌丝或预先培养得到的前培养液在液体培养基或固体培养基中接种培养的方法。
该方式中的微生物培养用培养基，只要是含有糖化淀粉作为培养基碳源就可以没有特别限定。其中用作培养基碳源的糖化淀粉，优选制成培养的被孢霉属微生物生产的α-葡糖苷酶最容易分解的糖化度、即糖化淀粉中的低聚葡萄糖的平均链长。具体来说，考虑渗透压上升和被孢霉属微生物可以同化的糖化淀粉中的低聚葡萄糖的链长，使用还原糖/全糖比、也就是糖化度大约为20～90％左右、优选使用大约30～90％左右的糖化淀粉。
前述糖化淀粉，可以用糖化酶处理淀粉或可溶性淀粉得到，而且通过糖化酶的选择和设定该酶进行的糖化处理的条件，可以得到上述希望的糖化度的糖化淀粉。糖化酶只要是可以分解淀粉等的糖质分解酶就可以没有特别限定，但是优选具有无规的分解样式的α-淀粉酶等的内型淀粉酶或者从淀粉分子的末端以麦芽糖单元切出的β-淀粉酶等的外型淀粉酶。另外，也可以组合使用不同作用机制的糖化酶。用于糖化处理的糖化酶，培养生产该糖化酶的微生物，可以利用公知的方法从该培养液中得到该酶。也可以使用市售的糖化酶。市售的糖化酶，例如有淀粉酶AD“天野”1(天野酶株式会社制)等α-淀粉酶、或者支链淀粉酶“天野”3(天野酶株式会社制)等支链淀粉酶等。而且前述糖化淀粉也可以用酸分解淀粉或可溶性淀粉等其他公知的方法得到。用酸分解淀粉或可溶性淀粉得到糖化淀粉的分解法适合的实例例如使用草酸处理。而且前述糖化淀粉也可以使用市售的糖化淀粉。市售的糖化淀粉，例如有富士糖浆(fujisyrup)C-75、富士糖浆C-75、HMTP-75或A-75(都是加藤化学公司制)等。这些市售的糖化淀粉因为各自糖化度不同，故可以选择适合本发明实施的糖化淀粉。
本方式中使用的微生物培养用培养基中，作为补充糖化淀粉的辅助原料也可以含有例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、甘油、甘露糖醇或柠檬酸等一般使用的培养基碳源。另外，作为培养基氮源，例如大豆粉、大豆片、脱脂大豆粉、食用大豆蛋白质、大豆缩氨酸、奎宁粉、蛋白胨、酵母膏、麦芽膏、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆或者尿素等有机氮源、或者硝酸铵或硫酸铵等无机氮源也可以含在本实施方式中使用的微生物培养用培养基中。其中，培养基氮源优选对脱脂大豆进行热改性的物质，特别优选在大约70～90℃下热处理脱脂大豆，再除去乙醇可溶成分的物质。
而且，本实施方式使用的微生物培养中也可以含有磷酸、钾、钠、镁、和/或钙构成的无机盐类，或者铁、铜、锌、锰、镊、钴等的金属离子或维生素等微量营养源。其中，优选含有选自磷酸、钾、钠、镁及钙中的1种或1种以上的无机盐类。
另外，为了增加高度不饱和脂肪酸的收率，作为高度不饱和脂肪酸的前驱物，本实施方式中使用的微生物培养用培养基中也可以含有例如十六烷或十八烷类的烃；油酸或亚麻酸类脂肪酸或其盐、三酰基甘油、或者例如乙脂、脂肪酸甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯类的脂肪酸酯；橄榄油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油类的油脂类。所述化合物可以单独含有1种，也可以含有2种或2种以上。
上述的碳源、氮源、其他的培养基成分可以添加在培养开始前的培养基和/或培养中的培养基中。这些培养基成分可以一次添加，也可以连续地或者分多次随时添加。这些培养基成分可以分别单独或预先混合，杀菌后添加，该杀菌方法、添加顺序没有限制。碳源和氮源优选分别杀菌，盐类优选在对数增殖结束之前、优选在对数增殖中期前添加。对于不影响磷酸离子、钾离子、钠离子、镁离子、钙离子浓度的其他的培养基成分只要是不妨碍被孢霉属微生物生育的浓度就可以，其添加时间没有特别限定。
从实用上来看，一般设定碳源的总添加量为大约0.1～40重量％左右、优选大约1～25重量％左右；氮源的总添加量为大约0.01～10重量％左右、优选大约0.1～10重量％左右的浓度，特别优选初次的碳源添加量为约1～12重量％左右、初次的氮源添加量为约0.1～8重量％左右，也可以在培养过程中添加碳源和氮源。另外，上述的高度不饱和脂肪酸的前驱物的添加量相对于培养基为约0.001～10重量％左右、优选约0.5～10重量％左右。
培养条件没有特别限定，可以按照通常的方法进行。例如培养温度为约5～40℃左右，优选约20～30℃左右。另外，也可以在约20～30℃左右条件下使被孢霉属微生物增殖后，在大约5～20℃左右的条件下继续培养使其生产高度不饱和脂肪酸。另外，培养基pH为约4～10左右，优选约5～8左右。培养方法例如有通气搅拌培养、振荡培养、或者静置培养等。通常培养需要约2～20天左右。这样培养之后，被孢霉属微生物内生成蓄积含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。本发明优选利用液体培养基进行通气搅拌培养。
然后，从如上所述得到的培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。所述“培养物”例如有通过培养制造类脂物的过程中的培养液或者其杀菌后的培养液，或者培养结束后的培养液或其杀菌后的培养液，或者分别集菌得到的培养菌体或其干燥物等。从上述培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的方法，可以使用公知的方法。例如可以利用下面的方法从培养菌体中提取目的产物类脂物。
培养结束后，利用离心分离和/或过滤等常用的固液分离方式从培养液得到培养菌体。培养菌体优选水洗、破碎、干燥。干燥可以利用冷冻干燥、风干等。干燥菌体优选在氮气流下利用有机溶剂进行萃取处理。有机溶剂可以使用乙醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等。另外，通过甲醇和石油醚的交替萃取和使用氯仿—甲醇—水的一层的溶剂进行的萃取可以得到良好的效果。其中优选使用己烷进行萃取。在减压条件下从萃取物中蒸馏除去有机溶剂，由此可以得到含有高浓度的高度不饱和脂肪酸的类脂物。另外，代替上述方法可以使用湿菌体进行萃取。这种情况下使用甲醇、乙醇等对水具有相溶性的溶剂、或者这些和水和/或其他的溶剂组成的对水具有相溶性的混合溶剂。其他的步骤和上述相同。
下面说明本发明的高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法中的第二方式，该方式的特征在于，使用含有(a)淀粉或可溶性淀粉以及(b)糖化酶的培养基培养上述被孢霉属微生物，从培养物提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。在本方式中使用由糖化酶从培养基中含有的淀粉或可溶性淀粉生成的糖化淀粉作为培养基碳源。也就是在本方式中，同时进行淀粉的糖化处理和被孢霉属微生物的培养。更具体的是向以淀粉或可溶性淀粉作为碳源的培养基中添加糖化酶，使淀粉或可溶性淀粉变化成被孢霉属微生物生产的α-葡糖苷酶容易分解的糖化淀粉，被孢霉属微生物使利用前述α-葡糖苷酶从该糖化淀粉生成的葡萄糖同化，制造含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
该方式中使用的淀粉没有特别限定，具体来说例如有米淀粉、甘蔗淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉或者玉米淀粉、或者这些化工淀粉及α化淀粉等。淀粉中可以溶于热水中的称作可溶性淀粉。
本方式中使用的糖化酶，例如只要是糖化处理中使用的酶就可以使用。具体来说例如可以使用和上述第一方式相同的从生产糖化酶的微生物中配制的糖化酶和市售糖化酶。本方式中使用的糖化酶和第一方式同样适合采用具有无规的分解样式的α-淀粉酶等的内型淀粉酶、和从淀粉分子的末端以麦芽糖单元切出的β-淀粉酶等，也可以使用从非还原末端逐渐分解产生葡萄糖的葡萄糖淀粉酶等外型淀粉酶。利用葡萄糖淀粉酶生成的葡萄糖可以直接通过被孢霉属微生物被同化，因而对培养基的渗透压上升没有不良影响。
本方式除了取代糖化淀粉使用(a)淀粉或可溶性淀粉以及(b)糖化酶作为培养微生物培养基成分之外，其他和上述第一方式完全相同。另外，在本方式中的培养微生物的培养基成分中也可以含有上述的糖化淀粉。
下面说明本发明的高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法中的第三方式，该方式的特征在于，使用含有淀粉或可溶性淀粉的培养基，混合培养上述的被孢霉属微生物和生产糖化酶的微生物，从培养物提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。本方式中使用糖化淀粉作为培养基碳源，该糖化淀粉是利用生产糖化酶的微生物从培养基中含有的淀粉或可溶性淀粉生成的糖化酶生成的。也就是本方式中在以淀粉或可溶性淀粉为培养基碳源的培养基中，和被孢霉属微生物同时通过混合培养上述糖化处理中使用的生产糖化酶的微生物，使其生成糖化淀粉，被孢霉属微生物从该糖化淀粉制造含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
本方式中将被孢霉属微生物作为主要的微生物培养，以生产糖化酶的微生物作为辅助微生物培养。前述生产糖化酶的微生物只要是分泌糖化酶的微生物就可以使用，例如可以使用属于曲霉(Aspergillus)属、根霉(Rhizopus)属及属于木霉(trichoderma)属的丝状菌、杆菌(Bacillus)属、微杆菌(Microbacterium)属及克氏杆菌(Klebsiella)属的细菌。其中，生产糖化酶的微生物优选生产α-淀粉酶的属于曲霉属的微生物，特别优选米曲霉(Aspergillus oryzae)或川地曲霉(Aspergilluskawachii)。另外，分泌上述葡萄糖淀粉酶的微生物适合用作辅助微生物。分泌葡萄糖淀粉酶的微生物，例如有曲霉属微生物和根霉属微生物等。通过单一培养具有生产糖化酶能力的被孢霉属微生物的变异株或改基因组株，可以得到和生产糖化酶的微生物混合培养的相同效果。
本实施方式代替糖化淀粉使用淀粉或可溶性淀粉作为微生物培养基成分，代替单一培养被孢霉属微生物混合培养被孢霉属微生物和生产糖化淀粉的微生物，除此之外，和上述第一实施方式完全相同。另外，在本实施方式中的培养微生物的培养基成分中也可以含有上述的糖化淀粉。这种情况优选糖化淀粉的糖化度、即还原糖/全糖比约为0～80％左右，优选约0～70％左右。另外，被孢霉属微生物和生产糖化酶的微生物混合培养时，可以同时开始培养两微生物，也可以在预先培养一类微生物至特定程度后，添加另外一类微生物，进行混合培养。
利用这样的方法得到的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物，可以应用在动物用饲料或食品等各种用途。这里所述类脂物中优选含有γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十碳三烯酸、6、9-十八碳二烯酸以及8、11-二十碳二烯酸中的1种或1种以上的高度不饱和脂肪酸脂。这样的高度不饱和脂肪酸可以利用通常的方法，溶剂萃取、脱溶剂后，利用脱酸、脱色、脱臭、脱胶处理，或冷却分离等进行分离精制。
实施例下面按照实施例详细说明本发明，但本发明不限于这些具体实施例。另外培养基中的成分组成都用重量％表示。
(实施例1)使用被孢霉属SAM2197(FERM BP-6261)作为花生四烯酸生产菌。
将表1中的培养基1-A、1-B、1-C各取出5L配置于10L容积的培养槽中，使预先通过烧瓶培养配制的前培养液接种培养。培养基1-A中的淀粉酶处理的淀粉是向淀粉中添加α-淀粉酶(和光纯药株式会社制、制品编码号011-16881)，在37℃下孵化30分钟得到的。还原糖利用索模吉-纳尔逊(Somogyi-Nelson)法测定，全糖利用苯酚硫酸(Pohenol-H2SO4)法测定。测定的结果，培养基1-A的淀粉酶处理的淀粉的还原糖/全糖比为38％、培养基1-B的可溶性淀粉的还原糖/全糖比为0％。
通风搅拌培养7天之后，各个培养基中得到的花生四烯酸的生产量为培养基1-A为4.2g/L、培养基1-B为1.2g/L、培养基1-C为4.3g/L。花生四烯酸生成量按照如下进行计算。也就是用滤纸过滤培养液，回收菌体块，在105℃下干燥菌体之后进行称量。干燥后的称量值除以供给过滤的培养液量，求得干燥菌体浓度。将干燥菌体片约20mg在螺纹口试验管中精确称量，向其中添加盐酸甲醇2mL和二氯甲烷1mL，使其在50℃反应3小时。反应之后添加己烷萃取脂肪酸甲酯，并减压浓缩回收的己烷层。将得到的脂肪酸甲酯溶解在特定量的乙腈中，用气相色谱分析，从峰面积定量各脂肪酸甲酯。定量结果除以菌体片精确称量值，求得每个干燥菌体的各脂肪酸的含量。得到的各脂肪酸含量乘以干燥菌体浓度求得各脂肪酸生成量。
表1


从表1可知，在采用可溶性淀粉的培养基中，花生四烯酸生成量低，通过使用淀粉酶处理淀粉得到的糖化淀粉，可以得到和葡萄糖培养基相同的高的花生四烯酸生成量。
(实施例2)使用被孢霉属SAM2197(FERM BP-6261)作为花生四烯酸生产菌。将可溶性淀粉24％、酵母膏1.5％的培养基50mL配置于500mL烧瓶中。在培养基50mL中接种被孢霉属SAM2197的孢子1×105个，使各种量的米曲霉(Aspergillus oryzae)的孢子悬浊液接种，在160rpm、28℃下培养7天。为了比较，和上述相同地配制葡萄糖12％、酵母膏1.5％的培养基，接种培养被孢霉属SAM2197(FERM BP-6261)。培养第5天添加葡萄糖12％，在160rpm、28℃下培养7天。培养结果如表2所示，米曲霉的孢子悬浊液接种量为0.1mL时花生四烯酸生成量为0.56g/L，达到最大，这是接近被孢霉属的单一培养中使用可溶性淀粉时(0.3g/L)的2倍的值，而且和单一培养中使用葡萄糖作为碳源时具有相同的生成量。当曲霉属的孢子接种量达到1mL时，花生四烯酸生成量低下，这显示由于曲霉属的增殖的影响，有时被孢霉属的增殖受到抑制，在被孢霉属微生物和生产糖化酶的微生物混合培养时优选前者为主要的微生物培养。
表2


(实施例3)使用高山被孢霉(Mortierella alpina)CBS754.68作为花生四烯酸生产菌。将表3中所示的各种含有糖4.5％、酵母膏1％的培养基50mL配置于500mL容积的烧瓶中，接种培养孢子1×103个。在100rpm、28℃下培养5天。糖化淀粉(2)、(7)和(8)的糖化处理方法是向淀粉中添加α-淀粉酶和支链淀粉酶，在37℃下孵化30分钟。使用淀粉酶AD“天野”1(天野酶株式会社制)作为α-淀粉酶，使用支链淀粉酶“天野”3(天野酶株式会社制)作为支链淀粉酶。
培养结果显示，可以得到如表3所示的花生四烯酸生成量，上述的糖化度存在优选的范围。
表3


碳源明细(1)松谷化学制、スタビロ—ズ(stabilose)K
(2)用α-淀粉酶和支链淀粉酶糖化处理淀粉的产物(3)加藤化学公司制、富士糖浆C-75S(4)加藤化学公司制、富士糖浆C-75(5)加藤化学公司制、HMTP-75(M-70)(6)加藤化学公司制、A-75(7)用α-淀粉酶和支链淀粉酶糖化处理淀粉的产物(8)用α-淀粉酶和支链淀粉酶糖化处理淀粉的产物(实施例4)使用高山被孢霉(Mortierella alpina)CBS754.68作为花生四烯酸生产菌。利用以酵母膏和葡萄糖作为营养源的培养基进行种培养，在50L容积培养槽中配制的本培养的培养基中接种。本培养的培养基组成在表4所示的4-A、4-B、4-C的3种糖组成下实施，糖以外的共同的培养基组成在大豆粉4％、大豆油0.1％、KH2PO40.3％、Na2SO40.1％、CaCl2·2H2O 0.05％、MgCl2·6H2O 0.05％下培养。另外，使用的糖化淀粉的还原糖/全糖比为30％。
培养10天的结果，分别得到培养基4-A为13.5g/L、4-B为7g/L、4-C为13.3g/L的花生四烯酸生成量。从该结果可知，通过使用糖化淀粉可以避免高浓度葡萄糖的增殖障碍，降低流加次数而减少培养成本。
表4


(实施例5)使用高山被孢霉SAM1861(微工研条寄第3590号、FERM BP-3590)作为二十碳三烯酸生产菌，使用高山被孢霉SAM1860(微工研条寄第3589号、FERM BP-3589)作为二高-γ-亚麻酸生产菌。将表5所示的3种培养基50mL配制在500mL容积烧瓶中，接种1×103个孢子，开始培养。在24℃、100rpm条件下培养7天。
表5


(*)使用还原糖/全糖比＝35％的糖化淀粉在使用可溶性淀粉的培养基中，二十碳三烯酸生产、二高-γ-亚麻酸生产同时得到低产量，但是通过使用糖化淀粉可以得到和葡萄糖培养基相同的高产量。
工业上利用的可能性本发明在培养被孢霉属微生物时使用比现有的葡萄糖廉价的淀粉等作为培养基碳源，可以降低培养基原材料费，进而可以削减含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造经费。另外，通过使用糖化淀粉作为培养基碳源，可以抑制培养基的渗透压上升，增加每个相同碳源的含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的收率。这样由于可以抑制渗透压的上升，本发明与使用葡萄糖作为培养基碳源的情况不同，未必需要进行流加培养法，可以省略培养工序的设备、操作次数和操作时间，进而可以消减含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造成本。
权利要求
1.一种含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，其特征在于，使用含有糖化淀粉的培养基培养属于被孢霉(Mortierella)属的微生物，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
2.如权利要求
1所述的制造方法，其中糖化淀粉是用糖化酶处理淀粉或可溶性淀粉得到的糖化淀粉。
3.一种含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，其特征在于，使用含有(a)淀粉或可溶性淀粉和(b)糖化酶的培养基培养属于被孢霉(Mortierella)属的微生物，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
4.一种含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的制造方法，其特征在于，使用含有淀粉或可溶性淀粉的培养基，混合培养被孢霉(Mortierella)属微生物和具有糖化酶生产能力的微生物，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
5.如权利要求
4所述的制造方法，其中具有糖化酶生产能力的微生物是属于曲霉(Aspergillus)属的微生物。
6.如权利要求
5所述的制造方法，其中属于曲霉(Aspergillus)属的微生物是米曲霉(Aspergillus oryzae)或川地曲霉(Aspergilluskawachii)。
7.如权利要求
1～6所述的制造方法，其中属于被孢霉(Mortierella)属的微生物是属于被孢霉属被孢霉亚属(subgenusMortierella)的微生物。
8.如权利要求
7所述的制造方法，其中属于被孢霉亚属(subgenusMortierella)的微生物是高山被孢霉(Mortierella alpina)或葱状被孢霉(Mortierella alliacea)。
9.如权利要求
1～8所述的制造方法，其中高度不饱和脂肪酸是选自γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十碳三烯酸、6、9-十八碳二烯酸以及8、11-二十碳二烯酸中的1种或1种以上的脂肪酸。
专利摘要
本发明提供一种比现有方法廉价的制造含有高度不饱和脂肪酸的类脂物的方法，其特征在于，使用比葡萄糖廉价、不使培养基的渗透压上升、而且被孢霉属微生物可以同化的糖化淀粉作为培养基碳源，培养属于被孢霉(Mortierella)属的微生物，从培养物中提取含有高度不饱和脂肪酸的类脂物。
文档编号C12P7/64GKCN1650023SQ03809394
公开日2005年8月3日 申请日期2003年4月25日
发明者小埜和久, 科庸裕, 东山坚一 申请人:三得利株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan