专利名称:一种培育转基因小麦的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域中一种培育转基因植物的方法及其应用，特别涉及一种培育转基因小麦的方法及其应用。
背景技术：
小麦是最重要的粮食作物之一，是人类食物和营养的基本来源。目前全世界小麦播种面积约2.26亿公顷，总产量约5.5亿吨。在我国北方，小麦是种植面积最大的粮食作物。但目前我国小麦的生产面临着干旱、盐碱和病虫害的威胁，同时还存在着加工品质欠佳的问题。这些难题的解决有赖于小麦基因工程的进展。
由于小麦的遗传背景较其它作物复杂，遗传转化困难，因此是三个重要的禾本科作物中最后一个获得转基因成功的。尽管从1992年以来利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法、PEG法、电激法和激光微束法分别获得了转基因小麦，但其转化率均未超过6％。由基因枪法等物理转化方法获得的转基因小麦存在外源基因的拷贝数多、再生困难和不育等缺陷。小麦转化技术已成为限制小麦基因工程研究发展的重要因素。由于这种限制，至今已获得的有经济价值的转基因小麦极其有限。与其它转化方法相比，农杆菌介导的转化具有操作简便、不需特殊的仪器、比较短的培养周期、更重要的是外源基因插入的低拷贝性和完整性以及转基因植株可育植株比例高等优点。因此建立一套农杆菌介导的高效小麦转化系统以突破小麦基因工程的瓶颈具有重要的意义和巨大的应用价值。
以往人们认为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主而不能被其转化。然而90年代以来，农杆菌介导的转化在水稻、玉米、大麦等农作物中的成功表明这种转化技术有希望成为常规的技术。特别是最近的研究揭示，T-DNA从农杆菌到单子叶植物的转移与到双子叶植物的转移具相同的分子机制。这便为利用农杆菌介导法转化其它目前尚未成功的单子叶植物，如小麦等提供了理论依据。
农杆菌介导的小麦遗传转化一直是国内外相关领域的难点和热点。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次报道了以小麦幼胚和胚性愈伤组织为外植体获得了农杆菌介导的转基因(nptII)再生植株。他们对影响农杆菌介导转化的一些因素，如外植体类型、农杆菌细胞浓度、接种和共培养时间、共培养所用培养基、表面活性剂应用、共培养诱导化合物、转化体选择等方面进行了研究，提出了一套较为成熟的转化系统。1999年2月17日公开的公开号为1208437，名称为“农杆菌介导转化法生产稳定转化的可育小麦的方法及其相关组分”的中国专利申请中，提供的外植体包括新鲜分离或预培养的未成熟胚、胚发生性愈伤组织及悬浮细胞。1999年我国的夏光敏也报道了用农杆菌介导法将nptII基因导入小麦幼胚和胚性愈伤组织，得到转基因植株，转基因频率达到3.7-5.9％，明显高于其它小麦转化研究。但这些转化方法均需经过组织培养再生植株。已有的研究表明小麦不同基因型的受体材料对植株再生有显著影响。目前已知小麦幼胚和胚性愈伤组织的再生能力较高，但受基因型的限制很大，而我国多数生产用小麦当家品种，由愈伤组织分化再生非常困难，这限制了需经组织培养途径进行遗传转化技术的应用。
转基因植物在美国已形成产业，而且产值增长迅速，如2001年美国种植业中已有超过40％的面积种植的是转基因植物。这说明转基因植物有巨大的市场需求潜力。在目前已形成的生产能力中，易于被农杆菌介导转化的植物如马铃薯、番茄和油菜等的产值占据了主要份额，而农杆菌介导转化困难的作物如小麦至今仍未得到有生产应用价值的转基因品种。研制小麦等重要粮食作物的农杆菌介导的高效转化系统，具有重要的理论和实践意义。
发明创造内容本发明的目的是提供一种简单、快速、实用的培育转基因小麦的方法，利用该方法培育转基因小麦不需经过组织培养和植株再生的过程。
本发明所提供的培育转基因小麦的方法，是通过农杆菌的介导将外源基因导入小麦生长点，通过非组培遗传转化方法得到转基因小麦。
生长点可为根尖生长点、茎尖生长点，优选为茎尖生长点。
所述遗传转化的外植体为小麦种子23-27℃萌发48-72小时得到的茎尖生长点。
携带有外源基因的农杆菌需先在80-120μM乙酰丁香酮中培养1-3小时，再在0.03-0.05Mpa真空度下，感染外植体8-12分钟。然后将被感染的外植体转入合适培养基中，如MS培养基，在22-25℃、14-16/10-8小时光周期下共培养2-4天得到转基因小麦幼苗。
本发明的方法与其它培育转基因小麦方法的显著区别在于采用小麦生长点作为农杆菌介导的遗传转化的外植体，而不是未成熟胚或胚性愈伤组织或悬浮细胞，不需经过组织培养和植株再生的过程，从根本上克服了由于小麦基因型对转化后形成可育再生植株的限制。
本发明通过对局部人工损伤的小麦生长点采用真空渗入技术进行农杆菌介导的遗传转化，获得了表达报告基因的转基因小麦，生长点转化率达到60-70％，成苗率平均90％，T0代种子卡那霉素抗性阳性率为16-21％，T1代幼苗报告基因表达阳性率占所测植株的81％。尤为重要的是克服了小麦遗传转化的瓶颈问题-基因型的限制。本发明所试材料的品种包括小麦金花、小麦京411、小麦4071，均获得上述效果。
本发明的方法转化效率高、操作简便、重复性好、不依赖于受体的基因型。
本发明的方法可以培育出各种高产、优质和/或抗逆性强的小麦新种质；非组培遗传转化方法可应用到其它受基因型限制大难以获得转基因植株的单子叶农作物中，可以培育高产、抗逆、优质的新型农作物。
具体实施方式
实施例1、转基因小麦的培育1、小麦外植体的处理(1)将金花、京411和京4071三种小麦品种的小麦种子用10％的次氯酸消毒5分钟，再用70％的乙醇处理10分钟，然后用无菌水冲洗3次。在一无菌大平皿中垫三层以无菌水浸湿的纱布，将经消毒处理的小麦种子置于平皿中25℃黑暗中萌发48小时，得到待转化的小麦萌发种子。
(2)在无菌条件下用解剖针将待转化的小麦萌发种子胚芽鞘划开，尽量暴露其生长点，以便于外源基因的导入。
2、转化用农杆菌的培养(1)将过夜培养的农杆菌菌株LBA4404/3301，其中含CaMV 35S启动子驱动的GUS基因，1ml接种于100ml含链霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB培养基中，28℃，300rpm振荡培养至菌液浓度为OD600nm＝0.7。
(2)在转化前向菌液中加入乙酰丁香酮至100μM，继续在28℃，300rpm振荡培养2小时。将上述菌液分装于50ml的无菌三角瓶中，每瓶20ml。
3、转化(1)将步骤1的(2)中的小麦生长点浸入步骤2的(2)中的菌液中，侵染20分钟后，置于负压条件下，真空度0.04Mpa，渗透10分钟。
(2)真空渗透处理后，倒除菌液，用无菌吸水纸将小麦外植体表面的菌液吸净，转入含羧苄基青霉素的MS培养基中，22-25℃、16/8小时光周期下共培养3天。
4、生长点转化后3天报告基因的瞬时表达及转化率检测(1)GUS基因表达的组织化学检测将转化3天的小麦幼苗置于含1％甲醛、50mM pH7.0的磷酸钠缓冲液和0.05％Triton X-100的固定液中，室温下温和摇动30分钟；倒掉固定液，再以50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗3次；将幼苗转入含2mM X-Glue，50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)和0.05％Triton X-100的染色液中，37℃保温8小时；之后转移至75％乙醇中脱色4小时，然后在解剖镜下观察。
(2)报告基因表达结果小麦金花、小麦京411、小麦4071三种小麦品种转化后均有GUS基因表达的蓝色显色反应。如表1所示，小麦金花、小麦京411和小麦4071的表达率分别为61.3％、64.3％和65.8％。
表1、三种小麦品种GUS基因表达情况
5、生长点转化后的培育和成苗将共培养3天后的小麦幼苗移入以铚石为基质的花盆中，在25℃、60％相对湿度、16/8小时光周期的培养室中培养3-4周后成苗，然后转入自然光温室中栽种，约90％的苗正常结实。
6、T0代种子的筛选以50mg/L卡那霉素对T0代种子进行筛选，经4小时浸泡后置于平皿中25℃黑暗中萌发48小时，结果如表2所示，小麦金花、小麦京411和小麦4071的表达率分别为61.3％、64.3％和65.8％。
表2 三种小麦品种的T0代种子萌发情况
7、T1代报告基因表达的检测经卡那霉素筛选后萌发的种子转移到以铚石位为基质的花盆中，在25℃、60％相对湿度、16/8小时光周期的培养室中培养。待长出第三片叶时，取第一片叶按照步骤4的(1)中的方法检测报告基因的表达，报告基因表达阳性率占所测植株的81％(22/27)。
权利要求
1.一种培育转基因小麦的方法，是通过农杆菌的介导将外源基因导入小麦生长点，通过非组培遗传转化方法得到转基因小麦。
2.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述生长点为根尖生长点或茎尖生长点。
3.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述遗传转化的外植体为小麦种子23-27℃萌发48-72小时得到的茎尖生长点。
4.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述携带有外源基因的农杆菌先在80-120μM乙酰丁香酮中培养1-3小时，再转染外植体。
5.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于所述先在80-120μM乙酰丁香酮中培养1-3小时的农杆菌在0.03-0.05Mpa的真空度下，感染外植体8-12分钟。
6.根据权利要求
5所述的方法，其特征在于所述被感染的外植体转入培养基中，在22-25℃、14-16/10-8小时光周期下共培养2-4天得到转基因小麦幼苗。
7.根据权利要求
6所述的方法，其特征在于所述培养基为MS培养基。
8.非组培遗传转化方法在培育高产和/或优质小麦种质中的应用。
9.非组培遗传转化方法在培育抗逆小麦种质中的应用。
专利摘要
本发明公开了一种培育转基因小麦的方法及其应用。其目的是提供一种不需经过组织培养和植株再生过程的培育转基因小麦的方法。本发明所提供的培育转基因小麦的方法，是通过农杆菌的介导将外源基因导入小麦生长点，通过非组培遗传转化方法得到转基因小麦。用本发明的方法可以培育出各种高产、优质和/或抗逆性强的小麦新种质。
文档编号A01H1/00GKCN1580257SQ03153280
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月13日
发明者麻密, 李江川, 王剑虹, 朱至清, 屈贵平 申请人:中国科学院植物研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan