专利名称:抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY及其组合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY及其制备方法，特别是涉及用于预防和治疗非典型肺炎的多种组合的复合IgY及其制备方法和组合制剂。
目前世界上治疗非典型肺炎(SARS)的方法主要是使用抗病毒药物[如Ribavirin(三氮唑核苷)等]和糖皮质激素以及抗生素或中草药。目前，全世界尚无真正对病毒有确切疗效的化学药物，而且普遍存在严重的副作用。加拿大卫生部根据加拿大与美国疾病控制及预防中心专家的临床经验，以及Ribavirin(三氮唑核苷)对引发疾病的冠状病毒无效的测试，加上不少严重的药物反应报告，已于2003年5月1日宣布停止使用Ribavirin(三氮唑核苷)。使用糖皮质激素会使人体的免疫系统受损，大剂量使用糖皮质激素往往是导致病人最后对药物毫无反应，最后无药可救而死亡的主要原因。中草药对非典型肺炎(SARS)只有调理作用，很难有确切有效的治疗效果。
IgY(Immunoglobulin of Yoik)属IgG类免疫球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(为某些细菌或病毒)的状态或活性，并通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细菌或病毒的吞噬；它能与病毒结合，改变病毒表面的构象，阻止病毒吸附于易感细胞，同时，形成的病毒-IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。
由于IgY能够特异性与病原体结合并将其有效抑制，就可以克服抗病毒化学药物对病毒实际杀灭作用不大、而对人体毒副作用又十分明显的致命缺点，从而达到有的放矢地从发病根源上预防和治疗由变异的冠状病毒这种病原体引发的非典型肺炎(SARS)的目的。
技术内容本发明的目的是提供一种直接抑制非典型肺炎(SARS)主要致病病毒的特异性IgY及其制备方法；本发明的目的还在于提供一种由可直接抑制非典型肺炎(SARS)主要致病病毒的特异性IgY制成的天然安全又具有特效作用的、预防和治疗非典型肺炎(SARS)的新型组合制剂。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的(1)优选引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒根据世界卫生组织(WHO)的确认，冠状病毒的一个变种是引发非典型肺炎(SARS)的病原体。但是，在抽取含有冠状病毒的样本进行基因分析中发现，这种病毒变异速度快，仅香港就已发现4种非典型肺炎(SARS)冠状病毒的病源。本发明根据基因图谱分析不同国家和地区的非典型肺炎(SARS)冠状病毒的基因排序的结果，按大致相似的原则进行分类组合，选取有明显差异的几种非典型肺炎(SARS)冠状病毒作为代表性的主要致病病毒。现优选香港的4种不同的非典型肺炎(SARS)冠状病毒以及北京传播的和加拿大传播的共6种非典型肺炎(SARS)冠状病毒作为代表性的非典型肺炎(SARS)病原体。今后，随着这种冠状病毒在人传人的过程中不断变异，以及对这种冠状病毒基因排序组合工作的进一步完善和深入，可以及时调整和变更代表性的非典型肺炎(SARS)的病原体组合。另外，也可以按照不同国家和地区编组，选取不同的SARS冠状病毒组合，如香港组(若干型组成)、北京组(若干型组成)、加拿大组(若干型组成)等等。
(2)非典型肺炎(SARS)致病病毒特殊复合抗原的制备本发明以香港组为例。将VeroE6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将收集到的香港地区4种不同的SARS冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这4种培养的SARS病毒。培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存。然后，将培养好的香港地区4种不同的SARS冠状病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他适当比例混合，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒的含多种不同型的全病毒的特殊复合抗原。
(3)制备免疫蛋应用本公司已申请的专利技术(专利申请号00101270.3和021021244.9)，将采用上述方法制备的非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原，分别对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记。
以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；也可应用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或产蛋母鹅或产蛋火鸡或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
(4)抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物的制备首先根据被免疫的禽类不同以及免疫所用抗原不同，将免疫蛋分类并标记编码，用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟；将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品；最后，将所制备的对应不同抗原的特异性IgY粗提物进行编码标记。
(5)抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY的纯化采用本公司已公开的专利技术(专利中请号00101270.3，专利公开号1307061)分别过离子交换柱和凝胶交换柱对按以上工艺所制取的抗非典型肺炎(SARS)IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
应用SDS-PAGE电泳测定法，对按以上工艺所制取的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量为50％以上。
(6)采用本发明人发明的特殊免疫激活方法和改进的工艺技术所制得的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY参照常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)进行活性检测。
检测结果显示，抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY对香港4种代表性非典型肺炎(SARS)冠状病毒的抗体结合效价都达到1∶512以上。
将用以上方法制备的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY配以蒸馏水或生理盐水调配成浓度0.01％以上的溶剂，制成一种新型雾化剂，加入各种雾化器中，经过雾化后，供非典型肺炎患者吸入呼吸道和肺部产生作用，就可以有效抑制引起非典型肺炎的致病病毒，从而起着有效的治疗作用。
将0.01-80％这种抗非典型肺炎特异性IgY配以99.99-20％的辅料，可制成各种临床可接受的剂型，如雾化剂、鼻喷剂、滴鼻剂、喷喉剂、口喷剂、口含片等剂型，用于预防和治疗非典型肺炎(SARS)。
作为预防用的剂型，这种抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY还可以2∶1或3∶1或其他适当比例加入用本公司已公开的专利技术(专利申请号00101270.3，专利公开号1307061)制备的抗龋齿菌IgY，制成一种新型的多功效特异性复合IgY。将这种多功效特异性复合IgY配以辅料制成喷雾剂或口含片，只要经常使用这种喷雾剂喷口腔和咽喉部位，或者经常含服这种新型口含片，就可以十分方便、轻松地既预防非典型肺炎(SARS)，又防止蛀牙、消除口腔炎症和口臭，达到一举多得的目的。
目前对非典型肺炎(SARS)无特效药物，一般采用对症治疗和大量投服抗生素、广谱抗病毒药以及免疫抑制剂的糖皮质激素。众所周知，抗生素对病毒并没有杀灭作用，广谱抗病毒的抗生素的滥用反而破坏了人体的正常人“菌群平衡”，造成“菌群失调”。临床实践已证实，“菌群失调”不仅仅是疾病发生的结果，也是病毒感染性疾病的促进因素，反过来会使病情加重甚至恶化。免疫抑制剂和激素的大量使用，会直接造成患者免疫系统受损，使免疫机能愈治愈差，极易继发细菌感染，最终更难治愈。
由于本发明制备的特异性IgY最大特点是直接针对非典型肺炎(SARS)的病原体发生特异性抑制作用，本发明又将实际应用的剂型和施药方式设计成直接施于病原体最集中的肺部和呼吸通道，因而作用直接、目标准确、治本断源、效果显著。同时，本发明从根本上改变了目前治疗非典型肺炎(SARS)一般需要大量内服疗效并不确切的化学药品和激素的状况，避免损害患者的免疫机能，也克服了常规施药方式要使大量化学药物进入人体循环后才产生作用而会给人体带来种种不良影响的弊病。
本发明所制备的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY又是一种独特的纯天然生物制剂，使用十分安全，无任何毒副作用，由于它仅仅针对非典型肺炎的致病病原体直接作用，对有益菌都有很好的保护作用；同时，它完全不会诱发抗药菌株的产生，也会象一般常规药物那样，将有益菌也和病原体一道杀灭而造成“菌群失调”；反过来，本发明的抗非典型肺炎(SARS)病原体的特异性IgY可以在肺炎和呼吸道构建一种不易被病毒和致病菌感染的正常菌群生态，形成一道人体天然保护屏障，达到既治疗又预防的双重目的。另外，本发明所制备的特异性IgY是一种多克隆抗体，它可以对几种不同的病原体都产生抑制作用，这一点对于非典型肺炎(SARS)的病原体一变异的冠状病毒特别有意义。由于这种新型冠状病毒特别容易变异，仅在香港目前已发现有4种之多；如果要研制疫苗，则需要有多种疫苗，才会真正达到有效控制的效果，这就大大增加了预防这种恶性传染病的难度。
而本发明的特异性Ig不仅对直接作為抗原免疫的任意型的非典型肺炎(SARS)的变异冠状病毒有效果；而且，由于高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类有较强的免疫原性；因此，只要以某种抗原采用我公司发明的免疫激活专利技术(专利中请号02121244.9)免疫禽类，所制得的特异性IgY，对凡是与该抗原有“共同抗原决定簇”的病原体都会有强烈的抑制活性。也就是说，既使冠状病毒发生了一定的变异，实际上其重要部分是不会变的；本发明的特异性IgY仍然会针对其重要部分产生作用。因此，照样会使发生了新变异的冠状病毒受到抑制而失活。正因为采用本发明的方法制备的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY具有特殊的广谱抑制能力；所以，可以解决因这种新冠状病毒变异特别快而给相关疫苗和新药的研制带来相当大阻力的难题。
实验例1将来自香港的4种不同的非典型肺炎(SARS)冠状病毒依次编码为香港1型、香港2型、香港3型、香港4型。香港1型冠状病毒按上述技术内容第2条的方法制作抗原，再用这种抗原免疫母鸡，并采用本发明技术内容第6条的方法制备抗香港1型冠状病毒特异性IgY。然后，以香港1型冠状病毒为检测抗原，用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)检测所制得的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY抗体结合效价。结果如下表
实验例2分别以香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒为检测用抗原，采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)分别检测抗香港1型冠状病毒特异性IgY对这三种检测抗原的抗体结合效价。结果如下表
从以上检测结果看出，采用本发明的方法制取致病病毒抗原，又采用本发明的免疫激活方法免疫产蛋禽类和制备相应的IgY，所制备的抗香港1型冠状病毒特异性IgY具有理想的广谱性，不仅如上实验例1所表明的对直接免疫的香港1型冠状病毒抗原有很强的抑制作用，所测的抗体结合效价相当高(高达1∶1024)；对其他已发生变异的并没有直接免疫的其他三种非典型肺炎(SARS)冠状病毒也同样有一定的抑制作用，所检测到的抗体结合效价仍属理想。
实验例3以香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒按1∶1∶1∶1的比例混合均匀，再以本发明技术内容(2)的方法步骤制作复合抗原，并采用本发明的方法免疫母鸡，制备抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY。然后用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)分别以香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒以及北京传播的冠状病毒作为检测用抗原，检测所制得的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY对这5种不同抗原的抗体结合效价。检测结果如下表
从以上结果可以看到，以本发明的方法用多种致病病毒制作含多种病毒成份的特殊复合抗原，再用这种特殊复合抗原，应用本发明的免疫激活方法免疫产蛋禽类，所制备的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，广谱性特别好，除了对作为抗原直接免疫的几型非典型肺炎(SARS)冠状病毒具有相当高的抗体结合效价外，对没有作为抗原直接免疫的同种不同型的非典型肺炎(SARS)冠状病毒也有很好的抑制作用，达到相当理想的效果。
实验例4分别按照本发明技术内容(2)的方法制作非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原，然后分别用这种抗原免疫产蛋母鸡、产蛋母鸭、产蛋母鹅、产蛋火鸡以及产蛋鸵鸟。再分别采用本发明的方法制备得到(1)抗非典型肺炎(SARS)特异性鸡IgY、(2)抗非典型肺炎(SARS)特异性鸭IgY、(3)抗非典型肺炎(SARS)特异性鹅IgY、(4)抗非典型肺炎(SARS)特异性火鸡IgY、(5)抗非典型肺炎(SARS)特异性鸵鸟IgY。然后，采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)分别以香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒为检测抗原，检测这三种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的抗体结合效价。结果如下表
从以上试验结果可以看出，采用本发明的方法制作抗原，用免疫激活方法免疫母鸡、母鸭、母鹅、产蛋火鸡或产蛋鸵鸟，再采用本发明的方法分别制得抗非典型肺炎(SARS)特异性鸡IgY、抗非典型肺炎(SARS)特异性鸭IgY、抗非典型肺炎(SARS)特异性鹅IgY、抗非典型肺炎(SARS)特异性火鸡IgY、抗非典型肺炎(SARS)特异性鸵鸟IgY五种不同的IgY，虽然免疫的禽类不同，但是所制得的特异性IgY对引致非典型肺炎的几种致病病毒都有很好的抑制效果。由于鸭IgY没有Fc段，如果将鸭IgY制成注射用剂型，注射入人体内，人体不易产生排斥反应，这是鸭IgY最大的优点。虽然免疫产蛋鸵鸟和产蛋火鸡所制得的IgY抗体结合效价从检测数据看稍微低了一些，但是，由于鸵鸟和火鸡蛋个体特别大，每个免疫蛋所能提取得到的IgY比鸡免疫蛋和鸭免疫蛋以及鹅免疫蛋都多得多，这点对于工业化大规模生产，也是十分可取的。
实验例5非典型肺炎(SARS)初发病患者使用以本发明的“抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY”为原料制作的组合雾化剂治疗的临床观察(1)在刚入院隔离治疗的确诊病人中随意选50名初发患者；(2)采用本发明制备的“抗非典型肺炎(SARS)IgY组合雾化剂”，药液打开后，将其倒入PARI型压缩雾化气泵中，经雾化供患者吸入。在给予持续鼻导管吸氧和其他相应对症治疗措施配合的前提下，每二小时吸入本发明的IgY组合雾化剂一次，每次持续5-10分钟。
(3)每天观察试验患者的症状变化情况，作详细记录；(4)经连续吸用“抗非典型肺炎(SARS)IgY组合雾化剂”三天后，32名患者高热逐步减退，畏寒、乏力、全身不适等症状减轻。吸用一周后，只有8名患者发热持续，并出现干咳、胸痛，其余患者全部不再发热，症状明显减轻，有10名患者症状消除。
实验例6非典型肺炎(SARS)重症患者使用本发明的“抗非典型肺炎(SARS)特异性复合IgY”为原料制作的组合雾化剂治疗的临床观察结果(1)任选50名住院隔离治疗的中、重症非典型肺炎(SARS)患者；(2)在照常给予持续鼻导管吸气和其他相应对症治疗措施配合的前提下，使用压缩雾化气泵将本发明的“抗非典型肺炎(SARS)特异性复合IgY组合雾化剂”雾化后供患者吸入。每二小时吸入一次，每次持续5-10分钟。
(3)每天观察试验患者症状情况，详细记录。结果如下表
本发明的“抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY”能够有的放矢地直接针对引致非典型肺炎的致病病毒起有效抑制作用，是从发病根源上解决问题；一方面中和这些病原体，改变这些病原体的活性，并促进人体免疫系统清除这些病原体。特别是，本发明的特异性IgY具有很强的广谱抑制能力，即使致病病毒发生了某些变异，仍然会产生一定的抑制作用。实验结果证明，本发明的“抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY”组合制剂，对非典型肺炎(SARS)的治疗效果和目前已采用的同样是“被动免疫治疗”的“血清疗法”一样，效果比较理想；而且，由于本发明的特异性IgY有较好的广谱抑制能力，抗体活性也强得多，又不会产生交叉反应等副作用，纯度高、来源广，价格又低廉得多，因此，为预防和治疗非典型肺炎(SARS)这种传染快、危害大的恶性传染病开辟了一条崭新的途径。
实施例1制备100g抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY粗提物及纯IgY(1)选具高免疫应答能力的良种鸭用肺炎双球菌制作抗原，分别免疫1000只母鸭，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸭所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鸭200只，再用这批鸭所产的蛋孵出优良鸭种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鸭，并挑选其中40只；(2)非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原的制备本发明以香港组为例。将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞。然后弃掉培养液，将收集到的香港地区4种不同的SARS冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml。取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒。收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清。再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这4种培养的SARS病毒。培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存。然后，将培养好的香港地区4种不同的冠状病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他适当比例混合，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒的含多种不同型的病毒的特殊复合抗原。
(3)分别对优选的特种母鸭进行强化免疫
用所制取的(SARS)冠状病毒复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鸭进行免疫，每只母鸭每次注射量达到1-2ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鸭所产免疫蛋1000只；(4)抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀；用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间；将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY粗提物干粉成品；过离子交换柱和凝胶交换柱对抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
实施例2抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY雾化剂的制备抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY干粉300g加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配30升抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY组合溶液抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY 300g阿斯巴甜 36g香橙香精 90g水蜜桃香精 30g生理盐水 加至30升先调制生理盐水25升，然后加入阿斯巴甜和香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着，加生理盐水至30升，充分搅拌均匀；测量溶液的pH值，用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；经细菌过滤除菌，然后采用无菌瓶灌装抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY喷雾剂，每支装20ml。
实施例3制备抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY手揿定量压力喷雾罐抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY干粉300g加入小型搅拌机中充分混和；
按以下配方调配200升抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY组合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY 300g阿斯巴甜 240g香橙香精 600g水蜜桃香精 200g薄荷香精 1400g蒸馏水 加至200升先取蒸馏水180升，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着加蒸馏水至200升，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；溶液调配好后，必须在压力罐生产线上灌装手动定量压力喷雾罐20000支，每支喷雾罐灌足10ml后，必须再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。
实施例4制备抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY定量常压喷雾罐抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性纯IgY干粉300重量份，加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配200重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY组合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200体积份先取蒸馏水180体积份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200体积份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经细菌过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐20000支，每支10ml，每支灌装满10ml。
实施例5制备抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症定量常压喷雾罐抗非典型肺炎(SARS)特异性复合IgY干粉150重量份，抗龋齿菌IgY干粉150重量份，加入小型搅拌机中充分混和，制成抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症复合IgY干粉300重量份；按以下配方调配200重量份抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症复合IgY组合溶液；抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症复合IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200体积份先取蒸馏水180体积份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200体积份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经细菌过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐20000支，每支10ml，每支灌装满10ml。
权利要求
1.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法包括下列步骤优选引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，制备非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原；制备免疫蛋；制备抗非典型肺炎(SARS)各种致病病毒特异性IgY粗提物；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物的纯化；制备抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY。
2.如权利要求
1所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法包括下列步骤筛选引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，在筛选和分类组合各种致病病毒的基础上，分别制备单一或复合的非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原将Vero E6细胞接种于FCSDMEM培养液中，将上述培养液置于培养瓶中，将此培养瓶放置在培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将各组别的SARS致病病毒毒株分别用FCS和青链霉素DMEM培养液稀释，取稀释液加入细胞培养瓶中，并将细胞培养瓶放置在培养箱中培养至细胞病变达++++时收获病毒，放入高速离心机中高速离心分离，收集上清，再灭活所培养的SARS致病病毒，将培养好的各组别的病毒单独或按适当比例混合，再按1∶1比例或其他适当比例分别加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，即制成单一或复合非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原；制备免疫蛋用各种单一或复合非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原或非典型肺炎(SARS)继发感染细菌抗原，分别对产蛋禽类进行免疫，每隔二周再强化注射一次，一个月计免疫三次，第一次免疫20天后，检取免疫后的禽类所产免疫蛋，并对相应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；制备抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物干粉成品，最后，将所制备的对应不同抗原的特异性IgY粗提物进行编码标记；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物的纯化将以上工艺所制取的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY粗提物分别先后过离子交换柱和凝胶层析柱，即得纯IgY；
3.如权利要求
1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法中引致非典型肺炎(SARS)的致病病毒是冠状病毒。
4.如权利要求
3所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该冠状病毒是一种变种的冠状病毒，包括它的多种变异型，有香港传播的香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒，北京传播的多种型冠状病毒，加拿大型冠状病毒，新加坡传播的冠状病毒，越南传播的冠状病毒。
5.如权利要求
1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法中制备免疫蛋所采用的产蛋禽类包括母鸡，母鸭，母鹅、火鸡、鸵鸟。
6.如权利要求
2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY的制备方法中所述非典型肺炎(SARS)一种或多种致病病毒抗原的制备是这样的首先按权利要求
2所述的方法培养优选的一种或多种病毒，选择一种致病病毒时，直接加入福氏佐剂制作单一抗原；选择多种致病病毒时，则先将培养好的一种以上SARS致病病毒按1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10依此类推的比例均匀混合，然后加入福氏佐剂制成复合抗原。
7.如权利要求
1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY，其特征在于该抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY可以制成临床可接受的剂型。
8.抗香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒多种致病病毒特异性IgY，其特征在于这种抗多种致病病毒特异性IgY的制备方法包括下列步骤分别用香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒制备抗原，首先将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml，将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒毒株分别用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养液冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，然后，将培养好的灭活的香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒、香港4型冠状病毒，按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合均匀，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，制得含四种冠状病毒抗原的复合抗原；用制得的冠状病毒复合抗原对产蛋母鸡进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取母鸡所产的免疫蛋；用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得抗香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒和抗香港4型冠状病毒特异性复合IgY粗提物干粉，将以上IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB，先后经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，把粗提物纯化，即得抗香港1型冠状病毒、香港2型冠状病毒、香港3型冠状病毒和抗香港4型冠状病毒特异性复合纯IgY。
9.一种抗北京型冠状病毒特异性IgY，其特征在于这种抗一种致病病毒的特异性IgY的制备方法包括下列步骤用北京型冠状病毒制备抗原，首先将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml，将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将北京传播的有代表性的冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养液冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，制得匀质抗原；用所制得的北京型冠状病毒抗原对产蛋禽类进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取禽类所产的免疫蛋；用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得抗北京型冠状病毒特异性IgY粗提物干粉，将以上IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB，经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，把粗提物纯化，即得抗北京型冠状病毒特异性纯IgY。
10.一种抗加拿大型冠状病毒特异性IgY，其特征在于该抗加拿大型冠状病毒特异性IgY的制备方法包括下列步骤用收集到的加拿大地区传播的有代表性的非典型肺炎(SARS)致病冠状病毒制备抗原，首先将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml，将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将加拿大传播的有代表性的冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID 50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养液冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌即制成油包水溶液状致病病毒抗原；用制得的病毒抗原对产蛋禽类进行免疫，每隔二周再强化注射一次，计免疫三次，第一次免疫20天后，检取禽类所产的免疫蛋；用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时，将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20分钟，将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1～0.3％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌，再加入高速离心机中离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，即得抗加拿大型冠状病毒特异性IgY粗提物；将以上IgY粗提物经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，得到抗加拿大型冠状病毒特异性纯IgY。
11.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY制剂，其特征在于该特异性IgY制剂的制备方法包括下列步骤将用以上方法制备的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY配以蒸馏水或生理盐水调配成浓度0.01％以上的溶剂，制成一种新型雾化剂，加入各种雾化器中，经过雾化后供非典型肺炎患者吸入呼吸道和肺部。
12.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性鸭IgY，其特征在于该特异性鸭IgY的制备方法包括下列步骤选具高免疫应答能力的良种鸭用肺炎双球菌制作抗原，分别免疫1000只母鸭，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鸭所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鸭200只，再用这批鸭所产的蛋孵出优良鸭种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鸭，并挑选其中40只；非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原的制备将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将收集到的香港地区4种不同的SARS冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，然后，将培养好的香港地区4种不同的冠状病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他适当比例混合，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原；分别对优选的特种母鸭进行强化免疫用所制取的非典型肺炎(SARS)冠状病毒复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鸭进行免疫，每只母鸭每次注射量达到1-2ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鸭所产免疫蛋1000只；抗非典型肺炎(SARS)特异性鸭IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特异性鴨IgY粗提物干粉成品，过离子交换柱和凝胶交换柱对抗非典型肺炎(SARS)特异性鴨IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
13.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性鹅IgY，其特征在于该特异性鹅IgY的制备方法包括下列步骤选具高免疫应答能力的良种鹅用肺炎双球菌制作抗原，分别免疫1000只母鹅，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些鹅所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的鹅200只，再用这批鹅所产的蛋孵出优良鹅种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种母鹅，并挑选其中40只；非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原的制备将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将收集到的香港地区4种不同的SARS冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，然后，将培养好的香港地区4种不同的冠状病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他适当比例混合，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原；分别对优选的特种母鹅进行强化免疫用所制取的非典型肺炎(SARS)冠状病毒复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种母鹅进行免疫，每只母鹅每次注射量达到2-10ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取母鹅所产免疫蛋1000只；抗非典型肺炎(SARS)特异性鹅IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特异性鹅IgY粗提物干粉成品，过离子交换柱和凝胶交换柱对抗非典型肺炎(SARS)特异性鹅IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
14.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性鸵鸟IgY，其特征在于该特异性鸵鸟IgY的制备方法包括下列步骤选具高免疫应答能力的良种产蛋鸵鸟用肺炎双球菌制作抗原，分别免疫1000只产蛋鸵鸟，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再强化注射一次，共三次；于第一次注射后第7个月，把这些产蛋鸵鸟所产的蛋标记后按常规方法分别提取其中的IgY，以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的IgY的效价；选出其中能制得IgY效价≥256的免疫应答能力特别强的产蛋鸵鸟200只，再用这批产蛋鸵鸟所产的蛋孵出优良鸵鸟种，待其长大至2-3个月，作为优选的高免疫应答能力的特种产蛋鸵鸟，并挑选其中40只；非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原的制备将Vero E6细胞接种于10％FCS DMEM培养液中，细胞终浓度1×105/ml。将15ml上述培养液置于100ml培养瓶中，将此培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和培养箱中培养成单层细胞，然后弃掉培养液，将收集到的香港地区4种不同的SARS冠状病毒毒株用2％FCS和1％青链霉素DMEM培养液稀释至100 TCID50/ml，取此稀释液10ml加入细胞培养瓶中，并将此细胞培养瓶放置在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，待细胞病变达++++时收获病毒，收获病毒时将培养瓶冻融三次，收集培养上清，放入高速离心机中，以15000rpm转速离心分离，收集上清，再加入甲醛至0.1％的终浓度，在37℃温度下，经过24小时分别灭活这4种培养的SARS病毒，培养好的灭活病毒在4℃或-20℃保存，然后，将培养好的香港地区4种不同的冠状病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他适当比例混合，再按1∶1比例或其他适当比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中以10000～30000rpm转速高速粉碎匀化，通过高速搅拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒复合抗原；分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行强化免疫用所制取的非典型肺炎(SARS)冠状病毒复合抗原，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，分别对优选的特种产蛋鸵鸟进行免疫，每只产蛋鸵鸟每次注射量达到5-20ml抗原，每隔二周再强化注射一次，一个月内共免疫三次；第一次免疫20天后，检取产蛋鸵鸟所产免疫蛋1000只；抗非典型肺炎(SARS)特异性鸵鸟IgY粗提物的制备用打蛋机将检取的免疫蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5-6.0之间，将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时；将稀释液加入高速离心分离机中，以8000-12000rpm转速高速离心分离20分钟；将分离所得的上清再入超滤器中进行超滤并浓缩15倍，按0.2％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心机离心，取上清，去除脂蛋白，将离心分离后的浆料加入超滤机，过超微膜，进行过滤除菌，将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特异性鸵鸟IgY粗提物干粉成品，过离子交换柱和凝胶交换柱对抗非典型肺炎(SARS)特异性鸵鸟IgY粗提物进行纯化，即得纯IgY。
15.一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY制剂，其特征在于该制剂中每升含有抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY 1-100克。
16.一种抗非典型肺炎(SARS)雾化剂的制备方法，其特征在于该方法为抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY干粉300重量份加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配30000重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY组合溶液抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY 300重量份阿斯巴甜 36重量份香橙香精 90重量份水蜜桃香精 30重量份生理盐水 加至30000重量份先调制生理盐水25000重量份，然后加入阿斯巴甜和香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着，加生理盐水至30000重量份，充分搅拌均匀；测量溶液的pH值，用1.0NNaOH溶液调节pH至6.5-7.5；经细菌过滤除菌，然后采用无菌瓶灌装抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY喷雾剂，每支装20ml。
17.一种抗非典型肺炎(SARS)喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY干粉300重量份加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配200000重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY组合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200000重量份先取蒸馏水180000重量份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入IgY；接着加蒸馏水至200000重量份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；溶液调配好后，在压力罐生产线上灌装手动定量压力喷雾罐，每支喷雾罐灌足10ml后，再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。
18.一种抗非典型肺炎(SARS)常压喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性纯IgY干粉300重量份，加入小型搅拌机中充分混和；按以下配方调配200000重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY组合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特异性IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200000重量份先取蒸馏水180000重量份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200000重量份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经细菌过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐，每支灌装满10ml。
19.一种抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症喷雾剂的制备方法，其特征在于该方法为抗非典型肺炎(SARS)特异性复合IgY干粉150重量份，抗龋齿菌IgY干粉150重量份，加入小型搅拌机中充分混和，制成抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症复合IgY干粉300重量份；按以下配方调配200000重量份抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症复合IgY组合溶液；抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎症复合IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸馏水 加至200000重量份先取蒸馏水180000重量份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200000重量份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经细菌过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐，每支灌装满10ml。
专利摘要
本发明公开了一种抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY及其制备方法和制剂。本发明制备方法包括下列步骤筛选出引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，在筛选和分类组合各种致病病毒的基础上，分别制备单一或复合的致病病毒抗原，制备免疫蛋，制备抗非典型肺炎(SARS)各种致病病毒特异性IgY粗提物，抗非典型肺炎(SARS)各种致病病毒特异性IgY粗提物的纯化，本发明抗非典型肺炎(SARS)特异性IgY多种制剂用于非典型肺炎(SARS)的预防和治疗具有特效、安全、使用方便的特点。
文档编号C12N7/00GKCN1450086SQ03136101
公开日2003年10月22日 申请日期2003年5月13日
发明者包晟 申请人:雅臣药业集团(远东)有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan