专利名称:带正电高分子胶束与其形成方法
技术领域：
本发明涉及一种带正电高分子胶束与其形成方法，本发明还涉及一种带正电高分子胶束药物载体的形成方法，本发明又涉及一种带正电高分子胶束基因载体的形成方法。
背景技术：
光动力治疗法(photodynamic therapy)是一种新兴的癌症治疗方式，其治疗方法是将感光药物(photosensitizer)注射至体内，让药剂附着在肿瘤细胞累积的血液蛋白中，使蛋白质将感光药物输送至肿瘤中，再以激光光源或其它光源激发细胞内的感光药物，使感光药物受光子的激发而产生光化学作用，当感光药物由激态回复到基态的过程中，所释放能量可与细胞内的氧分子结合，将血液中的氧分子由3O2激发成1O2状态，形成单相氧分子或自由基，并破坏细胞内微细结构，如细胞膜、线粒体或核膜等，进而对细胞本体或细胞的重要结构造成伤害，进而使细胞死亡。但此类药物常为疏水性，所以难以被人体所吸收。
为解决上述问题，近期已发展出许多种药物载体将药物输送治身体中，其一为胶束药物载体，但此胶束药物载体将药物输送至细胞中的比例依然有待改善。
因此，业界亟需提出一种胶束药物载体，以提高药物输送至细胞的比例。
发明内容有鉴于此，本发明的目的之一就是提供一种带正电高分子胶束与其形成方法以及带正电高分子胶束药物与基因载体的形成方法。
为达上述目的，本发明提供一种带正电高分子胶束的形成方法，包括将多个两性高分子聚合物聚集形成高分子胶束；以及以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在高分子胶束外层上，以形成带正电高分子胶束。
为达上述目的，本发明还提供一种带正电高分子胶束，包括高分子胶束，该高分子胶束是由多个两性高分子聚合物所聚集而成；以及正电性修饰剂，该正电性修饰剂化学接枝于高分子胶束上，以形成带正电高分子胶束。
为达上述目的，本发明又提供一种带正电高分子胶束药物载体的形成方法，包括混合多个两性高分子聚合物与药物，使这些两性高分子聚合物聚集，以形成包覆药物的高分子胶束药物载体；以及以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在高分子胶束药物载体外层上，以形成带正电高分子胶束药物载体。
为达上述目的，本发明另提供一种带正电高分子胶束基因载体的形成方法，包括混合多个两性高分子聚合物与基因，使这些两性高分子聚合物聚集，以形成包覆基因的高分子胶束基因载体；以及以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在高分子胶束基因载体外层上，以形成带正电高分子胶束基因载体。
本发明是以化学修饰方法制备带正电性的高分子胶束作为光动力治疗药物传输系统，由于细胞膜是带负电性，因此会吸引带正电性的高分子胶束，以增加胶束被细胞胞吞作用，进而提高药剂累积于细胞的量，且能达50％以上的细胞致死量。
图1A-图1C为一系列示意图，用以说明本发明形成带正电高分子胶束的形成方法。
图2A-图2B为比较实施例1的荧光显微镜图。
图3A-图3B为本发明实施例1的荧光显微镜图。
图4为比较实施例1与本发明实施例3-5的光动力效果图。
具体实施方式带正电高分子胶束与其形成方法为使本发明更容易地被了解，故先说明胶束(micelle)的形成机制两性(amphiphilic)高分子是一种表面活性剂，当水中两性高分子浓度很低时，两性高分子会吸附在空气和水的界面，通过亲水端与水水合，以降低表面张力，此时溶液中的两性高分子几乎是以单体存在；当两性高分子浓度提高至界面吸附饱和量时，未能吸附在界面的两性高分子会以亲水端朝外、疏水端朝内的方式自组装(self assembly)成胶束，如图1B所示，此时两性高分子的浓度即为临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)。
一般而言，实际中如果想形成胶束，则需要参考每个表面活性剂、水相与油相的三相图的胶束形成区的位置，再根据此区所示的浓度来配置溶液而形成胶束，且胶束区的位置随所使用的表面活性剂材料、水相材料、油相材料与温度等因素而改变，故下列实施内容的两性高分子所使用的量请参考其三相图来决定。
本发明的带正电高分子胶束30的形成方法如图1A-图1C所示，将于如下作详细说明请参阅图1A与图1B，首先将多个两性高分子聚合物10与油相、水相混合，并使两性高分子聚合物10的浓度高于临界胶束浓度，以使多个两性高分子聚合物10自组装形成高分子胶束20。其中两性高分子聚合物10为生物相容性两性高分子材料，以适用于人体中，如聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚己内酯(polycaprolactone，PCL)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolicacid，PGA)、聚乳酸/羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)等。
接下来利用化学修饰方式在胶束的外层将正电性修饰剂R接枝在高分子胶束20外层上，如图1C所示，以形成带正电高分子胶束30，而所使用的正电性修饰剂R必须在接枝后使高分子胶束30带正电，以达本发明的目的，其中正电性修饰剂R包括正电性分子或正电性目标配基(targeting ligand)，如胺类化合物(amines)，而胺类化合物包括单胺类化合物或二胺类化合物(diamines)或多胺类化合物(polyamine)，其中单胺类化合物包括乙胺(ethylamine)、丙胺(propylamine)、丁胺(butylamine)、戊胺(pentylamine)、己胺(hexylamine)、庚胺(heptylamine)、辛胺(octylamine)、壬胺(nonylamine)、癸胺(decylamine)、十一胺(undecylamine)、十二胺(dodecylamine)等，而二胺类化合物(diamines)包括乙二胺(diaminoethane)、丙二胺(diaminopropane)、丁二胺(diaminobutane)、戊二胺(diaminopentane)、己二胺(diaminohexane)、庚二胺(diaminoheptane)、辛二胺(diaminooctane)、壬二胺(diaminononane)、癸二胺(diaminodecane)、十一烷二胺(diaminoundecane)、十二烷二胺(diaminododecane)或2’-亚乙二氧基二乙胺(2’-(ethylenedioxy)diethylamine)；多胺类化合物包括聚氮丙啶(polyethylenimine)、肽、多熔素(polylysine)、聚精氨酸(polyarginine)等，而正电性目标配基包括细胞膜、细胞核膜等。
此外，尚可将药物或基因置于上述的带正电高分子胶束30中，以形成带正电高分子胶束药物载体或带正电高分子胶束基因载体；其中药物可为感光药物(photosensitizer)，如原卟啉IX(Protoporphyrin IX)(血卟啉衍生物(Hematoporphyrinderivatives)，5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid))等。其形成方式将于以下叙述。
带正电高分子胶束药物或基因载体的形成方法首先将药物或基因溶于油相中，再与多个两性高分子聚合物和水相混合，以使两性高分子聚合物聚集，形成包覆药物的高分子胶束药物载体或包覆该基因的高分子胶束基因载体；接着再以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在高分子胶束药物载体或高分子胶束基因载体外层上，以形成带正电高分子胶束药物载体或带正电高分子胶束基因载体，使药物或基因更容易进入细胞或特定目标中。
上述利用化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在高分子胶束药物载体或高分子胶束基因载体外层上的方式包括下列几种方式将0.25当量、0.5当量、0.75当量、1当量、2.0当量正电性修饰剂与胶束外层的羧基、胺基、醛基或羟基在有机溶剂中直接进行接枝反应72h，其中有机溶剂包括DMF(二甲基甲酰胺)、H2O，以形成带正电高分子胶束药物载体或带正电高分子胶束基因载体。或是先使胶束与0.25当量、0.5当量、0.75当量、1当量、2当量交联剂在有机溶剂下进行反应24h，以使胶束表面官能化，其中该有机溶剂包括DMF，而催化剂包括1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)，交联剂2，2’-亚乙二氧基二乙胺(2，2’-(ethylenedioxy)diethylamine)，接着再加入0.25当量、0.5当量、0.75当量、1当量、2.0当量带正电修饰剂与官能化的胶束反应72h，以形成带正电高分子胶束药物载体或带正电高分子胶束基因载体。
以上所述的两性高分子聚合物、正电性修饰剂等与带正电高分子胶束的形成方法所述相同，故不再赘述。
再者，胶束的尺寸并无特定限制，视所承载的药物与基因而定，但一般为30-500nm。
为使本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举出较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下实施例1制备PCL-b-PAA将聚丙烯酸-b-聚己内酯(poly acrylic acid-b-polycaprolactone，PCL104-b-PAA41)溶解在2mg/mL四氢呋喃(THF)中，再以每小时30ml的速率加入等体积的水，搅拌18小时后透析3天，再以移除THF。
接下来再将透析完的胶束溶液加入催化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺，反应1小时后再加入交联剂2’-亚乙二氧基二乙胺，反应3天，以得到PCL-b-PAA胶束。
实施例2制备PCL-b-PAA/PpIX将20∶1的聚丙烯酸-b-聚己内酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)与感光药物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氢呋喃(THF)中，再以每小时30ml的速率加入等体积的水，搅拌18小时后透析3天，再以移除THF。
接下来再将透析完的胶束溶液加入催化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺，反应1小时后再加入交联剂2’-亚乙二氧基二乙胺，反应3天，以得到PCL-b-PAA/PpIX胶束。
实施例3制备C4H7(NH2)2-PCL-b-PAA/PpIX将20∶1的聚丙烯酸-b-聚己内酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)与感光药物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氢呋喃(THF)中，再以每小时30ml的速率加入等体积的水，搅拌18小时后透析3天，再以移除THF。
接下来再将透析完的胶束溶液加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺，反应1小时后再加入2’-亚乙二氧基二乙胺，反应3天，以得到带正电的C4H7(NH2)2-PAA-b-PCL/PpIX胶束。
实施例4制备PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX将20∶1的聚丙烯酸-b-聚己内酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)与感光药物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氢呋喃(THF)中，再以每小时30ml的速率加入等体积的水，搅拌18小时后透析3天，再以移除THF。
接下来再将透析完的胶束溶液加入催化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺，反应1小时后再加入交联剂2’-亚乙二氧基二乙胺，反应3天后再透析三天，再将得到的产物用催化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺活化，1小时后再加入N-(4-氨丁基)氨基甲酸叔丁酯(N-(4-aminobutyl)carbamicacid t-butyl ester)反应72h，透析后再加入TFA反应30分钟去保护，以得到带正电的PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX胶束。
实施例5制备FITC标记的PCL-b-PAA-丁二胺/PpIX纳米笼(FITC-Labeled PCL-b-PAA-Butyldiamine/PpIXNanocage)(PNF)将20∶1的聚丙烯酸-b-聚己内酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)与感光药物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氢呋喃(THF)中，再以每小时30ml的速率加入等体积的水，搅拌18小时后透析3天，再以移除THF。
接下来再将透析完的胶束溶液加入催化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺，反应1小时后再加入交联剂2’-亚乙二氧基二乙胺0.25摩尔(相较于COOH基)，反应3天后再透析三天，再将得到的产物用催化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺活化，1小时后再加入N-(4-氨丁基)氨基甲酸叔丁酯反应72h，透析后再加入TFA30分钟去保护，以得到带正电的PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX胶束。将PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX与异硫氰酸荧光素(fluorescein Isothiocyanate，FITC)在0.1M、pH9的磷酸缓冲溶液下反应72小时，透析三天后得到FITC-标记的PCL-b-PAA-丁二胺/PpIX纳米笼(PNF50％)。
评估方法将胶束/感光药物加入细胞培养皿中，利用荧光显微镜于不同的时间点观察感光药物于细胞内分布的情形(红光)。
图2A与图2B为比较实施例1的荧光显微镜图，由荧光显微镜观察发现，将PAA-b-PCL胶束给予人类子宫颈癌细胞株HeLa细胞后，胶束累积在细胞间隙(cell junction)，无法进入细胞，可能是因为PAA带负电，与细胞膜电位相互排斥，因此胶束不易贴近细胞表面，因此细胞不易产生胞吞作用(endocytosis)。
图3A与图3B为实施例1的荧光显微镜图，由荧光显微镜观察发现，带正电胶束明显进入细胞中，除了有聚集现象外，细胞质内也有荧光产生。
光动力效果的评估是用635nm波长的光照射，利用快速微量自动比色分析(MTT)探讨感光药物对癌细胞生长情形及毒性的影响。
图4为实施例3-5与比较实施例1的光动力效果图，横轴的数字1、2、3分别代表照光剂量0J、0.33J、0.66J，纵轴代表细胞存活率(％)。结果发现实施例3与4的带正电胶束在照光剂量为0.33J时，细胞的致死率就达到约就50％，且实施例3的效果最好，达到52％；而实施例5与比较实施例1的未带正电胶束在照光剂量为0.66J下仅分别杀死了16％及8％的细胞。
因此本技术是以化学修饰方法制备带正电性的高分子胶束作为光动力治疗药物传输系统，由于细胞膜是带负电性，因此会吸引带正电性的高分子胶束，以增加胶束被细胞胞吞作用(endocytosis)，进而提高药剂累积于细胞的量，且能达50％以上的细胞致死量。
以上所述仅为本发明较佳实施例，然其并非用以限定本发明的范围，任何熟悉本项技术的人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可在此基础上做进一步的改进和变化，因此本发明的保护范围当以本申请的权利要求
书所界定的范围为准。
附图中符号的简单说明如下10两性高分子聚合物20高分子胶束30带正电高分子胶束R正电性修饰剂
权利要求
1.一种带正电高分子胶束的形成方法，包括将多个两性高分子聚合物聚集形成高分子胶束；以及以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在该高分子胶束外层上，以形成带正电高分子胶束。
2.根据权利要求
1所述的带正电高分子胶束的形成方法，其特征在于，该两性高分子聚合物为生物相容性两性高分子材料。
3.根据权利要求
2所述的带正电高分子胶束的形成方法，其特征在于，该生物相容性两性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸。
4.根据权利要求
1所述的带正电高分子胶束的形成方法，其其特征在于，该正电性修饰剂包括正电性分子或正电性目标配基。
5.根据权利要求
1所述的带正电高分子胶束的形成方法，其特征在于，该正电性修饰剂包括胺类化合物。
6.根据权利要求
5所述的带正电高分子胶束的形成方法，其特征在于，该胺类化合物包括单胺类化合物或二胺类化合物。
7.根据权利要求
6所述的带正电高分子胶束的形成方法，其特征在于，该单胺类化合物包括丁胺。
8.根据权利要求
6所述的带正电高分子胶束的形成方法，其特征在于，该二胺类化合物包括丁二胺或2’-亚乙二氧基二乙胺。
9.一种带正电高分子胶束，包括高分子胶束，该高分子胶束由多个两性高分子聚合物所聚集而成；以及正电性修饰剂，该正电性修饰剂化学接枝于该高分子胶束上，以形成带正电高分子胶束。
10.根据权利要求
9所述的带正电高分子胶束，其特征在于，该两性高分子聚合物为生物相容性两性高分子材料。
11.根据权利要求
10所述的带正电高分子胶束，其特征在于，该生物相容性两性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸。
12.根据权利要求
9所述的带正电高分子胶束，其特征在于，该正电性修饰剂包括胺类化合物。
13.根据权利要求
12所述的带正电高分子胶束，其特征在于，该胺类化合物包括单胺类化合物或二胺类化合物。
14.根据权利要求
9所述的带正电高分子胶束，其特征在于，其还包括药物或基因位于该带正电高分子胶束中。
15.根据权利要求
14所述的带正电高分子胶束，其特征在于，该药物为感光药物。
16.根据权利要求
15所述的带正电高分子胶束，其特征在于，该感光药物包括原卟啉IX。
17.一种带正电高分子胶束药物载体的形成方法，包括混合多个两性高分子聚合物与一药物，使这些两性高分子聚合物聚集，以形成包覆该药物的高分子胶束药物载体；以及以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在该高分子胶束药物载体外层上，以形成带正电高分子胶束药物载体。
18.根据权利要求
17所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该两性高分子聚合物为生物相容性两性高分子材料。
19.根据权利要求
18所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该生物相容性两性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸。
20.根据权利要求
17所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该正电性修饰剂包括正电性分子或正电性目标配基。
21.根据权利要求
17所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该正电性修饰剂包括胺类化合物。
22.根据权利要求
21所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该胺类化合物包括单胺类化合物或二胺类化合物。
23.根据权利要求
22所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该单胺类化合物包括丁胺。
24.根据权利要求
22所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该二胺类化合物包括丁二胺或2’-亚乙二氧基二乙胺。
25.根据权利要求
17所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该药物为感光药物。
26.根据权利要求
25所述的带正电高分子胶束药物载体的形成方法，其特征在于，该感光药物包括原卟啉IX。
27.一种带正电高分子胶束基因载体的形成方法，包括混合多个两性高分子聚合物与一基因，使这些两性高分子聚合物聚集，以形成包覆该基因的高分子胶束基因载体；以及以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在该高分子胶束基因载体外层上，以形成带正电高分子胶束基因载体。
28.根据权利要求
27所述的带正电高分子胶束基因载体的形成方法，其特征在于，该两性高分子聚合物为生物相容性两性高分子材料。
29.根据权利要求
28所述的带正电高分子胶束基因载体的形成方法，其特征在于，该生物相容性两性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸。
30.根据权利要求
27所述的带正电高分子胶束基因载体的形成方法，其特征在于，该正电性修饰剂包括正电性分子或正电性目标配基。
31.根据权利要求
27所述的带正电高分子胶束基因载体的形成方法，其特征在于，该正电性修饰剂包括胺类化合物。
32.根据权利要求
31所述的带正电高分子胶束基因载体的形成方法，其特征在于，该胺类化合物包括单胺类化合物或二胺类化合物。
33.根据权利要求
32所述的带正电高分子胶束基因载体的形成方法，其特征在于，该单胺类化合物包括丁胺。
34.根据权利要求
32所述的带正电高分子胶束基因载体的形成方法，其特征在于，该二胺类化合物包括丁二胺或2’-亚乙二氧基二乙胺。
专利摘要
本发明涉及带正电高分子胶束与其形成方法，以及带正电高分子胶束药物与基因载体的形成方法。一种带正电高分子胶束的形成方法，包括将多个两性高分子聚合物聚集形成高分子胶束；以及以化学修饰方式将正电性修饰剂接枝在高分子胶束外层上，以形成带正电高分子胶束。本发明以化学修饰方法制备带正电性的高分子胶束作为光动力治疗药物传输系统，以增加胶束被细胞胞吞作用，进而提高药剂累积于细胞的量。
文档编号A61K47/48GK1990046SQ200510136574
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日
发明者陈俊男, 谢铭钧, 赖建勋, 赖秉杉 申请人:财团法人工业技术研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan