专利名称：逆转hiv-1毒株的齐多夫定抗性的方法
技术领域：
本发明涉及逆转或抑制HIV-1毒株对齐多夫定(Zidovudine)的抗性的方法，包括使病毒(或细胞或携带这类病毒的患者)与α-APA(α-苯胺基苯乙酰胺)型非核苷逆转录酶抑制剂接触。本发明还提供了α-APA型非核苷逆转录酶抑制剂在逆转或抑制HIV-1毒株对齐多夫定的抗性方面的应用。本发明进一步提供了α-APA型非核苷逆转录酶抑制剂在生产用于逆转或抑制病人体内这类抗性的药品中的应用。发明背景治疗感染了人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的人类目前采用核苷逆转录酶抑制剂，特别是齐多夫定(3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷，AZT)，但在很小的范围内使用didanosine(二脱氧肌苷，ddI)、zalcitabine(二脱氧胞苷，ddC)或lamivudine(3TC)。已经实现了对所说病毒感染的有效控制，直到产生了HIV-1毒株对药品的抗性。一般情况下，HIV-1与齐多夫定在病人体内接触终将导致病毒对药物的敏感性渐进性降低。在大约6个月至一年后，病人就变得有临床抗药性，因此使得齐多夫定治疗无效。已经揭示产生对齐多夫定敏感性降低的原因来自在HIV-1逆转录酶(RT)基因中发生的多处突变(例如41、67、70、215和219位的密码子)，结果在RT蛋白质中形成了一套特异性氨基酸取代。单一和各种组合形式的突变都有助于形成齐多夫定抗性。在抗性毒株出现之前(齐多夫定治疗6个月或更长)所进行的较长时间的观察由下列事实予以解释，即在特异性氨基酸残基处发生的多个突变必须积累，尤其是氨基酸THr215的取代(成为Phe或Tyr)需要发生两种核苷转换(ACC→TTC或ACC→TAC)(B.A.Larder，Science，Vol.246,1155-1158,1989,12,1)。
由一些研究结果可见，通过中断服用齐多夫定并将该类治疗转变为另外一种核苷逆转录酶抑制剂如didanosine治疗可在某种程度上阻止齐多夫定抗性(M.H.St.Clairetal.，Science，Vol253，1557-1559,1991,9,27；G.X.McLeod，Antimicrob.AgentsChemother.，1992.5，Vol36(5)，920-925)。在齐多夫定治疗失败的病人中发现从停止齐多夫定治疗并开始didanosine治疗的6-12个月起病人对didanosine的敏感性下降而对齐多夫定的敏感性再次意外地增加。RT中产生的一个新突变(Leu74→Val)说明了对didanosine的抗性增加和明显消除或抑制在先存在的齐多夫定抗性突变作用的原因。令人感兴趣的是，在野生型HIV-1(即病毒不具备齐多夫定抗性HIV-1毒株特征的突变序列)中诱生的新突变并不改变对齐多夫定的易感性。
意外地发现，用α-APA型非核苷逆转录酶抑制剂治疗携带事先存在齐多夫定抗性之HIV-1毒株的病人，能在短期内逆转所说的抗性。这一结果表明，可以对携带已存在齐多夫定抗性之HIV-1的病人维持或尽早重新恢复齐多夫定治疗。本发明的描述本发明涉及逆转或抑制HIV-1毒株的齐多夫定抗性的方法，包括将所说HIV-1毒株与一定量的下列通式I化合物或其药用酸加成盐形式或其立体化学异构体接触，以有效地逆转或抑制所说HIV-1毒株的齐多夫定抗性，所说的通式I为 其中R表示2-硝基苯基或2-乙酰基-5-甲苯基。
本发明进一步涉及治疗被有齐多夫定抗性的HIV-1毒株感染的人细胞的方法，包括对所说细胞施用一定量的通式(I)化合物，以有效地逆转或抑制HIV-1毒株的齐多夫定抗性。
更确切地说，本发明涉及治疗遭受有齐多夫定抗性的HIV-1毒株感染的病人的方法，包括给所说病人施用药用载体和一定量的通式(I)化合物，以有效地逆转或抑制HIV-1毒株的齐多夫定抗性。
由WO92/00952可知通式(I)的化合物、其制备及其抗HIV-1的抗逆转录病毒特性。通过用其特定的旋转标志预先确定其名称来表明和/或识别下文通式(I)化合物的对映体形式。在本发明方法中特别优选的是左旋对映体。
最优选的化合物有α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺，α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺，(-)-α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺，或(-)-α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺，通常被称为Loviride。
本发明的方法来自意外的发现，即由事先存在齐多夫定抗性的病人获得的分离物在停止齐多夫定治疗并转换为用通式(I)的化合物治疗数月后再次变得对齐多夫定易感。用通式(I)的化合物进行治疗最常规地是给病人口服有效量的活性成分。为了在全天中维持有效的血浆水平，所说的有效量最好是在适当的时间间隔(例如每12、8或6小时)分2、3或4个指定亚剂量服用。包括用通式(I)的化合物进行治疗的本发明的方法也可以在维持齐多夫定治疗的同时进行。通式(I)化合物的有效量取决于化合物的性质，也有赖于所治病人病情的严重程度(特别是病毒负载)。例如，α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的每天用量可以是300-3000mg，分作2、3或4个亚剂量使用，其左旋对映体的每天用量大约是上述用量的一半，因此为150-1500mg，分2、3或4个亚剂量使用。α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的优选日用量包括每剂400mg的三次用量。作为更进一步的实例，α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的日用量为30-600mg，分作2、3或4个亚剂量使用，其左旋对映体的日用量为15-300mg，分作2、3或4个亚剂量使用。优选地，(-)-α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的日用量包括每剂100mg的三次用量。
实施例对携带具有多突变的齐多夫定抗性HIV-1毒株的一名病人进行本研究。在征得病人同意后中断已失效的齐多夫定治疗，代之以α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺治疗(Co.I，400mgt.i.d.po)。1.来自淋巴细胞或血浆的HIV-1的标准培养在数个时间点[开始治疗前2月(60天)、开始治疗后1个月(30天)和4个月(120天)]自新鲜的淋巴细胞和新鲜的血浆中分离标准的HIV-1。
将病人的血浆或淋巴细胞与经3·106PHA刺激的(植物凝血素，Sigma，St.Louis，Mo.，USA)HIV-1阳性供体的淋巴细胞一起培养。培养在5％CO2环境中于37℃进行。每3-4天更换培养基。当出现细胞死亡时，加入新鲜的。经PHA刺激的供体淋巴细胞。每3-4天监测培养中的细胞病变效应和上清是否存在HIV-1 P24抗原。继续培养5周。若共同培养物上清中的P24抗原浓度(由P24抗原捕获试验确定)单次测定超过1000pg/ ml或连续二次测定超过200pg/ml，则该样品考虑为病毒阳性。阳性分离物的上清被分成等份，于-70℃冻存。2.从病人分离的HIV对抗病毒化合物的敏感性阳性分离物的一等份试样与多个PHA刺激的供体淋巴细胞培养物一起培养。抗病毒化合物(α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺(Co.I)或齐多夫定)的系列稀释物加入培养物中。培养在5％CO2环境中于37℃进行。每3-4天更换培养基和药物。当出现细胞死亡时，加入新鲜的、PHA刺激的供体淋巴细胞。监测培养物的细胞病变效应和上清中是否存在P24抗原。当对照中(无抗病毒化合物)产生的P24浓度超过1000pg/ml，对所有经抗病毒处理的培养物进行P24抗原测试。计算需要抑制对照产生50％P240抗原的抗病毒化合物的浓度(IC50)。于不同的时间在各种情况下(实验编号)测定得自病人的分离物之敏感性。为了鉴别由逆转录病毒暴露于Co.I.所筛选出的突变，测定逆转录酶的核苷酸序列。如此所得的结果示于表1中。
表1
p><p>得自治疗转换前2个月的HIV-1分离物具有齐多夫定抗性和Co.I敏感性。治疗一个月后似未发生显著性改变。但4个月后发现HIV-1分离物变成Co.I抗性，并重新获得显著的齐多夫定敏感性。是在RT基因中发生了新的突变(Y181C)。
权利要求
1.具有通式(I)的化合物、其药用酸加成盐或其立体化学异构体在逆转或抑制人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)毒株的齐多夫定(3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷，AZT)抗性方面的制药应用，所说的通式(I)为 其中R表示2-硝基苯基或2-乙酰基-5-甲基苯基。
2.如权利要求1所定义的通式(I)化合物在治疗遭受齐多夫定抗性HIV-1毒株感染的人细胞方面的制药应用。
3.如权利要求1所定义的通式(I)化合物在治疗受齐多夫定抗性HIV-1毒株感染的病人方面的制药应用。
4.根据权利要求3的用途，其中的通式(I)化合物口服。
5.根据权利要求1、2或3的用途，其中的化合物是α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺、α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺、(-)-α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺、或(-)-α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺(loviride)。
6.根据权利要求4的用途，其中α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的日用量范围是300-3000mg，分2、3或4个亚剂量使用，或者其左旋对映体的日用量范围是150-1500mg，分2、3或4个亚剂量使用。
7.根据权利要求6的用途，其中α-[(2-硝基苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的日用量包括每剂400mg的三次用量。
8.根据权利要求4的用途，其中α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的日用量范围是30-600mg，分为2、3或4个亚剂量使用，或者其左旋对映体的日用量范围是15-300mg，分作2、3或4个亚剂量使用。
9.根据权利要求8的用途，其中α-[(2-乙酰基-5-甲苯基)氨基]-2，6-二氯苯乙酰胺的日用量包括每剂100mg的三次用量。
全文摘要
本发明涉及逆转或抑制HIV-1毒株齐多夫定抗性的方法，包括将病毒(或细胞或携带这类病毒的病人)与α-APA型非核苷逆转录酶抑制剂接触。
文档编号A61P31/12GK1118137SQ94191262
公开日1996年3月6日 申请日期1994年2月10日 优先权日1993年2月22日
发明者K·J·L·M·安德里斯, P·A·M·施托费尔斯 申请人:詹森药业有限公司