纤维蛋白原受体拮抗剂的制作方法

专利名称：纤维蛋白原受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明的背景本发明一般涉及调节细胞粘连，并涉及抑制纤维蛋白原和其他蛋白质与血小板的结合，以及涉及抑制血小板的聚集，具体地讲是向IIb/IIIa纤维蛋白原受体位点的血小板的聚集。纤维蛋白原是一种存在于血浆中的糖蛋白，它参与血小板聚集并参与纤维蛋白的形成。血小板是细胞样除核的片段，可在所有哺乳动物的血液中发现，它也参与血液的凝结。已知纤维蛋白原与IIb/IIIa受体位点的相互作用对于正常的血小板功能是必需的。
当血管被损伤或被其他成因因子所损伤时，血小板就粘连到被破坏的内皮下(sub endothethial)表面。随后，该粘连的血小板释放生物活性成分并聚集起来。聚集是由激动剂例如凝血酶、肾上腺素或ADP与特定的血小板膜受体的结合引起的。激动剂的刺激导致潜在的纤维蛋白原受体在血小板表面的暴露，以及纤维蛋白原与糖蛋白IIb/IIIa受体复合物的结合。
人们已尝试过使用天然产物和合成肽来测定粘连与血小板聚集的机理。例如，Rouslahti和Pierschbacher在Science，238，491-497(1987)中描述了存在于细胞外基质和血液中的粘连蛋白质，例如纤维结合素、vitronectin、osteopontin、胶原蛋白、thrombospondin、纤维蛋白原和von Willebrand因子。所述蛋白质含有三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)作为其糖蛋白IIb/IIIa识别位点。这些含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽由至少一族结构上相关的受体整合素(integrin)中的一个成员识别，所述的整合素是具有两个跨膜亚单元的杂二聚体蛋白质。该作者阐明在各蛋白质中三肽序列的构型对于识别特异性来讲可能是关键的。
Cheresh于Proc.Nat′l Acad.Sci，U.S.A.，84，6471-6475(1987)中描述了由人内皮细胞表达的Arg-Gly-Asp主导的粘连受体，它在结构上类似于在血小板上的IIb/IIIa复合物，但在抗原上和功能上不同。这种受体直接包含在与纤维蛋白原、von Willebrand因子和vitronectin粘连的内皮细胞中。
Pierschbacher和Rouslahti于J.of Biol.Chem.，262，(36)，17294-17298(1987)中假设，Arg-Gly-Asp序列单独就是受体识别和结合的足够的信号，并因此使三肽序列的构型是可测量的。制得了各种合成肽，该作者断定，由向此序列的对映体取代或加成所影响的Arg-Gly-Asp的立体化学构型显著地影响了受体-配体的相互作用。该作者还说明，通过在非末端残基Pen与Cys之间形成一个二硫化物桥产生的十肽环化，使得该肽在抑制与纤维结合素的粘连方面的效果极其低。
在Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.81，5985-5988(1984)中，相同的作者描述了纤维结合素的细胞识别位点的四肽变体，它保持着促进粘连的活性。具有一个四肽识别位点的肽类描述于美国专利4,589,881和4,614,517中。在纤维结合素的细胞结合区的许多大的多肽片段具有细胞粘连活性。例如参见美国专利4,517,686、4,661,111和美国专利4,578,079。
Ruggeri等人，于Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.83，5708-5712(1986)中探索了一系列设计成长度为16个残基的合成肽，它含有抑制纤维蛋白原与血小板结合的、与RGD的天冬氨酸残基连着的RGD和缬氨酸。也可参见Koczewiak等人，Biochem.23，1767-1774(1984)；Ginsberg等人，J.Biol.Chem.，260(7)，3931-3936(1985)；和Haverstick等人，Blood 66(4)，946-952(1985)。其他抑制剂公开于欧洲专利申请号275,748和298,820中。
许多低分子量多肽因子已知从蛇毒中分离得到。这些因子明显具有对gp IIb/IIIa复合物的高亲和力。例如，Huang等人，J.Biol Chem.，262，16157-16163(1987)；Huang等人，Biochemistry 28，661-666(1989)描述了毒液trigramin的主要结构，即含有RGD亚单元的72个氨基酸多肽。Echistatin是另一种毒液，它对gpIIb/IIIa复合物具有高亲和力。该多肽含有49个氨基酸，并具有RGD亚单元和各种二硫化物桥。Gan等人，J.Biol.Chem.，263，19827-19832(1988)。也可参见Dennis等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，87，2471-2475(1989)。然而，这些蛇毒因子也具有对其他包括vitronectin和纤维结合素受体的粘连性蛋白质受体成员的高亲和力，因此对gpIIb/IIIa复合物不具选择性。
尽管已知三肽序列Arg-Gly-Asp存在于可以加倍或抑制纤维结合素和vitronectin的促进细胞连接作用的某种多肽中，但是三肽Arg-Gly-Asp具有低活性。目前，对于偶合到该序列上的其他氨基酸是如何影响结合特异性的还没多少了解。转让给Merck&Co.，Inc.的美国专利5,023,233公开了小环六肽，它含有序列Arg-Gly-Asp，并且它是有用的血小板聚集抑制剂。美国专利5,037,808公开了使用吲哚基血小板聚集抑制剂，该抑制剂据信是通过拮抗纤维蛋白原和/或细胞外基质蛋白质和血小板gpIIa/IIIa受体之间的相互作用而起作用的。美国专利5,037,808公开了拟胍基肽化合物，它含有一种抑制血小板聚集的Asp残基。申请PCT/US90/02746描述了使用抗体-多肽轭合物，其中所述多肽含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列。
申请PCT/US91/00564公开了使用大环肽，它含有两侧为脯氨酸残基的RGD，并且为血小板聚集抑制剂。申请PCT/US90/03788公开了小环血小板聚集抑制剂，它是含有三肽序列Arg-Gly-Asp和环中一个硫醚键的合成的环状五肽。申请PCT/US90/05367(公开于1991年5月2日)还公开了使用肽和假肽，例如N-脒基-哌啶-3-羧基甘氨酰-L-天冬氨酰-L-缬氨酸，它可抑制哺乳动物血液中血小板聚集和血栓形成。欧洲专利申请号91103462公开了可包括内哌嗪基或哌啶基衍生物的线性化合物。转让给Merck&Co.，Inc.、并公开于1991年7月17日的欧洲专利申请号91300179.8公开了线性多肽纤维蛋白原受体拮抗剂。欧洲专利申请号90101404.3公开了化合物R1-A-(W)a-X-(CH2)b-(Y)c-B-Z-COOR，其中R1为胍基或脒基，且A和B选自特定的单取代的芳基或杂环基。
尽管被认为可通过纤维蛋白原抑制与血小板结合来抑制血小板聚集的大量化合物或肽类似物是已知的，然而本发明提供了新的纤维蛋白原受体拮抗剂，所述抑制剂具有显著的结合活性，并且因此，基于本文所述原因是有用的。许多非常严重的疾病和失调包括可导致血管内血栓和栓子的血栓形成过多并发症。心肌梗塞、中风、静脉炎和许多其他严重病症需要新的、有效的纤维蛋白原受体拮抗剂。
本发明的概括本发明化合物具有下式结构 或 例如 所述化合物具有纤维蛋白原受体拮抗剂活性。
本发明的详细描述 或 其中Q为 或Q为含有1、2或3个选自N、O或S的杂原子的、并且是未取代的或由R8取代的4-9元单环或二环环状系统；AB是共享相邻的碳和氮原子的稠合的环状系统，其中A为含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和或不饱和环；B为含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和或不饱和环；R1为H，C1-4烷基，N(R8)2，-N(R8)SO2R7，NR8CO2R7，NR8C(O)R7，NR8C(O)N(R7)R8，N(R8)SO2N(R7)R8，N(R8)SO2N(R8)C(O)OR7，C(O)N(R7)2，或与R6形成的环状基团，其定义如下；R2为H，C1-4烷基，C1-4支链烷基，C1-4烷基芳基，或芳基；R4为H，C1-4烷基，C1-4支链烷基，环状C1-4烷基或C1-4链烯基；R5为CH，-CH(CH2)n，一条键，或然后R5为邻近的N(R4)， R6为COOH，CH2OH，C(O)NR7)2，CO2R9，四唑，酰基磺酰胺，或 或与R1形成的环状基团，其定义如下；其中R1与R6形成的环状基团为 其中Y＝O或S；R7为H、取代或未取代的支链或直链C1-4烷基、支链或直链低级链烯基、C1-4烷基芳基、取代的芳基、或含有1、2或3个N、S或O杂原子的5或6元杂芳基，其中取代的烷基为羟基取代的或C1-4烷氧基取代的烷基，并且其中取代的芳基被一个、两个或三个下列基团取代卤素、C1-4烷氧基、羟基、或C1-4烷基；R8为H、支链或直链C1-4烷基；R9为H、C1-4烷基或芳基；n为0-7；n′为0-3和a为 或一条键，以及可药用盐。
在一个实施方式中，所述化合物具有下式结构 或 其中Q为 或 n＝0-7；n′＝0-3R4＝H、C1-4烷基、C1-4支链烷基、环状C1-4烷基或C1-4链烯基；R3＝CH、-CH(CH2)n、或一条键；R2为H、C1-4烷基、C1-4支链烷基、C1-4烷基芳基，或芳基；R1＝H、C1-4烷基、N(R8)2，-N(R8)SO2R7，NR8CO2R7，NR8C(O)R7，NR8C(O)N(R7)R8，N(R8)SO2N(R7)R8，N(R8)SO2N(R8)C(O)OR7，C(O)N(R7)2，或与R6形成的环状基团；R6＝COOH，CH2OH，C(O)NR7)2，CO2R9，四唑，酰基磺酰胺，或 或与R1形成的环状基团，其中R1与R6形成的环状基团为 其中Y＝O或S；R7＝H、取代或未取代的支链或直链C1-4烷基、支链或直链低级链烯基、C1-4烷基芳基、取代的芳基、或含有1、2或3个N、S或O杂原子的5或6元杂芳基，其中取代的烷基为被羟基取代的或被C1-4烷氧基取代的烷基，并且其中取代的芳基被一个、两个或三个下列基团取代卤素、C1-4烷氧基、羟基、或C1-4烷基；R8＝H、支链或直链C1-4烷基；R9＝H、C1-4烷基或芳基；a＝ 或一条键A＝含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和、部分饱和、或不饱和的环；B＝含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和、部分饱和、或不饱和的环，其中A和B形成一个共享相邻碳和氮原子的稠合的环状系统。
在本发明化合物中，具有不对称中心的组分以外消旋体、外消旋混合物、以及以单一的对映体和/或非对映体存在。所有异构形式均包括在本发明中。
在一类该实施方案中，所述化合物具有下式结构 AB选自下列基团 其中V为N或CR7，和D为CH2，CH2-CH2，CH2C(R7)2CH2，或 其中X＝N或CR3，其中R3＝CN，C(O)N(R7)R8， 或 和 在该类实施方案中的一小类中，所述化合物具有下式结构 其中AB为 其中V为N或CH，和D为CH2-CH2或CH2C(R4)2CH2，在另一类实施方案中，所述化合物具有下式结构 AB选自下列基团 其中V为N或CR7和D为CH2，CH2-CH2，CH2C(R7)2CH2，或 其中X＝N或CR3，其中R3＝CN，C(O)N(R7)R8， 或 和 其中y3为O或H2，在该类实施方案的一小类中，所述匕合物具有下式结构 a＝ 和AB选自 其中V为N或CR7，和D为CH2，CH2-CH2，CH2C(R7)2CH2，或 和 其中X＝N或CR3，其中R3＝CN，C(O)N(R7)R8， 或 在该类实施方案的另一小类中，所述化合物具有下式结构 a＝一条键；和AB选自 和 其中Y3为O或H2。
本发明化合物的具体实例是选自下列化合物及其可药用盐的化合物 和 本发明化合物的其他实例为 和 术语“可药用盐”是指本发明化合物的无毒盐，所述盐一般通过使游离碱与适宜的有机或无机酸反应来制备。代表性的盐包括下列盐乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、棒酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰阿散酸盐、己基间苯二酚盐、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、溴代甲烷、硝酸甲酯、硫酸二甲酯、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、棕榈酸盐、泛酸盐(panthothenate)、磷酸盐/磷酸氢盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱、甲苯磺酸盐、triethiodide、戊酸盐。
术语“药物有效量”是指可引起组织、系统或动物的生物学反应或医学反应的药物或药剂的量，这正是研究人员或临床医师所寻找的。术语“抗凝剂”包括肝素和华法令。术语“溶解血栓剂”包括链激酶和组织纤维蛋白溶酶原活化剂。术语“血小板抗聚集剂”包括例如阿司匹林、氯苄噻啶、和双嘧啶氨醇。
术语“烷基”是指直链或支链烷烃、链烯烃或炔烃。
术语“芳基”是指5-10元不饱和的单环或二环基团。
术语“杂芳基”是指含有1、2、3或4个杂原子的芳基。
术语“杂原子”是指N、O或S。
术语“环”除非另外更具体地定义外，是指具有5-10元的单环的或二环的饱和环。
术语“杂环”是指含有1、2、3或4个杂原子的环。
在本发明化合物中，杂芳基及杂环基含有不超过2个O原子或2个S原子。
术语“烷氧基”包括一个烷基部分，其中烷基如上所定义。
术语“芳烷基”和“烷芳基”包括一个烷基部分，其中烷基如上所定义，并包括一个芳基部分，其中芳基如上所定义。其中n可以分别为1-10或2-10的整数的Co-n或C1-n的定义是指芳烷基或烷芳基单元的烷基组分。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
术语“氧基”是指氧(O)原子，术语“氧代”是指(＝0)。术语“硫基”是指一个硫(S)原子。在该公开文本中所用的标准命名法中，所定义的侧链的末端部分是首先描述的，接着描述与连接点相邻的官能团。例如，由C1-6烷基羰基氨基取代的C1-5烷基等同于下式 烷基。
在下面的流程和实施例中，各种试剂符号具有下列意义BOC(Boc)叔丁氧羰基，Pd-C钯/活性炭催化剂，DMF 二甲基甲酰胺，DMSO二甲亚砜，CBZ 苄氧羰基，CH2Cl2二氯甲烷，CHCl3 氯仿，EtOH乙醇，MeOH甲醇，EtOAc 乙酸乙酯，HOAc乙酸，BOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺Oxone 过一硫酸钾LDA 二异丙基氨基化锂DMA N，N-二甲基苯胺，HOBT羟基苯并三唑。治疗本发明化合物可用于抑制与细胞附着活性有关的整合素蛋白质-复合物功能。它们可以施用到需要抑制人或哺乳动物血小板聚集或粘连的患者身上。
某些本发明化合物迅速地从循环中消除，并特别用于抑制血小板聚集。因此，这些化合物可用于外周动脉的外科手术(动脉移植、动脉内膜切除术)中和心血管手术中，在这些手术中，对动脉和器官的处理、及/或血小板与人造表面的相互作用导致血小板聚集和消耗。聚集的血小板可形成血栓和血栓栓塞(thromboemboli)。所述化合物可以被施用到这些外科手术患者身上，以预防血栓和血栓栓塞的形成。
本发明化合物可以以口服形式(例如片剂、胶囊剂(它们各自均包括持续释放或缓释制剂)、丸剂、粉剂、粒剂、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆剂、和乳剂)施用。同样，所述化合物可以以静脉内(单次快速静脉注射液或输注液)、腹膜内、皮下、舌下、鼻内或肌内形式施用，所有的使用形式对于药物领域的普通技术人员来讲是公知的。所需的有效而无毒性用量的化合物可以用作抗聚集剂。
本发明化合物可以施用到需要通过抑制纤维蛋白原与血小板膜糖蛋白复合物IIb/IIIa受体的结合来预防血栓形成的患者身上。所述化合物可用于外周动脉的外科手术(动脉移植、动脉内膜切除术)中和心血管手术中，在这些手术中，对动脉和器官的处理、及/或血小板与人造表面的相互作用导致血小板聚集和消耗。聚集的血小板可形成血栓和血栓栓塞(thromboem boli)。所述化合物可以被施用到这些外科手术患者身上，以预防血栓和血栓栓塞的形成。
体外循环一般用于心血管手术中，以便对血液充氧。血小板粘连在体外周线的表面。粘连取决于血小板膜上的gpIIb/IIIa与吸附到周线表面的纤维蛋白质之间的相互作用(Gluszko等人，Amer.J.physiol.，252(H)，615-621(1987))。从人造表面释放出来的血小板显示出减弱的止血作用。可以施用本发明化合物以预防粘连。
本发明化合物的其他应用包括预防溶解血栓疗法期间及之后的血小板血栓形成、血栓栓塞和再闭塞，及预防冠状和其他动脉的血管成形术后、以及冠状动脉分流术后的血小板血栓形成、血栓栓塞和再闭塞。所述化合物也可以用于预防心肌梗塞形成。
使用本发明化合物的剂量范围要按各种因素来选择包括患者的类型、种类、年龄、体重、性别和医学状况；待治疗病症的严重程度；给药途径；患者的肾功能与肝功能；以及所用的具体化合物或其盐。普通的有经验的医师或兽医可以容易地确定并规定预防、对抗或停止病症的发展所需的药物的有效量。
当用于所述作用时，本发明化合物的口服剂量为约0.01mg/kg体重/天(mg/kg/天)至约100mg/kg/天，优选0.05～100mg/kg/天，最优选0.1-20mg/kg/天。当静脉内施用时，在恒定速率输注期间，最优选的剂量为约1至约10μg/kg/分钟。有利地是，可以将本发明化合物每天分成2、3或4次的分开剂量施用。此外，本发明优选的化合物可以以鼻内形式通过局部使用适宜的鼻内载体施用，或者经皮途径，使用对本领域普通技术人员公知的经皮贴剂(patches)形式给药，为了以经皮给药系统形式给药，给药剂量当然在给药过程中始终要是连续的，而不能是间断的。
在本发明方法中，本文所详细描述的化合物可以构成活性成分，并且它们一般是与适宜的药用稀释剂、赋形剂或载体(本文中统称为“载体”物质)相混合的形式施用，所述适宜的药用稀释剂、赋形剂或载体是按照所需给药形式(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等)而适当选择的，并与常规药物实践一致。
例如，对于以片剂或胶囊剂形式口服给药来说，所述活性药物组分可以与口服的、无毒的、可药用的、惰性载体结合，例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露糖醇、山梨糖醇等；对于以液体形式口服给药来说，口服药物组分可以与任何口服的、无毒的、可药用的惰性载体例如乙醇、甘油、水等结合使用。此外，若需要或必要，也可将适合的粘合剂、润滑剂、崩解剂及着色剂掺入到该混合物中。适合的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖类(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米-增甜剂、天然和合成胶类(例如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡类等。在这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂(disintegrators)非限制性地包括淀粉甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
本发明化合物也可以以脂质体用药系统形式施用，例如小的单层囊、大单层囊、和多层囊。脂质体类可以由各种磷脂例如胆甾醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱来形成。
本发明化合物也可以通过使用单克隆抗体作为单独的载体来用药，本发明化合物分子偶合到这些单克隆抗体上。本发明化合物还可以与作为目标药物载体的可溶性聚合物偶合。所述聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基-丙基-异丁烯酰胺-苯酚、聚羟基-乙基-天冬酰胺-苯酚、或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。此外，本发明化合物也可以与用于实现药物的控制释放的一类可生物降解的聚合物偶合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯类、聚缩醛类、聚二氢吡喃类、聚氰基丙烯酸酯类、及水凝胶的交联的或两亲的嵌段共聚物。
本发明化合物也可以与适宜的抗凝剂共同施用，所述抗凝剂包括抗血小板剂，例如肝素、阿斯匹林、华法令、潘生丁和其他已知可抑制血块形成的化合物和药剂，以及溶解血栓的药剂例如纤维蛋白溶酶原活化剂或链激酶，以达到治疗各种血管病变的有益效果。
本发明的新化合物是按下列实施例中的方法制备的。最优选的本发明化合物是在这些实施例中详细阐述的任何或所有化合物。然而，这些化合物不应理解为形成仅仅被认为是本发明的范围，所述化合物或其部分的任何结合的本身均可构成一个范围。下列实施例进一步说明了制备各本发明化合物的细节。本领域技术人员可以容易地理解到，下列制备方法的条件和工艺的已知变体可以用于制备这些化合物。除非另外指出，所有温度均为摄氏温度。
除了下列制备方法之外，还指出了本发明的范围内的化合物的几个体外生物活性实施例。为说明起见，一个用于评估纤维蛋白原受体拮抗剂活性的试验是基于对ADP-刺激的血小板抑制作用的评估上的。聚集需要纤维蛋白原结合到并占据血小板纤维蛋白原受体位点上。纤维蛋白原结合抑制剂抑制聚集。在用于确定本发明中要求保护的化合物的抑制作用的ADP-刺激的血小板聚集测定法中，将人血小板从新鲜血液中分离出来，通过差速离心，接着在Sepharose 2B上在无二价离子的、含有2％牛血清白蛋白的Tyrode缓冲剂(pH7.4)中进行凝胶过滤，而将人血小板收集到酸性柠檬酸盐/右旋糖中。
血小板聚集是在37℃下在Chronolog集合度计上测定的。反应混合物含有经凝胶过滤的人血小板(2×108/ml)、纤维蛋白原(100微克/ml(μg/ml))、Ca2+(1mM)和待试化合物。所述聚集是通过在加入其他组分1分钟后加入10mM ADP开始的。然后，使反应进行至少2分钟。聚集的抑制程度表达为在无抑制剂的条件下所观察到的聚集的速率的百分数。IC50是相对于无所述化合物的对照样而言，抑制聚集50％的具体化合物的剂量。
下列实施例中，所有温度均为摄氏温度，除非另外指出。
流程A磺酰胺中间体化合物的制备 L-天冬酰胺-α-丁磺酰胺(也称N-(正丁基-磺酰基)-L-天冬酰胺)A-2将含有L-天冬酰胺(6.45g，48.9mmol)和NaOH(2.0g，50.0mmol)的100ml 50％含水二噁烷的溶液在冰浴中冷却至0℃。向该迅速搅拌的混合物中，在30分钟时间内交替加入NaOH(2.2g，55.0mmol)的50ml水溶液和纯的丁磺酰氯(7.0ml，53.9mmol)。减压条件下将反应溶液浓缩至体积为50ml，并冷却含水的残余物，用浓HCl酸化，并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取，有机萃取物用Na2SO4干燥，浓缩至体积为约50ml，加入无水乙醚(50ml)，所得的白色沉淀物用真空过滤法分离，得到A-2，mp.154-155℃。
L-β-Boc-α-丁磺酰氨基-β-氨基丙酸(也称2(S)-(正丁基磺酰氨基)-3-(N-Boc-氨基丙酸)A-3将含有NaOH(6.04g，151mmol)的50ml H2O溶液冷却至0℃，并加入溴(1.40ml，26.9mmol)。所得溶液在0℃搅拌5分钟，接着，立即加入A-2(5.23g，20.7mmol)和NaOH(1.66g，41.4mmol)的15ml H2O溶液，并将该混合物在0℃搅拌5分钟，然后加热至80℃，并在此温度下维持15分钟。然后将溶液冷却至25℃，并用12N HCl(11ml)酸化，并搅拌直至气体释放停止。然后通过加入2N NaOH使溶液呈碱性，并加入20ml THF和连二碳酸二叔丁酯(9.0g，41.4mmol)。在25℃搅拌过夜，减压除去THF，用乙酸乙酯(2×50ml)萃取碱性水相。然后用10％ KHSO4使水相呈碱性，并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。合并的酸性萃取物用Na2SO4干燥，过滤，并蒸发，得到白色固体A-3，mp.111-112℃。 2(S)-(正丁基磺酰氨基)-3-氨基丙酸(A-4)
将A-3(3.83g，11.8mmol)的200ml乙酸乙酯溶液冷却至0℃，使HCl气体鼓泡通过该溶液5分钟。然后将该溶液温热至25℃，并搅拌30分钟，然后减压浓缩至其体积的50％，用100ml乙醚稀释。所得白色固体通过真空过滤收集，得到固体状A-4。
2(S)-(正丁基磺酰氨基)-3-氨基丙酸乙酯(A-5)将A-4(1.0g，3.8mmol)的50ml无水乙醇溶液用HCl气体饱和，然后加热回流3.0h。蒸发溶剂，得到纯的白色固体状A-5。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ 4.38(m，2H)；4.32(m，1H)；4.23(m，2H)；2.85(m，2H)；1.65-1.45(m，4H)；1.3(t，2H)；0.96(t，3H).
N-甲苯磺酰基-L-天冬酰胺(A-6)将L-天冬酰胺(10.0g，75.7mmol)加入副装备有磁性搅拌棒和加料漏斗的500ml圆底烧瓶中。加入1N氢氧化钠(85ml，1.1当量)。将对甲苯磺酰氯(15.88g，83.27mmol)溶于乙酸乙酯(100ml)中。将该溶液在剧烈搅拌下加入到反应烧瓶中。将1N氢氧化钠(85ml，1.1当量)置于加料漏斗中，然后在2小时期间内在剧烈搅拌下滴加入反应瓶中。将反应混合物再于室温下搅拌2小时。将有机层与水层分离开，水层用乙酸乙酯(2×50ml)洗涤。将含水的液体冷却至0℃，然后用盐酸(浓)酸化。得到白色晶状固体，用热水重结晶，得到A-6。1HNMR(300MHz DMSO-d6)δ7.91(d，J＝8.79Hz，1H)；7.64(d，J＝8.06Hz，2H)；7.32(s，d(重叠的)，J＝8.06Hz，3H)；6.87(s，br，1H)；4.03(m，1H)；3.32(s，H2C)；2.49(m.1H)；2.43(d，d，J＝7.08，15.38Hz，1H)；2.35(s，3H)；2.21(d，d，J＝6.11，15.38Hz，1H).
2(S)-甲苯磺酰氨基-3-氨基丙酸(A-7)将含有NaOH(22.0g，550mmol)的100ml H2O溶液冷却至0℃，滴加入溴(5.03ml，97.5mmol)。将所得溶液在0℃搅拌10分钟，然后一次性加入A-6(21.5g，75.0mmol)与NaOH(6.68g，161mmol)的H2O(50ml)的冷(0℃)溶液。在0℃搅拌20分钟后，将反应加热至80℃，并在此温度下维持30分钟，然后冷却。用浓HCl将该冷却后的溶液调至pH＝7，所得白色固体经过滤，得到A-7。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.2-7.2(br，2H，(NH，COOH))；7.70(d，J＝8.18Hz，2H)；7.38(J＝8.18Hz，2H)；3.7-3.0(br，2H，(NH2，H2O))；3.12(q，J＝4.76Hz，1H)；2.99(d，d，J＝4.64，11.96Hz，1H)；2.79(d，d，J＝9.52，11.96Hz，1H)；2.36(s，3H).
叔丁基-2(S)-(甲苯磺酰氨基)-3-氨基丙酸(A-8)在1L耐压瓶中，将A-7(5.0g，19.4mmol)悬浮于二噁烷(100ml)中。将该瓶冷却至-15℃，并将异丁烯(100ml)冷凝至该二噁烷中。加入浓H2SO4(5ml)，并将该瓶密封，在室温下搅拌36小时。打开瓶，小心放空过量的异丁烯。该溶液用乙酸乙酯(200ml)稀释，用1N NaOH(200ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，过滤，蒸发得到白色晶状固体状的A-8。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.68(d，J＝8.18Hz，2H)；7.35(d，J＝8.18Hz，2H)；3.85(m，H)；2.93-2.79(m，2H)；2.32(s，3H)；1.38(s，9H). 2-肼基吡啶-3-甲酸叔丁酯(1-2)将6-氯-烟酸叔丁酯(735mg，3.44mmol)的乙醇(5ml)溶液冷却至0℃，并用溶于乙醇(5ml)中的无水肼(2.75g，86mmol)处理。使该混合物达到25℃，搅拌20小时，然后温热至60℃，并在此温度下维持2小时。将该混合物溶于水中，用乙酸乙酯萃取。有机部分用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩得到油状1-2，将其直接用于下一步骤中。吡啶-6-基]-甲酸叔丁酯(1-3)将1-2溶于35ml甲苯中，并缓慢加入到碳酸二(三氯甲基)酯(1.15g，3.9mmol)的甲苯(35ml)回流溶液中。该混合物进一步回流1.2小时，并冷却，加入到水中，用乙酸乙酯萃取。有机部分经Na2SO4干燥，浓缩，经硅胶快速色谱法纯化，得到1-3。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ＝1.58(s，9H)；7.25(d，1H)；7.45(d，1H)；8.25(s，1H)；12.40(s，1H). 2-(N-CBZ-哌啶-4-基)乙基碘(1-4)用氯甲酸苄基酯(6.05ml，42.5mmol)处理4-(2-羟基乙基)哌啶(Aldrich)(5.0g，38.7mmol)、饱和NaHCO3(50ml)和CH2Cl2(150ml)的混合物。在室温下搅拌2.5小时后，分离出有机层，并用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，然后过滤，浓缩，得到被保护的醇，为无色油状物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.26(m，5H)；5.13(s，2H)；4.23(d，2H)；3.63(t，2H)；2.85(t，2H)；1.83(d，2H)；1.68(m，2H)；1.43(m，1H)；1.03(m，2H)；将该被保护的醇(6.3g，23.9mmol)与Ph3P(7.0g，23.9mmol)、碘(6.06g，23.9mmol)和咪唑(1.95g，28.7mmol)在苯(100ml)中混合，并回流2.5小时。将该溶液冷却、过滤，然后浓缩。残余物经硅胶色谱法纯化(1∶1乙酸乙酯/己烷)，得到白色固体状1-4。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.26(m，5H)；5.14(s，2H)；4.23(d，2H)；3.86(m，4H)；1.85(d，2H)；1.68(m，2H)；1.45(m，1H)；1.03(m，2H).
3-[[(2，3-二氢-3-氧代-[2-(N-CBZ-哌啶-4-基)乙基]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶-6-基]甲酸(1-5)用粉末状碳酸钾(630mg)处理溶于20ml乙腈中的1-3(350mg，1.6mmol)，并加热至60℃，在此温度下维持20小时。将该混合物冷却至25℃，将其加入到水中，并用乙酸乙酯萃取。有机部分用Na2SO4干燥，浓缩，经硅胶快速色谱法纯化(35％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到所需的酯，为黄色油状物。
该叔丁酯粗品经用15ml二氯甲烷和15ml三氟乙酸在0℃下处理，然后温热至25℃，在此温度下维持1.2小时，而转化为酸。将该混合物真空浓缩至干，加入到水中，用乙酸乙酯萃取。有机部分用Na2SO4干燥，浓缩，用乙酸乙酯/乙醚(25/1)结晶，得到1-5，为浅黄色粉末。1H NMR(DMSO-d6，300MHzδ＝1.05(m，2H)；1.45(m，1H)；1.75(m，4H)；2.79(m，2H)；3.95(q，4H)；5.05(s，2H)；7.30(m，6H)；7.50(d，1H)；8.25(s，1H). 3-[[[(2，3-二氢-3-氧代-2-[2-(N-CBZ-哌啶-4-基)乙基]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶-6-基]羰基]氨基]丙酸(1-6)将1-5(75mg，0.18mmol)的二甲基甲酰胺(1ml)溶液依次用羟基苯并三唑(40mg，0.26mmol)、二异丙基乙基胺(87μl，0.5mmol)、2-氨基丙酸乙酯盐酸盐(40mg，0.26mmol)和EDC(50mg，0.26mmol)处理。将该混合物在25℃搅拌15小时。将该混合物溶于水中，用乙酸乙酯萃取。有机部分用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，得到所需的酯。
将该乙酯粗品溶于5ml THF、5ml水中，并用0.37ml 1N LiOH水溶液处理。将此混合物在25℃搅拌3小时，将混合物溶于水中，用乙酸乙酯萃取。有机部分用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，得到1-6，mp201-203℃(分解)。 3-[[[(2，3-二氢-3-氧代-2-(2-(哌啶-4-基)乙基]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶-6-基]羰基]氨基]丙酸(1-7)在0℃下，将1-6(64mg，0.129mmol)的乙腈(15ml)溶液用碘代三甲基甲硅烷(107.0mg，0.533mmol)处理，并将反应混合物搅拌0.5小时。反应混合物用水处理，用乙醚萃取，用硅胶色谱法纯化，用EtOH/NH4OH/H2O(10/1/1)洗脱，浓缩得到白色泡沫状物。用乙醇结晶，得到1-7，为白色固体，mp267-269℃。
2(S)-[(6-丁基磺酰基)氨基]-3-[[[2，3-二氢-3-氧代-2-[2-(N-CBZ-哌啶-4-基)乙基]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶-6-基]羰基]氨基丙酸(1-8)使1-5按对1-6所述方法偶合到A-4上，得到1-8。1H NMR(300MHz，DMSO d6)δ8.26(t，1H)，8.50(s，1H)；7.63(d，1H)；7.54(d，1H)；7.4-7.31(m，6H)；5.01(s，2H)；4.10(m，1H)；3.96(m，4H)；3.60(m，1H)；3.46(m，1H)；2.95(t，2H)；2.73(brm，2H)；1.71(m，2H)；1.53(m，2H)；1.46(m，1H)；1.01(m，2H)；0.83(t，3H).
2(S)-[(正丁基磺酰基)氨基]-3-[[[2，3-二氢-3-氧代-2-[2-(哌啶-4-基)乙基]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶-6-基]羰基]氨基丙酸(1-9)按1-7所述方法，用三甲基甲硅烷基碘在CH3CN中处理1-8，得到1-9。1H NMR(300MHz，D2O)δ8.10(s，IH)；7.43(d，1H)；7.15(d，1H)；4.00(m，4H)；3.60(d，2H)；3.31(m，2H)；3.23(d，2H)；3.93(m，2H)；3.81(t，2H)；1.93(d，2H)；1.80(m，2H)；1.6-1.23(m，7H)；0.85(t，3H).
流程2 6-甲基吡啶-3-甲酸甲酯(2-2)向装备有滴液漏斗立式冷凝器和CaCl2干燥管的250ml三颈烧瓶中置入6-甲基烟酸2-1(5g，36.5mmol)的100ml无水甲醇溶液。将反应溶液在冰丙酮浴中冷却至-15℃，并滴加SOCl2(5ml，69.1mmol)。然后将溶液加热回流3小时，之后冷却，减压除去溶剂。所得的白色固体用60ml饱和NaHCO3处理，并用CH2Cl2(3×50ml)萃取。合并的萃取液用Na2SO4干燥，过滤并减压蒸发。所得油状物经结晶后放置，得到白色固体状2-2。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.05(d，J＝1.4Hz，1H)；8.08(dd，J＝1.4和6.8Hz)；7.19(d，J＝6.8Hz，1H)；3.98(s，3H)；2.63(s，3H).
6-溴乙基吡啶-3-甲酸甲酯(2-3)
将2-2(10.6g，71.5mmol)与NBS(12.73g，71.5mmol)，100mg过氧化苯甲酰和200ml CCl4混合，在惰性气氛下一起回流18小时。将反应溶液冷却、过滤、浓缩，得到粘稠的橙色油状物，将其经硅胶快速色谱法纯化，用20％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到所需的吡啶基溴化物2-3。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.05(d，J＝1.4Hz，，IH)；8.08(dd，J＝1.4和6.8Hz)；7.19(d，J＝6.8Hz，1H)；5.38(s，2H)；3.98(s，3H).
6-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙氨基]-甲基吡啶-3-甲酸甲酯(2-5)向250ml烧瓶中放入2-3(1.0g，4.34mmol)、2-4(2.16g，10.0mmol)和K2CO3(0.66g，4.4mmol)在100ml无水CH3CN中的混合物，并回流3小时，然后冷却并过滤。减压浓缩滤液，在硅胶上进行色谱法纯化，使用10％CH3OH/EtOAc作洗脱剂，得到2-5，为黄色残余物。1H NMR(CDCl3)δ9.18(d，J＝1.4Hz，1H)；8.15(dd，J＝1.4和6.8Hz，1H)；7.39(d，J＝6.8Hz，1H)；4.08(brd，J＝12Hz，2H)；3.98(s，2H)；3.95(s，3H)；2.75(重叠的m，6H)；1.78(d，J＝12，Hz，2H)；1.5(重叠的m，4H)；1.4(s，9H)；0.98(m，2H).
1-(氯代羰基)-2，3-二氢-3-氧代-2-[[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]咪唑并[1，5-a]吡啶-6-基]甲酸甲酯(2-6)将2-5(480mg，1.27mmol)溶于50ml甲苯中，加入N，N-二甲基苯胺(645ml，4.08mmol)，并将该溶液冷却至0℃。向其中在30分钟内滴加入三光气(1.13g，3.18mmol)的15ml甲苯溶液。将该溶液之后加热至100℃，在此温度下维持1.5小时，然后冷却，用1N HCl、水和盐水(各50ml)洗涤两次，用Na2SO4干燥，蒸发，得到515mg黄色晶状固体2-6。1H NMR(CDCl3)δ8.82(d，J＝1.4Hz，1H)；8.25(d，J＝6.8Hz，1H)；7.91(d，J＝6.8Hz，1H)(dd，J＝1.4和6.8Hz，1H；4.08(brd，J＝12Hz，2H)；3.98(s，2H)；3.95(s，3H)；2.75(重叠的m，6H)；1.78(d，J＝12.Hz，2H)；1.5(重叠的m，4H)；1.4(s，9H)；0.98(m，2H). 1-[(N，N-二乙基氨基)羰基]-2，3-二氢-3-氧代-2-[[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]-咪唑并[1，5-a]吡啶-6-基]甲酸甲酯(2-7)将2-6(0.3g，0.64mmol)溶于100ml CH2Cl2中，加入二乙胺盐酸盐(105mg，0.97mmol)和50ml饱和NaHCO3溶液。将该两相混合物搅拌1小时，然后分离出有机层，用10％柠檬酸，然后用盐水(50ml)洗涤，用Na2SO4干燥，蒸发得到2-7。1H NMR(CDCl3)δ8.45(d，J＝1.4Hz，1H)；7.15(dd，J＝1.4和6.8Hz，1H)；6.78(d，J＝6.8Hz，1H)；4.08(m，4H)；3.95(s，3H)；3.51(m，4H)；2.75(m，3H)；1.78(d，J＝12.Hz，2H)；1.5(重叠的m，4H)；1.4(s，9H)；1.1(t，6H)；0.98(m，2H).
1-[[(N，N-二乙基氨基)羰基]-2，3-二氢-3-氧代-2-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]咪唑并[1，5-a]吡啶-6-基]羰基]氨基丙酸叔丁酯(2-8)
将2-7(315mg，0.64mmol)溶于10ml CH3OH中，加入15mlH2O和0.725ml 1N NaOH，并将混合物在室温下搅拌3.5小时。减压除去有机溶剂，含水的残余物用柠檬酸酸化，用CH2Cl2萃取。有机萃取液用H2O、盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，蒸发得到所需的酸。1H NMR(CDCl3)δ8.32(d，J＝1.4Hz，1H)；7.10(dd，＝1.4和6.8Hz，1H)；6.78(d，J＝6.8Hz，1H)；4.08(m，4H)；3.51(m，4H)；2.75(m，3H)；1.78(d，J＝12.Hz，2H)；1.5(重叠的m，4H)；1.4(s，9H)；1.1(t，6H)；0.98(m，2H).
将该酸(105mg，0.215mmol)溶于10ml CH2Cl2中，加入Et3N(48ml，0.47mmol)，将溶液冷却至-10℃。然后，加入氯甲酸异丁酯(30ml，2.36mmol)，将混合物在-10℃搅拌30分钟。向其中加入β-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(58.7mg，323mmol)和Et3N(32ml，0.323mmol)的10ml CH2Cl2溶液，并将溶液温热至室温。反应溶液用10％柠檬酸、水和盐水(各10ml)洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，经色谱法纯化得到2-8。1H NMR(CDCl3)δ8.16(s，1H)；7.02(d，J＝6.8Hz，1H)；6.78(d，J＝6.8Hz，1H)；6.63(t，5.6Hz，1H)；4.08(m，4H)；3.51(m，6H)；2.75(m，2H)；2.45(m，2H)；1.78(d，J＝12.Hz，2H)；1.5(重叠的m，6H)；1.4(s，9H)；1.37(s，9H)；1.1(t，6H)；0.98(m，2H).
1-[(N，N-二乙基氨基)羰基]-2，3-二氢-3-氧代-2-[2-(哌啶-4-基)乙基]咪唑并[1，5-a]吡啶-6-基]羰基]丙酸(2-9)将2-8(100mg，0.16mmol)溶于20ml乙酸乙酯中，在0℃下将无水HCl通过溶液中达5分钟，然后将该混合物在室温搅拌1小时。减压蒸发溶剂，残余物用乙酸乙酯研制，过滤，得到2-9。1H NMR(DMSO-d6)δ8.90(brs，1H)；8.60(brs，1H)；8.3(s，1H)；7.6(t，3H)；7.1(d，1H)；6.89(d，1H)；4.08(m，4H)；3.51(m.6H)；2.75(m，2H)；2.45(m，2H)；1.78(d，J＝12.Hz，2H)；1.5(重叠的m，6H)；1.1(t，6H)；0.98(m，2H). 2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙醇(2-11)将4-哌啶-2-乙醇(2-10)(Aldrich)(130g，1.0mol)溶于700ml二噁烷中，冷却至0℃，用3N NaOH(336ml，1.0mol)和连二碳酸二叔丁酯(221.8g，1.0mol)处理，撤去冰浴，将反应混合物搅拌过夜，浓缩，用水稀释，用乙醚萃取。合并乙醚层，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤，蒸发得到2-11。Rf＝0.37(1∶1 EtOAc/己烷，用茚三酮着色)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.07(bs，2H)；3.7(bs，2H)；2.7(t.J＝12.5Hz，2H)；1.8-1.6(m，6H)；1.51(s，9H)；1.1(ddd，J＝4.3，12.5，12Hz，2H).
2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基碘(2-12)将2-11(10.42g，0.048mol)溶于400ml苯中，在室温下加入咪唑(4.66g，0.068mol)、三苯膦(15.24g，0.05mol)和碘(0.048mol)。6小时后，过滤反应混合物，蒸发滤液，得到暗色残余物。将其经快速硅胶色谱法纯化(用10％ EtOAc/己烷洗脱)，得到2-12，为黄色油状物。
2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基胺(2-4)在室温下，向溶于DMSO(400ml)的2-12(27.9g，0.082mol)中加入叠氮化钠(5.01g，0.086mol)，所得溶液在65℃加热2小时。冷却了的反应混合物用250ml EtOAc稀释，用2×100ml水、2×50ml盐水萃取，然后用MgSO4干燥，除去溶剂，得到所需叠氮化物，为浅黄色油状物，Rf＝0.5(硅胶，70％丙酮/己烷)。
在室温下，向该叠氮化物(19.3g，0.076mol)在THF(400ml)/H2O(195ml)中的混合物中一次性加入三苯膦(80.0g，0.305mol)。在室温下将其搅拌3小时，然后在真空下除去有机溶剂。用10％KHSO4溶液将残余物酸化至pH2，并用4×100ml EtOAc萃取。有机萃取液用2×100ml 10％KHSO4萃取，合并水相，用2N NaOH将pH调至10。该溶液用4×200ml CH2Cl2萃取，将其合并，用MgSO4干燥，除去溶剂，得到油状2-4，Rf＝0.3(硅胶，用10％ CH3OH的CHCl3/NH3溶液洗脱)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.05(宽，2H)；2.72(t，J＝7.2Hz，2H)；2.62(m，2H)；1.64(d，J＝12.2Hz，2H)；1.43(s，9H)；1.42-1.32(m，5H)；1.09(m，2H).流程3 1-(2-溴乙基)吡唑-3，5-二甲酸二甲酯(3-2)用无水HCl气体处理吡唑-3，5-二甲酸(75g，431mmol)的1L无水甲醇溶液。之后，继续加入HCl达30分钟，将该溶液冷却至室温，放置16小时。然后将溶液加热回流3小时，然后冷却，减压除去溶剂。所得白色固体用600ml饱和NaHCO3处理，用CH2Cl2(3×500ml)萃取。合并的萃取液用Na2SO4干燥，过滤，减压蒸发。所得白色固体用甲醇重结晶，加入无水乙醚，得到吡唑-3，5-二甲酸二甲酯(3-1a)。1H NMR(CDCl3)δ7.38(s，1H)；3.98(s，3H)；3.93(s，3H).
将该酯(5.0g，27.2mmol)的150ml无水乙腈溶液用K2CO3(5.2g，40.0mmol)和1，2-二溴乙烷(25.0ml，291mmol)处理，在氩气氛下将所得混合物加热回流。25分钟后，冷却反应悬浮液，过滤，将滤液减压蒸发至干，并置于高真空管中达12小时。所得白色固体用己烷重结晶，得到白色固体状3-2。
1H NMR(CDCl3)δ7.38(s，1H)；5.03(t，J＝8.2Hz，2H)；3.98(s，3H)；3.93(s，3H)；3.75(t，J＝8.5Hz，2H). 吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]甲酸甲酯(3-3)将3-2(14.0g，48.0mmol)、二异丙基乙基胺(25ml，144mmol)、Boc-4-氨基乙基哌啶(12.0g，52.6mmol)和碘化钾(2.39g，0.3mmol)的250ml CH3CN溶液在N2气氛中回流4.5小时，然后冷却，过滤，并减压蒸发。所得黄色残余物用硅胶色谱法纯化，用EtOAc作洗脱剂，得到3-3，为灰白色晶状固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.15(s，1H)；4.29(t，J＝7.0Hz，2H)；3.93(brd，J＝12Hz，2H)；3.76(s，3H)；3.61(t，J＝5.3Hz，2H)；3.42(t，J＝7.3Hz，2H)；2.65(t，J＝7.6Hz，2H)；1.55(d，J＝12.5Hz，2H)；1.38(m，2H)；1.33-1.25(m，1H)；1.27(s，9H)；1.01(m，2H).
将含有LiOH(14.05mg，0.335mmol)的10ml H2O溶液加入到3-3(90.81mg，0.223mmol)的10ml CH3OH溶液中，并将混合物加热至60℃在此温度下维持2.5小时，然后冷却，减压除去CH3OH。所剩水相用10％柠檬酸水溶液酸化，用CH2Cl2(2×50ml)萃取。合并的有机萃取液用Na2SO4干燥，然后蒸发，得到所需酸，为白色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.43(s，1H)；4.48(t，J＝7.0Hz，2H)；4.01(brd，J＝12Hz，2H)；3.77(t，J＝5.3Hz，2H)；3.51(t，J＝7.3Hz，2H)；2.71(t，J＝8.3Hz，2H)；1.72(d，J＝12.5Hz，2H)；1.53(m，2H)；1.42-1.37(m，1H)；1.35(s，9H)；1.10(m，2H). 2(S)-[(正丁基磺酰基)氨基-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸(3-4)将氯甲酸异丁酯(1.75ml，13.35mmol)加入到含有该酸(4.98g，12.72mmol)和N-甲基吗啉(1.53ml，14.00mmol)的100ml THF的冷的(0℃)溶液中。在干燥氮气氛下搅拌该混合物。反应1小时后，用HPLC分析等份试样，表明反应的完全程度为＞90％。过滤除去N-甲基吗啉-HCl，将滤液倾入含有A-4(4.30g，16.54mmol)、异丙基乙基胺(4.27ml，33.10mmol)、THF(60ml)和H2O(20ml)的溶液中。然后减压从反应溶液中除去THF，剩余的含水部分用饱和KHSO4酸化，用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。合并的萃取液用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到红色油状物，由此形成白色固体状3-4。1H NMR(DMSO-d6)δ8.31(t，J＝6Hz，1H)；7.62(d，J＝8.5Hz，1H)；7.01(s，1H)；4.43(t，J＝6.6Hz，2H)；4.11(m，1H)；3.92(d、J＝12Hz，2H)；3.80(t，J＝6.6Hz，2H)；3.51(t，J＝7.3Hz，2H)；3.65(m，2H)；3.51(t，J 6.8Hz，2H)；2.96(t，J＝7.2Hz，2H)；1.70(d，J＝11Hz，2H)；1.53(m，2H)；1.60-1.49(重叠的m，5H)；1.40(s，9H)；1.28(q，J＝7.1Hz，2H)；1.05(m，2H)；0.79(t，J＝7.1Hz，3H).
2(S)-[(正丁基磺酰基)氨基]-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸单盐酸盐(3-5) 将3-4(278mg，0.437mmol)的30ml乙酸乙酯溶液冷却至0℃，并将HCl气体鼓泡通入3分钟。将反应混合物温热至室温，搅拌30分钟，然后在旋转蒸发器上蒸发至干。所制的白色固体用乙醇/水(90∶10)重结晶，过滤，并用P2O5真空干燥，得到白色固体状3-5。1H NMR(DMSO-d6)δ8.95(brs，1H)；8.33(t，J＝5.7Hz，1H)；7.64(d，J＝9Hz，1H)；7.02(s，1H)；4.35(t，J＝5.1Hz，2H)；4.10(m，1H)；3.81(t，J＝5.2Hz，2H)；3.6-3.4(m，4H)；3.21(d，J＝10.5Hz，2H)；2.95(t，J＝7.8Hz，2H)；2.81(brm，2H)；1.96(d，J＝11Hz，2H)；1.62-1.2(重叠的多重峰，9H)；0.80(t，J＝7.3Hz，2H).流程4 2(S)-N-苄氧羰基氨基-3-氨基丙酸甲酯盐酸盐(4-1a)将可商购的2(S)-N-苄氧羰基氨基-3-氨基丙酸(Fluka)在HCl甲醇溶液中回流2.5小时，然后蒸发，残余物用甲醇/乙醚结晶，得到白色固体状4-1a。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.63(m，5H)；5.93(d，1H)；5.15(s，2H)；4.56(m，1H)；3.95-3.83(m，2H)；3.73(s，2H). 2(S)-[(CBZ)氨基]-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基]丙酸甲酯(4-2)在N2气氛下在室温下，将3-3(5.6g，14.0mmol)、Nα-Cbz-L-2，3-二氨基丙酸甲酯盐酸盐(4-1a)(4.5g，15.5mmol)、HOBT(2.37g，15.5mmol)、和Et3N(4.1ml，29.5mmol)的65ml无水DMF溶液搅拌48小时。减压除去DMF，残余物溶于700ml乙酸乙酯中，用饱和NaHCO3溶液、H2O、10％柠檬酸、H2O和盐水(各1×100ml)依次洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并蒸发。所得透明玻璃状物经硅胶色谱法纯化，用3％CH3OH/CH2Cl2作洗脱剂，得到白色固体状纯的4-2。1H NMR(CDCl3)δ7.43(m，5H)；7.35(s，1H)；7.18(t，J＝6.5Hz，1H)；5.98(d，J＝6.8Hz，1H)；5.09(s，2H)；4.59(m，1H)；4.38(m，2H)；4.10(brd，J＝12Hz，2H)；3.8(s，3H)；3.73(t，J＝5.3Hz，2H)；2.71(t，J＝8.3Hz，2H)；1.72(d，J＝12.5Hz，2H)；1.53(m，2H)；1.42-1.37(m，1H)；1.35(s，9H)；1.10(m，2H).
2(S)-氨基-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基]丙酸甲酯(4-3)向4-2(6.3g，10.26mmol)的700ml CH3OH的混合物中加入650mg 10％Pd/C，将所得混合物在1个H2气压中搅拌48小时。用硅藻土过滤除去催化剂，浓缩滤液，得到无色玻璃状物，将其用Et2O研制，过滤得到白色固体状4-3。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.43(m，5H)；7.35(s，1H)；7.18(t，J＝6.5Hz，1H)；5.98(d，J＝6.8Hz，1H)；5.09(s，2H)；4.59(m，1H)；4.38(m，2H)；4.10(brd，J＝12Hz，2H)；3.81(s，3H)；3.73(t，J＝5.3Hz，2H)；2.71(t，J＝8.3Hz，2H)；1.72(d，J＝12.5Hz，2H)；1.53(m，2H)；1.42-1.37(m，1H)；1.35(s，9H)；1.10(m，2H).
2(S)-(乙酰氨基)-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基]-丙酸甲酯(4-4)将乙酐(70ml，0.76mmol)加入到4-3(350mg，0.69mmol)的10ml THF的冷(0℃)溶液中。使所得溶液温热至室温，并搅拌18小时，然后浓缩，残余物溶于50ml乙酸乙酯中，依次用NaHCO3、H2O、10％/KHSO4、H2O和盐水(各25ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，蒸发，得到无色残余物，将其经硅胶色谱法纯化，用3％CH3OH/CH2Cl2洗脱，得到白色固体状4-4。1H NMR(CDCl3)δ7.29(s，1H)7.24(t，J＝6.4Hz，1H)；6.81(d，J＝7.6Hz，1H)；4.79(m，1H)；4.38(m，2H)；4.10(brd，J＝12Hz，2H)；3.81(s.3H)；3.80(m，2H)；3.73(t，J＝5.3Hz，2H)；2.71(t，J＝8.3Hz，2H)；2.01(s，3H)；1.72(d，J＝12.5Hz，2H)；1.57(m，2H)；1.42-1.37(m，1H)1.37(s，9H)；1.09(m，2H).
2(S)-(乙酰氨基)-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸(4-5)将4-4(203mg，0.38mmol)、1N LiOH(0.76ml，0.76mmol)、H2O、CH3OH、和THF(各5ml)的溶液在室温下搅拌过夜。减压除去有机溶剂，剩余溶液用25ml H2O稀释，用10％KHSO4使溶液呈酸性，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发得到所需酸。1H NMR(CDCl3)δ7.93(br，1H)；7.81(br，1H)；7.29(s，1H)；4.79(m，1H)；4.348(m，2H)；4.10(brd，J＝12Hz，2H)；3.80(brm，2H)；3.73(br，t，2H)；2.71(t，J＝8.3Hz，2H)；2.11(s，3H)；1.72(d，J＝12.5Hz，2H)；1.57(m，2H)；1.42-1.37(m，1H)；1.37(s，9H)；1.12(m，2H). 将该酸(169mg，32.8mmol)溶于50ml乙酸乙酯中，并冷却至0℃，用无水HCl处理30分钟。
真空除去溶剂，残余物用无水乙醚研制、过滤，用P2O5干燥，得到4-5，为白色固体，mp.150-156℃。
2(S)-[(Cbz-氨基)]-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Cbz-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸(4-6)使用对3-4所述方法，使4-3偶合到Nα-CBZ-L-2，3-二氨基-丙酸(Fluka)(4-1)上，得到4-6，即双保护的产物。
2(S)-氨基-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸在Pd/C存在下，用H2处理4-6，得到所需酸，mp.157℃。然后Boc基团用HCl/EtOAc按常规方式除去，得到纯的4-7，mp.195-198℃。
2(S)-[(正丁基磺酰氨基)]-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[，2-(N-CBZ-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羧基]氨基丙酸甲酯(4-8)将4-3(0.30g，0.61mmol)、正丁基磺酰氯(0.16g，0.91mmol)、和N-甲基吗啉的50ml THF溶液在室温下搅拌1.2小时。减压蒸发溶剂，将所得油状物溶于CH2Cl2(50ml)中，用10％ KHSO3(50ml)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，并蒸发。所得残余物用硅胶色谱法纯化，得到4-8，为无色玻璃状物。1H NMR(CDCl3)δ8.31(t，J＝6Hz，1H)；7.62(d，J＝8.5Hz，1H)；7.01(s，1H)；4.43(t，J＝6.6Hz，2H)；4.11(m，1H)；3.92(d，J＝12Hz，2H)；3.83(s，3H)；3.80(t，J＝6.6Hz，2H)；3.51(t，J＝7.3Hz，2H)；3.65(m，2H)；3.51(t，J＝6.8Hz，2H)；2.96(t，J＝7.2Hz，2H)；1.70(d，J＝11Hz，2H)；1.53(m，2H)；1.60-1.49(重叠的m，5H)；1.40(s，9H)；1.28(q，J＝7.1Hz，2H)；1.05(m，2H)；0.79(t，J＝7.1Hz，3H).
流程5
流程5(续)
1-(3-溴丙基)吡唑-3，5-二甲酸二甲酯(5-1)按对3-2所述方法，使用1，3-二溴丙烷制得化合物5-1，为白色晶状固体。1H NMR(CDCl3)δ7.38(s，1H)；4.95(t，J＝8.2Hz，2H)；3.95(s，3H)；3.92(s，3H)；3.75(t，J＝8.5Hz，2H)2.51(m，2H).
1-(3-叠氮基丙基)吡唑-3，5-二甲酸二甲酯(5-2)用NaN3(0.883g，13.8mmol)处理5-1(1.0g，3.45mmol)的10ml DMSO溶液，并将混合物在25℃搅拌5小时。接着，反应混合物用100ml H2O稀释，然后用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。合并的有机萃取液用水(2×100ml)和盐水(1×100ml)洗涤，用Na2SO4干燥，蒸发得到无色油状的5-2。
5，6，7，8-四氢-4-氧代-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]-甲酸甲酯(5-3)5-2(851mg，3.25mmol)的100ml无水EtOH溶液用100mg 10％Pd/C处理，并将该混合物在45psi条件下在帕尔氢化器中振摇5小时。催化剂经硅藻土过滤除去，蒸发滤液，得到800mg无色油状物。该物质经NMR分析，表明它是1-(3-氨基丙基)二甲基吡唑-3，5-二甲酸酯和环状二氮杂酮(diazapineone)的混合物。将此混合物溶于50ml苯中，回流15小时，然后蒸发。所得褐色固体经CH2Cl2/己烷重结晶，得到白色固体状5-3。m.p.＝220-221℃.1H NMR(CDCl3)δ7.36(s，1H)；6.42(brt，1H)；4.58(t，J＝8.0Hz，2H)；3.95(s，3H)；3.39(dt，J＝7.2Hz，2H)；2.31(m，2H).
5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]-4 H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]-甲酸甲酯(5-5)向5-3(175mg，0.83mmol)的50ml DMF溶液中加入60％NaH(36mg，0.91mmol)，将混合物在N2下在-15℃搅拌30分钟。向该混合物中在20分钟内滴加入2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基碘(5-4)(283mg，0.83mmol)的25ml DMF溶液。所得溶液在-15℃搅拌30分钟，然后温热至室温，并搅拌过夜。减压蒸发掉DMF，将残余物再溶于乙酸乙酯中，过滤，经硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯作洗脱剂，得到纯的5-5，为玻璃状物。1H NMR(CDCl3)δ7.24(s，1H)；4.50(t，J＝7.0Hz，2H)；3.93(brd，J＝12Hz，2H)；3.94(s，3H)；3.61(t，J＝5.3Hz，2H)；3.42(t，J＝7.3Hz，2H)；2.7(brt，J＝6.3Hz，2H)；2.3(m，2H)；1.55(d，J＝12.5Hz，2H)；1.38(m，2H)；1.33-1.25(m，1H)；1.27(s，9H)；1.01(m，2H).
5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]-甲酸(5-6)5-5(166mg，0.395mmol)的10ml CH3OH溶液用1N NaOH(0.435mg，0.43mmol)处理。所得溶液在室温下搅拌18小时，然后减压除去CH3OH，剩余的水相用10％柠檬酸水溶液酸化，用CH2Cl2(2×50ml)萃取。合并的有机萃取液用Na2SO4干燥，然后浓缩，得到白色固体状5-6。1H NMR(CDCl3)δ7.29(s，1H)；4.52(t，J＝7.0Hz，2H)；4.12(brd，J＝12Hz，2H)；3.94(s，3H)；3.61(t，J＝5.3Hz，2H)；3.42(t，J＝7.3Hz，2H)；2.7(brt，J＝6.3Hz，2H)；2.3(m，2H)；1.55(d，J＝12.5Hz，2H)；1.38(m，2H)；1.33-1.25(m，1H)；1.27(s，9H)；1.01(m，2H).
2(S)-[(正丁基磺酰基)氨基]-3-[[[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]-二氮杂-2-基]羰基]氨基丙酸乙酯(5-7)5-6(147mg，0.36mmol)与CH2Cl2/5ml的混合物用2(S)-正丁磺酰氨基-3-氨基-丙酸乙酯(A-5)(115mg，0.40mmol)、HOBT(49mg，0.36mmol)和Et3N(0.10ml，0.724mmol)与50mlCH2Cl2的混合物处理，该溶液在N2气氛下在室温搅拌18小时。反应溶液用饱和NaHCO3、H2O、10％柠檬酸、H2O和盐水(各1×20ml)依次洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。所得澄清玻璃状物经硅胶色谱法纯化，使用5％CH3OH/EtOAc作洗脱剂，得到纯5-7。1H NMR(CDCl3)δ7.32(s，1H)；7.24(t，J＝6.8Hz，1H)；5.54(t，J＝7.2Hz，1H；4.43(t J＝7.8Hz，2H)；4.32(m，1H)；4.28(q，J＝7.1Hz，2H)；4.10(brd，J＝12Hz，2H)；3.85(m，2H)；3.61(t，J＝5.3Hz，2H)；3.42(t，J＝7.3Hz，2H)；3.03(t，J＝7.1Hz，2H)；2.7(brt，J＝6.3Hz，2H)；2.3(m，2H)；1.65-1.45(重叠的m，7H)；1.38(m，2H)；1.33-1.25(m，1H)；1.37(s，9H)；1.30(t，J＝7.4Hz，3H)；1.01(m，2H)；0.96(t，J＝7.3Hz，3H).
2(S)-[(正丁基磺酰基)氨基]-3-[[[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]-二氮杂-2-基]羰基]氨基丙酸(5-8)向5-7(100mg，0.156mmol)的10ml CH3OH溶液中加入1NNaOH(160ml，0.16mmol)和H2O(10ml)。所得溶液在室温搅拌3.5小时，然后减压除去CH3OH。剩余的水相用10％柠檬酸水溶液酸化，用CH2C12(2×50ml)萃取。合并的有机萃取液用Na2SO4干燥，然后蒸发，得到所需酸。1H NMR(CDCl3)δ17.24(t，J＝6.8Hz，1H)；7.28(s，1H)；6.0(d，J＝7.2Hz，1H)；4.43(t，J＝7.8Hz，2H)；4.32(m，1H)；4.10(brd，J＝12Hz，2H)；3.85(m，2H)；3.61(t，J＝5.3Hz，2H)；3.42(t，J＝7.3Hz，2H)；3.03(t，J＝7.1Hz，2H)；2.7(brt，J＝6.3Hz，2H)；2.3(m，2H)；1.65-1.45(重叠的m，7H)；1.38(m，2H)；1.33-1.25(m，1H)；1.37(s，9H)；1.01(m，2H)；0.96(t，J＝7.3Hz，3H).
将该酸(89mg)在15ml乙酸乙酯中冷却至0℃，并鼓泡通入HCl气体达3分钟。将反应混合物温热至室温，搅拌30分钟，然后在旋转蒸发仪上蒸发至干。剩余的白色固体用乙醚研制，过滤，真空干燥(用P2O5)，得到5-8，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ8.95(brs，1H)；8.33(t，J＝5.7Hz，1H)；7.64(d，J＝9Hz，1H)；7.02(s，1H)；4.35(t，J＝5.1Hz，2H)；4.10(m，1H)；3.81(t，J＝5.2Hz，2H)；3.6-3.4(m，4H)；3.21(d，J＝10.5Hz，2H)；2.95(t，J＝7.8Hz，2H)；2.81(brm，2H)；1.96(d，J＝11Hz，2H)；1.62-1.2(重叠的多重峰，9H)；0.80(t，J＝7.3Hz，2H).
流程6
6-1A，顺式6-1B，反式 3-氧代-2-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]八氢咪唑并[1，5-a]吡啶-6-基]甲酸乙酯(6-1A，6-1B)将2-6(514mg，1.1mmol)溶于25ml丙酮中，加入10mlH2O，并将混合物加热至60℃，在此温度下维持3.5小时。减压除去丙酮，过滤所得的黄色沉淀。该粗物质溶于100ml甲苯中，并回流3小时，蒸发甲苯，得黄色固体。
将该固体(500mg，1.11mmol)溶于100ml乙醇中，加入75mg10％Pd/C，在帕尔氢化器中在55psi条件下将混合物振摇13小时。用硅藻土过滤除去催化剂，蒸发溶剂。所得无色油状物进行硅胶色谱法纯化，用70％乙酸乙酯/30％己烷洗脱，得到268mg顺式还原产物6-1A和132mg反式产物6-1B。异构体6-1A1H NMR(CDCl3)δ4.15(m，1H)；4.06(m，2H)；3.68(s，3H)；3.41(m，2H)；3.22(m，1H)；2.90(m，1H)；2.80(m，2H)；2.68(m，2H)；2.43(m，1H)；2.16(m，1H)；1.81(m，1H)；1.69(m，2H)；1.60(m，1H)；1.45(s，9H)；1.43(m，3H)；1.39(m，1H)；1.11(m，2H).异构体6-1B1H NMR(CDCl3)δ4.34(m，1H)；4.06(m，2H)；3.69(s，3H)；3.40(m，3H)；3.36(m，1H)；3.30(m，1H)；3.11(m，1H)；2.89(m，1H)；2.84(m，1H)；2.67(m，2H)；2.63(m，1H)；2.30(m，1H)；1.69(m，2H)；1.67(m，2H)；1.60(m，1H)；1.45(s，9H)；1.41(m，1H)；1.09(m，2H).
(±)-顺式-[[3-氧代-2-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]八氢咪唑并[1，5-a]呲啶-6-基]羰基]氨基]丙酸叔丁酯(6-2)按对1-6所述方法，用1N NaOH与CH3OH/H2O的混合物水解6-1A，得到所需酸。该酸按对2-8所述方法与β-氨基丙酸叔丁酯偶合，得到6-2。1H NMR(CDCl3)δ6.32(t，1H)；4.06(m，2H)；3.98(m，1H)；3.56(m，5H)；3.21(m，2H)；2.91(m，1H)；2.92(m，1H)；2.80(m，2H)；2.40(t，2H)；2.23(m，1H)；2.09(m，1H)；1.81(m，3H)；1.69(m.2H)；1.60(m，1H)；1.45(s，18H)；1.43(m，3H)；1.11(m，2H).
(±)-顺式-3-氧代-2-[2-(哌啶-4-基)乙基]八氢咪唑并[1，5-a]吡啶-6-基]羰基]氨基丙酸(6-3)将6-2(65.3mg，0.13mmol)溶于10ml无水CH2Cl2中，并冷却至0℃。加入三氟乙酸(0.200ml)，将溶液搅拌1小时，然后减压蒸发，得到纯的6-3。1H NMR(CD3OD)δ4.06(m，2H)；3.91(m，1H)；3.56(m，5H)；3.21(m，2H)；2.91(m，1H)；2.92(m，1H)；2.80(m，2H)；2.40(t，2H)；2.23(m，1H)；2.09(m，1H)；1.81(m，3H)；1.68(m，2H)；1.60(m，1H)；1.28(m，3H)；0.91(m，2H).
流程7 2(S)-[(N-CBZ-氨基磺酰基)氨基]-3-[[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(N-BOC-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基]丙酸甲酯(7-1)向异氰酸氯代氨磺酰酯(45.1μl，0.508mmol)的二氯甲烷的0℃溶液中加入苄基醇(53ml，0.508mmol)。反应在0℃老化90分钟，加入含有三乙胺(142ml，1.02mmol)的4-3(250mg，0.508mmol)的二氯甲烷溶液。使反应混合物温热至室温，并搅拌过夜(18小时)。用硫酸氢钠水溶液将反应混合物调至pH＝3.0，产物用二氯甲烷(3×10ml)萃取，合并有机萃取液，浓缩在硅胶上进行色谱法纯化(洗脱剂为95％二氯甲烷，5％甲醇)，得到7-1。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.40(s，9H)，2.65(t，2H)，3.65(s，3H)，5.10(s，2H)，6.65(d，1H)，7.2-7.5(m，6H)，8.90(s，1H)2(S)-[(N-CBZ-氨基磺酰基)氨基]-3-[[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸(7-2)向7-1(100mg)的THF(5ml)溶液中加入1N LiOH(0.6ml)，将该混合物在室温搅拌18小时。反应混合物通过加入硫酸氢钠水溶液(pH＝3.0)来处理，并将产物用乙酸乙酯(2×15ml)萃取。浓缩萃取液，得到所需酸。1H NMR1.4(s，9H)，2.6(br，t，2H)，7.1-7.2(br，m，5H)，7.3(s，1H).
将该酸溶于EtOAc中，冷却至-5℃，用HCl(气体)处理。浓缩反应混合物，用乙酸乙酯冲洗，得到7-2，mp＞200℃(分解)。
CHN分析计算值C，44.86；H，5.92；N，14.20实测值C，44.50；H，6.09；N，13.802(S)-(氨基磺酰基)氨基-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸(7-3)用10％ Pd/C(35mg)处理7-2(70mg)的甲醇(20ml)溶液，并将该混合物氢化(1大气压)过夜(18小时)。该混合物经过滤和浓缩，得到46mg油状物。将该油状物溶于乙酸乙酯中，冷却至0℃，并鼓泡通入HCl气体达30分钟以上。浓缩反应混合物，得到7-3。为白色固体，mp＞200℃，FAB MS，M＋1＝458。
流程8 1-(2-溴乙基)吡咯-2，4-二甲酸二乙酯(8-2)将吡咯-2，4-二甲酸二乙酯(5.50g，29.4mmol)的四氢呋喃(200ml)溶液在冰浴中冷却，将NaH(60％)(6.5g，68.6mmol)的四氢呋喃(50ml)悬浮液连续地加入。将反应瓶温热至室温。在室温下搅拌1小时后，加入1，2-二溴乙烷(25.2ml，294mmol)，并将混合物回流24小时。向反应烧瓶中加入水(50ml)。用旋转蒸发仪蒸发该混合物，以除去四氢呋喃。向残余物中加入饱和碳酸氢钠溶液(100ml)，所得溶液用二氯甲烷(4×50ml)萃取。合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥。干燥剂经过滤除去，滤液经旋转蒸发仪蒸发，得到黄色固体。该物质用己烷-乙酸乙酯80∶20重结晶，得到8-2，为黄色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ7.83(d，1H)；7.15(d，1H)；4.69(t，2H)；4.25(m，4H)；3.78(t，2H)；3.31(H2O)；1.29-1.22(m，6H).-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]吡咯并[1，5-a]吡嗪-2-基]甲酸乙酯(8-3)将烷基溴8-2(3.30g，10.4mmol，1.0当量)、2-4(3.52g，15.5mmol，1.5当量)、碘化钾(5.18g，31.2mmol)、二异丙基乙基胺(5.42ml，31.2mmol，3.0当量)和乙腈(50ml)混合。将该悬浮液加热回流24小时，然后进行旋转蒸发，以除去乙腈。加入饱和碳酸氢钠溶液(100ml)，将该溶液用乙酸乙酯(5×50ml)萃取。合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥，浓缩为褐色油状物。粗产物用硅胶柱色谱法纯化。用二氯甲烷然后用含有1％甲醇的二氯甲烷洗脱色谱柱，得到纯的8-3，为白色固体。1H NMR(CDCl3)δ7.32(d，1H)；7.29(d，1H)；4.28(q.2H)；4.19-4.00(m，4H)；3.7-3.6(t，2H)；3.6-3.5(t，2H)；2.68(t.2H)；1.8-1.7(m，br，2H，H2O)；1.6-1.4(s，m，11H)；1.33(t，3H)；1.2-1.1(m，2H).-四氢-4-氧代-5-[2-(N-Boc-哌啶-4-基)乙基]吡咯并[1，5-a]吡嗪-2-基]氨基丙酸叔丁酯(8-4)在装备上一磁性搅拌棒的50ml圆底烧瓶中混合8-3(620mg，1.54mmol)、氢氧化锂一水合物(160mg，4.00mmol，2.6当量)、水(15ml)和甲醇(10ml)。将该溶液在室温下搅拌4小时，然后加热至90℃，并在此温度下维持1小时。任何剩余的甲醇通过旋转蒸发除去，含水的残余物用10％K2SO4酸化，然后用乙酸乙酯(4×50ml)萃取。合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，得到所需酸，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ7.51(d，2H)；6.84(d，1H)；4.19(m，2H)；3.90(d，br，2H)；3.63(m，2H)；3.43(m，2H)；3.4-3.2(H2O)；2.6-2.8(br，2H)；1.66(d，2H)；1.43(m，2H)；1.36(s，9H)；1.1-0.9(m，2H).
在装有一磁性搅拌棒的100ml圆底烧瓶中混合上述酸(150mg，554mmol)、EDC(117mg，0.609mmol)、1-羟基苯并三唑(82.2mg0.609mmol)、三乙胺(0.300ml，1.11mmol，4.0当量)，β-氨基丙酸叔丁酯(111mg，0.609mmol)和二氯甲烷(10ml)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。从反应烧瓶中旋转蒸发掉溶剂，所得残余物用硅胶柱色谱法纯化，色谱柱用二氯甲烷、含有2％甲醇的二氯甲烷、然后用含有4％甲醇的二氯甲烷洗脱。合并含有产物的级分，得到8-4，为白色固体。1H NMR(CDCl3)δ7.32(d，1H)；7.04(d，1H)；6.58(m，1H)；4.2-4.0(m，4H)；3.7-3.5(m，6H)；2.68(t.2H)；2.51(t，2H)；1.70(m，3H，H2O)；1.53(m，2H)；1.45(s，9H)；1.21-1.0(m，2H).
4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基][1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸(8-5)在50ml圆底烧瓶中混合酯8-4(180mg，0.347mmol)和乙酸乙酯(10ml)。将该悬浮液在冰浴中冷却。向悬浮液中鼓泡通入氯化氢达1.5分钟。将反应烧瓶温热至室温，然后溶剂经真空过滤除去，得到8-5，为白色固体，mp.248-249℃。1H NMR(DMSO-d6)δ9.0-8.5(br，2H)；8.05(m，1H)；7.42(d，1H)；7.05(d，1H)；4.15(m，2H)；3.62(m，2H)；3.5-3.3(m，4H，H2O)；3.25-3.15(d，br，2H)；2.85-2.7(br，2H)；2.5-2.4(m，4H)；1.81(d，2H)；1.6-1.4(m，3H)；1.4-1.2(m，2H).
流程9 2(S)-氨基-3-(N-Boc-氨基)丙酸乙酯(9-1)将可商购的2(S)-3-二氨基丙酸(Fluka)(10g，96.2mmol)溶于无水乙醇(200ml)中，然后该溶液用无水HCl气体饱和，然后加热回流2.5小时。除去溶剂，残余物用EtOH/Et2O重结晶，得到乙酯二盐酸盐，为吸湿的白色固体。
将该物质(5g，24.3mmol)悬浮于冷却至-50℃的CH2Cl2(200ml)中。接着，加入三乙胺(7.0ml，51mmol)，并搅拌该混合物5分钟。在30分钟时间内，滴加入连二碳酸二叔丁酯(5.30g，24.3mmol)的100ml CH2Cl2溶液，并将该混合物在-50℃搅拌1.5小时，然后湿热至室温。该溶液用水(2×100ml)洗涤，然后用Na2SO4干燥，并蒸发。所得残余物用硅胶色谱法纯化(80∶20 CH2Cl2/CH3OH)，得到纯的9-1。1H NMR(300MHz，CDCl3)6.03(brt，1H)；4.35(m，1H)；3.85(m，2H)；3.23(m，2H)；1.21(t，3H).
2(S)-正丁基氨基磺酰氨基-3-(N-BOC-氨基)丙酸乙酯(9-2)用吡啶(261ml，3.23mmol)和正丁基氨磺酰氯(406mg，2.37mmol)处理9-1(500mg，2.15mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液。该溶液在室温下搅拌3小时，然后倾至硅胶上，用30％丙酮/己烷洗脱，得到纯的9-2，为白色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.43(d，1H)；4.98(t，1H)；4.40(brs，1H)；4.10(q，2H)；4.05(m，1H)；3.56(m，2H)；3.08(m，2H)；1.8-1.2(重叠的多重峰，16H)；0.90(t，3H).
2(S)-(正丁基氨基磺酰氨基)-3-氨基丙酸乙酯(9-3)将9-2(612mg，1.65mmol)的乙酸乙酯(50ml)溶液冷却至-5℃，鼓泡通入无水HCl达30分钟，将反应混合物浓缩，过滤分离出产物，得9-3，为白色固体。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ5.82(d，1H)；4.56(brs，1H)；4.20(q，2H)；4.02(m，1H)；3.45(m，2H)；3.01(m，2H)；1.9-1.36(m，7H)；0.93(t，3H).
2(S)-[(正丁基氨基磺酰基)氨基]-3-[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸乙酯(9-4)按对1-6所述方法，在DMF中，使9-3与3-3、EDC和HOBT偶合，得到9-4。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.29(s，1H)；7.19(t，1H)；5.43(d，1H)；4.41(t，2H)；4.26(q，2H)；4.20(m，1H)；4.08(d，2H)；3.86(m，2H)；3.76(m，2H)；3.60(t，2H)；3.08(t，2H)；2.68(t，2H)；1.78(d，2H)；1.6-1.08(m，8H)；1.43(s，9H)；0.92(t，3H).
2(S)-[(正丁基氨基磺酰基氨基]-3-[(4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-(哌啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]羰基]氨基丙酸(9-5)按对5-7所述方法，用NaOMe水解9-4，分离粗酸，随后用HCl的EtOAc溶液处理，得到9-5，为白色固体，mp155-160℃。
流程10 N-[2-(5-甲氧羰基)吡啶基甲基]-β-氨基丙酸叔丁酯(10-1)将2-3(871mg，3.79mmol)、β-氨基丙酸叔丁酯·HCl(2.7g，15mmol)、和K2CO3(4.5g，30mmol)在100ml无水CH3CN中的混合物置于250ml烧瓶中，并回流3小时，然后冷却并过滤。减压浓缩滤液，进行硅胶色谱法纯化，用EtOAc作洗脱剂，得到10-1，为无色玻璃状物。1H NMR(CDCl3)δ9.18(d，J＝1.4Hz，1H)；8.1(dd，J＝1.4和6.8Hz，1H)；7.39(d，J＝6.8Hz，1H)；4.08(s，2H)；3.95(s，3H)；3.04(t.2H)；2.60(t，2H)；1.4(s，9H).
叔丁基-2-(2-羧乙基)-1-氯羰基-3-氧代-2，3-二氢-咪唑并[1，5-a]吡啶-6-甲酸酯(10-2)将10-1(800mg，2.71mmol)溶于50ml甲苯中，加入N，N-二甲基苯胺(2.0ml，16.7mmol)，将溶液冷却至0℃。向其中，在30分钟内滴加入三光气(1.7g，5.7mmol)的15ml甲苯溶液。然后，将该溶液温热至25℃，并搅拌3.0小时，之后用1N HCl、水和盐水(各50ml)洗涤两次，用Na2SO4干燥，并蒸发，得到10-2，为黄色晶状固体。1H NMR(CDCl3)δ8.83(d，J＝1.4Hz，1H)；8.25(d，J＝6.8Hz，1H)；7.82(dd，J＝1.4 and 6.8Hz，1H)；4.43(t，J＝7.2Hz，2H)；3.98(s，3H)；2.75(t，J＝7.2Hz，2H)；1.4(s，9H).
叔丁基-2-(2-羧乙基)-1-氰基-3-氧代-2，3-二氢咪唑并[1，5-a]吡啶-6-甲酸酯(10-3)将10-2(250mg，0.65mmol)溶于100ml CH2Cl2中，加入10ml氢氧化铵，并将该两相混合物搅拌1小时，然后分离有机层，用10％柠檬酸、然后用盐水(50ml)洗涤，用Na2SO4干燥，并蒸发。
将该残余物(150mg，0.42mmol)溶于100ml CH2Cl2中，在2小时期间内，分三次加入355.7mg氢氧化甲氧羰基氨磺酰基-三乙基铵内盐(Burgess试剂，1.48mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，然后浓缩，在硅胶上进行色谱法纯化，使用1∶1己烷/乙酸乙酯作洗脱剂，以定量产率得到所述腈。将该物质用1N LiOH进行皂化，得到所需羧酸10-3。1H NMR(CDCl3)δ8.75(s，1H)；7.43(d，1H)；7.18(d，1H)；4.21(t，2H)；2.85(t，3H)；1.4(s，9H).
3-[1-氰基-3-氧代-6-2-(哌啶-4-基)乙基氨基甲酰基)-2，3-二氢-咪唑并[1，5-a]吡啶-2-基]丙酸(10-4)将10-3(170mg，0.51mmol)溶于10ml CH2Cl2中，加入Et3N(71ml，0.51mmol)和HOBT(69.3mg，0.51mmol)、EDC(98.6mg，0.52mmol)和2-4(117.2mg，0.51mmol)。将该混合物在N2气氛下搅拌18小时，然后用10％柠檬酸、H2O和盐水(各10ml)洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并进行色谱法纯化，得到黄色固体(215mg，0.43mmol)。该物质经使用在CH2Cl2中的三氟乙酸去保护，得到10-4·TFA盐，为黄色固体，m.p.＝173℃。1H NMR(300MHz，DMSO d6)δ1.75(s，1H)；7.43(t，1H)；7.31(d，1H)；7.15(d，1H)；4.23(t，2H)；3.41(t，2H)；3.23(d，2H)；2.83(m，2H)；1.85(d，2H)；1.53(m，2H)；1.41(m，1H)；1.32(m，2H).
流程11 [4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[3-(叔丁基丙酰基)]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]甲酸甲酯(11-1)将3-2(1.4g，4.8mmol)、β-氨基丙酸叔丁酯·HCl(0.90g，5mmol)、和碳酸钾(0.78g，5.28mmol)在150ml CH3CN中，在N2气氛下回流4.5小时，然后冷却，过滤，并减压蒸发。将所得黄色残余物进行硅胶色谱法纯化，用2％CH3OH/CH2Cl2洗脱，得到二酯11-1，为无色玻璃状物。1H NMR(CDCl3)δ7.31(s，1H)；4.48(t，2H)；3.93(s，3H)；3.61(t，2H)；2.71(t，2H)；2.35(t，2H)；1.23(s，9H).
3-[4，5，6，7-四氢-4-氧代-2-(2-(哌啶-4-基)乙基氨基甲酰基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-5-基]丙酸(11-2)将含有LiOH(145mg，3.41mmol)的10ml H2O溶液加入到酯11-1(1.0g，3.1mmol)的10ml CH3OH溶液中，并将该混合物加热至60℃，在此温度下维持2.5小时，然后冷却，并减压除去溶剂。剩下的残余物用10％柠檬酸酸化，用CH2Cl2(2×100ml)萃取。合并的有机萃取液用H2O洗涤，干燥并蒸发，得到所需的酸，为无色玻璃状物。1H NMR(CDCl3)δ7.21(s，1H)；4.48(t，2H)；3.63(t，2H)；2.71(t，2H)；2.32(t，2H)；1.23(s，9H).
将该酸(500mg，1.62mmol)溶于10ml CH2Cl2中。加入HOBt(220mg，1.62mmol)和EDC(309mg，1.62mmol)和2-4(356mg，1.63mmol)。将该混合物在N2气氛下搅拌16小时，然后用10％柠檬酸、H2O和盐水(各10ml)洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并进行色谱法纯化，得到无色泡沫体。该物质用HCl在乙酸乙酯中去保护，得到11-2的HCl盐，为白色固体，mp＝192-194℃。1H NMR(300MHz，DMSO d6)δ9.0(br，s，1H)；8.35(m，1H)；6.99(s，1H)；4.38(t，J＝6.0Hz，2H)；3.83(t，J＝5.5Ht，2H)；3.64(t，J＝7.1Hz，2H)；3.30-3.1(m，4H)；2.85-2.65(q，2H)；2.54(t，J＝7.1Hz，2H)；1.85-1.75(s，br，2H)；1.60-1.20(重叠的m，5H).
流程12 2-(4-吡啶基)乙基胺(12-1)将NH4Cl的200ml H2O溶液置于1L烧瓶中。加入4-乙烯基吡啶(56.4ml，0.52mol)和150ml CH3OH，并对此混合物在60℃加热18小时。在冰浴中将反应溶液冷却至0℃，加入30％ NaOH使之呈碱性。该碱性溶液用CH2Cl2(5×100ml)萃取，干燥合并的萃取液，之后蒸发。真空蒸馏该残余物，得到12-1，为无色液体。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.53(d，3＝6.1Hz，2H)；7.25(d.J＝6.1H2，2H)；3.02(t，2H)；2.77(t，2H)；1.4(brs，2H).
4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(吡啶-4-基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]甲酸甲酯(12-2)将3-2(1.4g，4.8mmol)、4-(2-氨基乙基吡啶)(0.645g，5.28mmol)和碳酸钾(0.78g，5.28mmol)的150ml CH3CN溶液在N2气氛下回流4.5小时，然后冷却，过滤并减压蒸发。将所得黄色残余物再溶解于50ml DMF中，用NaH(200mg，60％油悬浮液)处理，并在90℃加热3小时，然后减压浓缩，在硅胶上进行色谱法纯化，使用20％ CH3OH/CH2Cl2洗脱，得到酯12-2，为浅黄色玻璃状物(0.91g，3.0mmol，68％)。1H NMR(CDCl3)δ8.32(d，2H)；7.52(d，2H)；7.34(s，1H)；4.48(t，2H)；3.91(s，3H)；3.61(t，2H)；2.71(t，2H)2.35(t，2H).
2(S)-[(对甲苯磺酰基)氨基]-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(4-吡啶基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]甲酸叔丁酯(12-3)将含有LiOH(130mg，3.05mmol)的10ml H2O溶液加入到12-2(910mg，3.0mmol)的10ml CH3OH溶液中，将该混合物加热至60℃，在此温度下维持2.5小时，然后冷却，减压除去溶剂，剩余的残余物经在Dowex-50W树脂上进行离子交换色谱法纯化，得到所需酸，为灰白色固体，mp.187℃。
将该酸(300mg，0.78mmol)悬浮于50ml无水DMF中。加入A-8(293mg，81mmol)、EDC(150mg，0.78mmol)、HOBt(105mg，0.78mmol)和N-甲基吗啉(87ml，0.78mmol)，并将所得的澄清溶液在25℃搅拌19小时。该溶液用100ml EtOAc稀释，依次用饱和NaHCO3、H2O和盐水(25ml)洗涤，用Na2SO4干燥，蒸发得到12-3。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.63(d，2H)；7.80(d，2H)；7.58(d，2H)；7.29(t，1H)；6.93(s，1H)；5.95(d，2H)；4.40(t，2H)；4.08(m，1H)；3.86-3.74(m，4H)；3.35-3.20(m，2H)；3.10(t，2H)；1.30(s，9H)；2(S)-[(对甲苯磺酰基)氨基]-3-[[[4，5，6，7-四氢-4-氧代-5-[2-(4-吡啶基)乙基]吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基]甲酸·TFA盐(12-4)12-3用TFA在CH2Cl2中去保护，用反相色谱法纯化，得到12-4的TFA盐，mp.182-185℃。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.72(brd，2H)；8.19(t，1H)；8.00(d，1H)；7.81(d，2H)；7.58(d，2H)；7.19(d，2H)；6.85(s，1H)；4.40(t，2H)；4.01(m，1H)；3.83-3.76(m，4H)；3.48(m，1H)；3.26(m，1H)；3.10(t，2H).
流程13
流程13(续) 5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[(3-氰基苯基)甲基-4-H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]甲酸甲酯(13-1)将5-3(3.02g，14.5mmol)的60ml无水DMF溶液冷却至0℃，并用NaH(60％的油液)(636mg，15.98mmol)处理。将所得混合物在0℃搅拌1.5小时，然后滴加3-氰基苄基溴(3.11g，15.89mmol)的50ml DMF溶液。将所得混合物在25℃搅拌18小时，然后用200ml EtOAc稀释，用H2O(3×100ml)和盐水(100ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。所得固体用CH2Cl2/CH3OH重结晶，得到13-1，为白色固体。1H NMR(CDCl3)δ7.85(s，1H)；7.78(d，J＝8Hz，1H)；7.59(d，J＝8Hz，1H)；7.46(m，1H)；7.30(s，1H)；4.80(s，1H)；4.43(t，J＝8Hz，2H)；3.89(s，3H)；3.38(t，J＝8Hz，2H)；2.09(m，2H).
2(S)-[(对甲苯磺酰基)氨基]-3-[[[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[(3-氰基苯基)甲基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸叔丁酯(13-2)酯13-1(1.5g，4.04mmol)的100ml THF溶液用1N LiOH(5.1ml，5.1mmol)和100ml H2O处理，并在25℃搅拌1.5小时。减压除去THF，含水的残余物用1N HCl酸化。过滤所得沉淀物，并真空干燥，得到所需产物，为白色固体。1H NMR(CDCl3)δ7.95(s，1H)；7.73(d，1H)；7.53(d，1H)；7.43(m，1H)；7.30(s，1H)；4.85(s，2H)；4.43(t，2H)；3.31(t，2H)；2.08(m，2H).
将上述酸(1.0g，3.23mmol)与A-9(1.24g，3.54mmol)、HOBt(480mg，3.54mmol)、EDC(641mg，3.54mmol)的100mg CH2Cl2溶液混合，加入N-甲基吗啉(403μl，3.83mmol)，所得溶液在室温下搅拌16小时，然后依次用饱和NaHCO3、10％KHSO3和盐水(各100ml)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发，残余物经硅胶色谱法纯化(用EtOAc洗脱)，得到13-2，为白色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.73(d，J＝6.8Hz，2H)；7.68(s，1H)；7.65(d，1H)；7.51(m，1H)；7.37(d，J＝6.8Hz，2H)；7.20(d，1H)；7.18(t，1H)；5.63(d，J＝6.5Hz，1H)；4.80(s，2H)；4.78(m，1H)4.45(t，2H)；3.85(m，1H)；3.08(m，1H)；3.40(t，2H)；2.43(s，3H)；2.19(m.2H)；1.65(s，9H).
2(S)-[(对甲苯磺酰基)氨基]-3-[[[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[(3-氰基苯基)甲基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸酯(13-3)13-2的CH2Cl2(15ml)溶液用5ml TFA处理。将该溶液在0℃搅拌2.5小时，然后蒸发，得到13-3，为无色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.73(d，J＝6.8Hz，12H)；7.65(s，1H)；7.65(d，1H)；7.50(m，1H)；7.31(d，J＝6.8Hz，2H)；7.3(d，1H)；7.28(t，1H)；6.15(d，J＝6.5Hz，1H)；4.80(s，2H)；4.63(m，1H)；4.43(t，2H)；3.82(m，1H)；3.65(m，1H)；3.48(m，2H)；2.43(s，3H)；2.19(m，2H).
2(S)-[(对甲苯磺酰基)氨基]-3-[[[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[(3-脒基苯基)甲基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸(13-4)将13-3(400mg，0.73mmol)溶于10ml吡啶和Et3N的4∶1混合物中。该溶液用SH2饱和，并搅拌直至通过HPLC不再能检测到腈(2.5小时)。过量的SH2通过将氮气流通过溶液而除去。然后蒸发所剩溶液，残余物用1N HCl研制，并过滤，得到黄色固体。将该物质溶于15ml丙酮中，用CH3I(250μl)处理，然后加热至50℃，直到通过HPLC不能再检测到硫代酰胺(2小时)。蒸发掉溶剂和过量CH3I，将残余物重新溶于含有(NH4)2CO3(144mg，1.14mmol)的CH3OH中。将该溶液在50℃加热12.5小时，然后蒸发，13-4通过制备性反相色谱法分离。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.38(s，2H)；9.17(s，2H)；8.19(t，1H)；8.16(d，2H)；7.78(s，1H)；7.75(m，2H)；7.63(m，1H)；7.60(d，2H)；7.21(d，2H)；6.93(s，1H)；4.81(s，2H)；4.40(t，2H)；3.93(m，1H)；3.40(m，2H)；3.35(m，2H)；2.23(s，3H)；2.13(m，2H).
流程14
流程14(续)
5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-(3-氯丙基)-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]甲酸甲酯(14-1)按对13-1所述方法，用1-氯-3-溴丙烷(1.5ml，10.5mmol)烷基化5-3(2.0g，9.5mmol)，得到14-1，为白色固体。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.28(s，1H)；4.58(t，2H)；3.93(s，3H)；2.78(t，2H)；2.68(t，2H)；2.46(t，2H)；3.27(m，2H)；2.18(m，2H).
5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-(3-叠氮基丙基)-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]甲酸(14-2)将上述氯化物(909mg，3.2mmol)和NaN3(620mg，9.5mmol)的DMF(15ml)溶液在室温下搅拌36小时。该溶液用乙酸乙酯(50ml)稀释，用H2O(3×50ml)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤，并蒸发，得到叠氮化物，为白色固体。按通常方式水解该物质，得到14-2，为白色固体。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.00(s，1H)；4.41(t，2H)；3.52(t，2H)；3.41(t，2H)；3.26(t，2H)；2.20(m，2H)；1.80(m，2H).
2(S)-(对甲苯磺酰氨基)-3-[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-(3-氨基丙基)-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸叔丁酯(14-3)按对13-2所述方法，使酸14-2与A-9偶合，得到所需产物，为白色固体。将该物质溶于乙醇中，接着用10％ Pd/C在H2气氛下氢化，得到14-3，为白色固体。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)8.18(t，1H)；7.68(d，2H)；7.23(d，2H)；6.98(s，1H)；4.4(m，3H)；3.93(t，2H)；3.48-3.2(m，6H)；2.78(t，2H)；2.43(s，3H)；2.69(m，2H)；1.86(m，2H)；1.08(s，9H).
2(S)-(对甲苯磺酰氨基)-3-[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-(3-胍基丙基)-4H-呲唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸(14-4)14-3(60mg，0.1mmol)的DHF(5ml)溶液用DIPEA(90μl，0.5ml)和3，5-二甲基吡唑-1-甲脒(30mg，0.5mmol)处理并在80℃加热12小时。蒸发溶剂，残余物用中性氧化铝色谱法纯化(CH2Cl2/CH3OH/NH4OH，80/20/1)，得到所需产物，为白色固体，该物质用TFA以通常方式去保护，用制备性反应相色谱法纯化，得到(14-4)，为白色固体。1H NMR(300MHz，D2O)δ8.2(t，1H)；7.58(s，2H)；7.18(d，2H)；4.38(t，2H)；3.51(m，5H)；3.45(t，2H)；3.2(m，1H)；3.18(m，2H)；2.10(s，3H)；2.08(m，2H)；1.8(m，2H).
2(S)-(对甲苯磺酰氨基)-3-[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[3-[N-(咪唑啉-2-基)氨基]丙基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸(14-5)使用在14-4中所述方法，使14-3的溶液与2-甲硫基-2-咪唑啉氢碘酸盐反应。该粗物质用TFA去保护，并通过制备性反相色谱法分离14-5。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)8.20(t，1H)；8.10(d，2H)；7.60(d，2H)；7.21(d，3H)；6.86(s，1H)；4.46(t，2H)；4.01(m，2H)；3.8-3.5(重叠的m，8H)；2.23(s，3H)；2.10(t，2H)；1.80(t，2H).
流程15 2(S)-[(对甲苯磺酰基)氨基]-3-[[[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[2-(N-BOC-哌啶-4-基)乙基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸(15-1)
将5-6(5.0g，12.3mmol)的THF(150ml)溶液冷却至0-10℃，用注射器加入N-甲基吗啉(2.11ml，19.2mmol)。混合20分钟后，用注射器滴加氯甲酸叔丁酯(2.38ml，18.2mmol)，将所得溶液搅拌0.5小时后，得到所需混合酐。
在500ml带有磁性搅拌棒的圆底烧瓶中，混合A-7(7.00g，27.1mmol)、THF(125ml)和二异丙基乙基胺(4.71ml，27.1mmol)。加入少量水，直至形成澄清溶液。将所得溶液在冰浴中冷却，在剧烈搅拌下，向溶液中一次性加入该混合酐悬浮液。20分钟后，浓缩该搅拌的溶液以除去THF。所剩含水物质用10％硫酸氢钾酸化，过滤所得沉淀物，得到白色固体。
将该物质用硅胶(EM Science，220-400目，10×20cm)进行快速柱色谱法纯化，色谱柱用二氯甲烷∶甲醇∶氢氧化铵98∶2∶0.2，95∶5∶0.5，90∶10∶1，然后用85∶15∶1.5洗脱，得到纯的15-1，为白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ8.23(q，J＝3.40Hz，1H)；7.64(d，J＝8.20Hz，2H)；7.32(d，J＝8.20Hz)；7.2-7.0(br，1H)；6.86(s，1H)；4.36(t，J＝6.70Hz，2H)；3.89(d，br，J＝12.21Hz，2H)；3.59(m，1H)；3.47(t，J＝7.08Hz，2H)；3.5-3.1(m，br，5H，H2O)；2.8-2.6(br，2H)；2.33(s，3H)；2.17(t，J＝6.47Hz，2H)；1.66(d，br，J＝11.97Hz.2H)；1.55-1.45(m，br，3H)；1.37(s，9H)；1.1-0.9(m，br，2H).
2(S)-[(对甲苯磺酰基)氨基]-3-[[[5，6，7，8-四氢-4-氧代-5-[2-(哌啶-4-基)乙基]-4H-吡唑并[1，5-a][1，4]二氮杂-2-基]羰基]氨基]丙酸(15-2)将15-1(7.42g，11.48mmol)置于装有磁性搅拌棒的1L圆底烧瓶中。加入二氯甲烷，将反应混合物冷却至0-5℃，在搅拌下向悬浮液中鼓泡通入氯化氢。约2分钟后，固体变成溶液，不久形成另一种沉淀。向悬浮液中再鼓泡通入气体5分钟后，将反应瓶温热至室温。30分钟后，浓缩反应瓶中的内含物。所得白色固体为15-2的盐酸盐，用HPLC分析纯度＞99％。
该15-2的盐酸盐使用Dowex 50X8-200离子交换树脂(110g，4.11meq/g)进行离子交换色谱法纯化。该树脂是通过用水、甲醇、水、6N盐酸、和水(各500ml)洗涤制备的。此时，洗脱剂的pH为7。将盐酸盐溶于水(30ml)中，然后施加到柱的顶部。用水洗脱该柱。洗脱剂的pH变成强酸性。当洗脱剂的pH恢复至7时，用氢氧化铵∶乙腈∶水50∶25∶25(1.5L)洗脱柱。合并含有U.V活性物质的部分，然后在高真空中浓缩。所得白色泡沫状物在高真空中干燥8小时，得到15-2。1H NMR(DMSO-d6)δ9.0-8.5(br，1H)；8.19-8.16(m，1H)；7.67(d，J＝8.18Hz，2H)；7.32(d，J＝8.18Hz，2H)；6.89(s，1H)；4.38(t，J＝6.84Hz，2H)；3.75-3.65(m，br，1H)；3.46(t，br，2H)；3.5-3.1(m，br，8H，H2O)；2.77(t，br，J＝11.36，2H)；2.35(s，3H)；2.17(t，J＝6.47Hz，2H)；1.80(d，br，J＝12.7Hz，2H)；1.53-1.42(m，br，3H)；1.33-1.24(m，br，2H).
使用前面所述方法，特别是在流程3和4中所述方法，制备了下列表1中的化合物。
表1
表1(续)R mp(℃) 盐形式 按照类似于上述实施例方法的方法制备的其他化合物，示于下列表中
表2 -CN H H 180-188
表2(续)R A B mp(℃)
表3 n m mp(℃)2 0 110-1152 1 115-1201 1 121-1230 2 135-1410 1 140-145
表4 酰胺的立体化学NH*R 相对于H6化学位移(PPM)H顺式 6.35H反式 7.38NHSO2C4H9顺式 6.31NHSO2C4H9反式 7.29”H6”是指在下列二环系统的6位上的氢基，
表5 R1R2MP(℃)H SO2C4H9110-116
表6 n R1R2MP(℃)1 H H 248-249
权利要求
1.具有下式结构的化合物及其可药用盐 或 其中Q为 或Q为含有1、2或3个选自N、O或S的杂原子的、并且是未取代的或由R8取代的4-9元单环或二环环状系统；AB是共享相邻的碳和氮原子的稠合的环状系统，其中A为含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和或不饱和环；B为含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和或不饱和环；R1为H，C1-4烷基，N(R8)2，-N(R8)SO2R7，NR8CO2R7，NR8C(O)R7，NR8C(O)N(R7)R8，N(R8)SO2N(R7)R8，N(R8)SO2N(R8)C(O)OR7，C(O)N(R7)2，或与R6形成的环状基团，其定义如下；R2为H，C1-4烷基，C1-4支链烷基，C1-4烷基芳基，或芳基；R5为CH，-CH(CH2)n，一条键，或然后R5为邻近的N(R4)， R6为COOH，CH2OH，C(O)NR7)2，CO2R9，四唑，酰基磺酰胺，或 ，或与R1形成的环状基团，其定义如下；其中R1与R6形成的环状基团为 其中Y＝O或S；R7为H、取代或未取代的支链或直链C1-4烷基、支链或直链低级链烯基、C1-4烷基芳基、取代的芳基、或含有1、2或3个N、S或O杂原子的5或6元杂芳基，其中取代的烷基为羟基取代的或C1-4烷氧基取代的烷基，并且其中取代的芳基被一个、两个或三个下列基团取代卤素、C1-4烷氧基、羟基、或C1-4烷基；R8为H、支链或直链C1-4烷基；R9为H、C1-4烷基或芳基；n为0-7；n′为0-3；和a为 或一条键。
2.具有下式结构的权利要求1的化合物及其外消旋体、外消旋混合物、对映体和非对映体 或 其中Q为 或 n＝0-7；n＇＝0-3R4＝H、C1-4烷基、C1-4支链烷基、环状C1-4烷基或C1-4链烯基；R5＝CH、-CH(CH2)n、或一条键；R2为H、C1-4烷基、C1-4支链烷基、C1-4烷基芳基，或芳基；R1＝H、C1-4烷基、N(R8)2，-N(R8)SO2R7，NR8CO2R7，NR8C(O)R7，NR8C(O)N(R7)R8，N(R8)SO2N(R7)R8，N(R8)SO2N(R8)C(O)OR7，C(O)N(R7)2，或与R6形成的环状基团；R6＝COOH，CH2OH，C(O)NR7)2，CO2R9，四唑，酰基磺酰胺，或 或与R1形成的环状基团，其中R1与R6形成的环状基团为 其中Y＝O或SR7＝H、取代或未取代的支链或直链C1-4烷基、支链或直链低级链烯基、C1-4烷基芳基、取代的芳基、或含有1、2或3个N、S或O杂原子的5或6元杂芳基，其中取代的烷基为被羟基取代的或被C1-4烷氧基取代的烷基，并且其中取代的芳基被一个、两个或三个下列基团取代卤素、C1-4烷氧基、羟基、或C1-4烷基；R8＝H、支链或直链C1-4烷基；R9＝H、C1-4烷基或芳基；a＝ 或一条键；A＝含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和、部分饱和、或不饱和的环；和B＝含有1、2或3个选自O、S或N的杂原子的5、6或7元饱和、部分饱和、或不饱和的环，其中A和B形成一个共享相邻碳和氮原子的稠合的环状系统。
3.具有下式结构的权利要求2的化合物 其中AB为 其中V为N或CR7，和D为CH2，CH2-CH2，CH2C(R7)2CH2，或 其中X＝N或CR3，其中R3＝CN，C(O)N(R7)R8， 或 和
4.权利要求3的化合物，其中AB为 其中V为N或CH，和D为CH2-CH2或CH2C(R4)2CH2-
5.具有下式结构的权利要求2的化合物 其中AB为 其中V为N或CR7和D为CH2，CH2-CH2，CH2C(R7)2CH2，或 其中X＝N或CR3，其中R3＝CN，C(O)N(R7)R8， 或 和 其中y3为O或H2
6.权利要求5的化合物，其中a＝ 和AB选自 其中V为N或CR7和D为CH2，CH2-CH2CH2C(R7)2CH2或 ；和 其中X＝N或CR3，其中R3＝CN，C(O)N(R7)R8， 或
7.权利要求5的化合物，其中a＝一条键；和AB选自 和 其中y3为O或H2
8.权利要求2的化合物，它们选自 和
9.权利要求8的化合物，它们选自 和
10.用于抑制哺乳动物中纤维蛋白原与血小板的结合、抑制血小板聚集、治疗血栓形成或栓子形成、或预防血栓或栓子形成的权利要求2的化合物。
11.用于抑制哺乳动物中纤维蛋白原与血小板结合的组合物，该组合物包含权利要求2的化合物以及可药用载体。
12.用于抑制哺乳动物中血小板聚集的组合物，该组合物包含权利要求2的化合物以及可药用载体。
13.用于预防哺乳动物中血栓或栓子形成的组合物，该组合物包含权利要求2的化合物以及可药用载体。
14.用于治疗哺乳动物中血栓或栓子形成的组合物，该组合物包含权利要求2的化合物以及可药用载体。
15.一种用于抑制哺乳动物中纤维蛋白原与血小板结合的方法，该方法包括给哺乳动物施用药理学上有效量的权利要求11的组合物。
16.一种抑制哺乳动物中血小板聚集的方法，该方法包括给哺乳动物施用药理学上有效量的权利要求12的组合物。
17.一种用于预防哺乳动物中血栓或栓子形成的方法，该方法包括给哺乳动物施用药理学上有效量的权利要求13的组合物。
18.一种治疗哺乳动物中血栓或栓子形成的方法，该方法包括给哺乳动物施用权利要求14的组合物。
19.一种用于抑制哺乳动物中血小板聚集的方法，该方法包括给哺乳动物施用药理学上有效量的溶解血栓剂、权利要求2化合物、以及抗凝剂。
20.权利要求19的方法，其中所述溶解血栓剂为组织纤维蛋白溶酶原活化剂或链激酶，并且所述抗凝剂为肝素。
21.一种用于预防或治疗哺乳动物中血栓或栓子形成的方法，该方法包括给哺乳动物施用药理学上有效量的溶解血栓剂、权利要求2化合物，以及抗凝剂。
22.权利要求21的方法，其中所述溶解血栓剂为组织纤维蛋白溶酶原活化剂或链激酶，并且所述抗凝剂为肝素。
全文摘要
本发明化合物具有式(1)或(2)结构，例如式(3)结构。所述化合物具有纤维蛋白原受体拮抗活性。
文档编号A61K31/55GK1118139SQ94191248
公开日1996年3月6日 申请日期1994年2月22日 优先权日1993年2月22日
发明者D·A·克莱蒙, J·J·巴尔德温, N·利弗敦, B·阿斯基 申请人:麦克公司