专利名称：：预防和治疗蠕虫感染的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及能在脊椎动物中诱发抗蠕虫感染之免疫应答的组合物。更确切地说，本发明涉及可用于保护脊椎动物免受寄生蠕虫感染的疫苗。蠕虫感谢是引起家畜和人群发病及死亡的主要原因。总的说来，蠕虫是指归属于扁蠕虫门(例如吸虫、绦虫、及其它扁虫)和线蠕虫门(例如蛔虫及其近亲)的寄生和非寄生种类。下面简要说明蠕虫感染是如何发生的。首先，蠕虫以虫卵或侵袭性幼虫的形式，例如随污染了虫卵或幼虫的食物被宿主生物摄入而得以进入宿主体内。然而蠕虫开始发育，通过不同的组织、血液和/或淋巴缓慢迁移，进而到达其“偏爱的”器官，并在此生长、成熟。最后，被蠕虫寄居的器官受到有害的影响。控制蠕虫感染的措施在很大程度上有赖于卫生条件的改善、减少传媒群体和使用化学疗法。以改善卫生条件和减少传媒群体为重点的控制措施已被证明存在问题，尤其是在蠕虫感染非常严重而控制措施又非常难于实施的发展中国家。现行的化疗药品都存在诸如毒性大、需要反复治疗使用和有免疫抑制副作用的弊端。实际上，几乎每个国家都有文献报道了抗蠕虫抗性的情况。因为上述原因以及反复施用化疗化合物的费用问题，人们一直在极力寻找一种没有现存弊端的化合物。因为在被感染群体中存在许多种蠕虫，所以希望生产一种有广谱预防活性的疫苗，至今还很难见到蠕虫感染后诱导的强保护性宿主免疫。这些寄生虫与其宿主一起长期共同进化的经历促使宿主—寄生虫之间的关系达到相互适应的水平，导致慢性或持续性病情，而不是典型情况下产生强特异性免疫的急性感染。因此，蠕虫感染与动物的大多数微生物性疾病的情况不同，只有很少的疫苗已用于控制蠕虫感染，而且确实存在的那些疫苗还有明显的弊端。在生产蠕虫疫苗的已知方法中，灭活的和活的疫苗都有欠缺，即劳动强度大、只有微弱的免疫原性和引起例如局部炎症、变态反应和发热等副作用。而且，通常是用于疫苗中的减毒型可引起与寄生虫的毒力(野生)型所诱发的疾病相似的情况。此外，用于疫苗制剂中的大分子载体蛋白质在接种的生物体中导致大量的免疫病理性副作用。另一种可用的疫苗类型包括基因工程生产的抗原。这类抗原仍然也只有较弱的免疫原性。总之，实用的疫苗类型通常是无效的。而且只有很窄的特异性，只针对单一的寄生虫。已报道的发展动态有关蠕虫生活周期中组织迁移起重要作用的详细讨论及其引起病理性病变的讨论可见于例如下列文献E.J.Soulsby，Helminth，ArthropodsandProtozoaofDomesticatedAnimals，7thEdition，LeaandFebiger，Philadelphia(1982)和G.M.Urquhart，“VeterinaryParasitology”，LongmanScientificandTechnical，UnitedKingdom(1987).所有的寄生虫都诱发免疫应答，但因种种原因，它们能呈递给宿主的免疫应答一个变化的且有时是不可见的靶，在这种情况下，正常的调控机制失效，并常常是以免疫损害取代了免疫。这反过来频繁地导致宿主关闭其无效的且常为抗增殖力的免疫应答，故而导致总体病理性改变和免疫抑制。寄生虫蠕虫的结构和抗原性变化反映在其诱发的特导性免疫应答的异质性上。寄生的蠕虫在其寄居于脊椎动物宿主的过程中通过伪装和脱落其表面抗原及通过改变其抗原来逃避免疫系统。这种伪装、脱落和改变表面抗原的能力是至今生产抗蠕虫感染的有效疫苗之困难所在的主要原因。J.H.L.Playfair等人(TheLancet3351990，1263—1266)提供了用于治疗寄生虫性疾病之现代疫苗的综述，而有关宿主对寄生性蠕虫之免疫应答性质的更笼统的讨论可见于S.LloydandE.J.L.Soulsbyin″ParasitologyinFocusFactsandTrends″，Ed.H.Mehlhorn，Springer—Verlag，1988，P619—650。如Playfair等人的综述性文章以及如上所述，因为现存的蠕虫控制措施花费大且难以大规模实施，故而迫切需要一种能减少宿主群蠕虫感染的强度及流行的疫苗。在本发明之前，基于上述在生产甚至是抗特定蠕虫种类的有效抗蠕虫疫苗的过程中碰到的困难，人们认为一种抗原单独不可能赋予针对广泛蠕虫感染之足够的保护作用。由蠕虫所引出的医学和科学挑战的综合概况可参见A.A.FMah-mond，Science246(1989)1015—1021，此外还可参见“Para-sites，EscapefromImmunityto”，byF.E.G.Cox，intheEncyclo-pedia.ofImmunoloy，eds.I.M.RoittandP.J.Delves，Aca-demicPress1992)。发明概述本发明提供了保护脊椎动物免受蠕虫感染的化合物，该化合物包括与一种免疫刺激性载体共价偶联的透明质酸酶。在优选形式中，本发明的化合物是以疫苗形式施用于脊椎动物，而其中被透明质酸酶共价偶联的免疫刺激性载体包括亚乙基哌嗪N-氧化物和N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物的共聚物(下文称为“Synpol”)。本发明部分是基于发现幼蠕虫能产生透明质酸酶以使之穿透其感染的宿主生物机体中的组织屏障，实际上，本发明能够诱发针对蠕虫产生的透明质酸酶的免疫应答，籍此显著削弱(如果不是消除的话)蠕虫穿透组织屏障并得以感染动物的能力。本发明的另一方面提供了保护脊椎动物免受蠕虫感染的方法，包括给脊椎动物施用治疗有效量的化合物，该化合物包括与免疫刺激性载体(优选Synpol)共价偶联的透明质酸酶。在优选的形式中，所述化合物的疫苗形式施用，该疫苗包括与所述化合物混合的Synpol。本发明能治疗的脊椎动物的例子包括人、牛、绵羊、猪、狗、马、猫、山羊、水牛、骆驼科动物和家畜。本发明的另一方面是提供了包括将透明质酸酶与免疫刺激性载体在一定的时间和温度条件下反应以使透明质酸酶与所述免疫载体共价载体偶联的方法。可以相信本发明在保护脊椎动物免受蠕虫感染方面提供了多种优于现有技术的益处。本发明的化合物对由利用透明质酸酶而使其便于在宿主生物体内迁移的蠕虫感染提供了保护。据此，本发明的化合物对广谱的蠕虫种类有效。这相对于现有的疫苗常局限于保护宿主免受只是一种特定的蠕虫感染而言是一个明显的优势。本发明疫苗所提供的另一个好处在于其为强免疫原性。现有技术的抗蠕虫疫苗常常仅具较弱的免疫原性，并诱发不希望的副作用，如局部炎症、变态反应和发热。此外，现有技术的疫苗通常使用大分子载体蛋白质，后者能在接种的生物体内引起许多免疫病理性副作用。因为本发明的化合物能够诱发强免疫应答而不引起在现有技术抗蠕虫疫苗制剂中常见的副作用，所以本发明提供的化合物已克服了现有的抗蠕虫疫苗所有的上述及各种其它的缺点。而且，本发明的化合物未显示出对发育和受精的影响。本发明的疫苗能够诱发强免疫应答和对种种蠕虫感染提供广谱保护作用的特点提供了在现有的抗蠕虫疫苗中至今未显示的优点。附图的简要说明图1说明Synpol的通式。图2为如实施例1所述生产的Synpol的结构式。图3为如实施例2所述生产的Synpol的结构式。图4图示说明在注射本发明化合物后大鼠体重的改变。本发明的详细描述本发明的一个方面是提供含有透明质酸酶和一种免疫刺激性载体之反应产物的物质。本文所用术语透明质酸酶是指能水解天然存在的多糖类，尤其是透明质酸和葡糖胺聚糖如硫酸软骨素(4—，6—，D和E)的一族酶。这些聚合物是胞外基质半固体胶样结构的基本成分。透明质酸酶裂解这些聚合物，因此而能够破坏胞外基质。许多种蠕虫产生并利用透明质酸酶水解前述的宿主生物体上基质的成分，籍此使得蠕虫穿透组织屏障，并在宿主生物体内迁移，直至到达其生长和成熟所偏爱的器官。透明质酸酶家族包括水解前述类型物质的相关酶类。据此对透明质酸聚合物分子结构中不同键的特异性可将其分组。具体地说，透明质酸酶可以划分为三个基本类型，即透明质酸氨基葡糖苷酶、透明度酸葡糖苷酸酶和葡糖醛裂解酶(B.Fiszer—Szafarz，AnalyticalBio—Chemistry，Vol.143，P76，(1984))。天然透明质酸酶本身显示出极弱的免疫原性，并不诱导可见的抗透明质酸酶抗体产生，甚至是在反复注射之后。透明质酸酶已从多种来源，包括蛇和蜜蜂毒液、水蛭唾液、精子顶体颗粒和各种细胞的溶酶体颗粒以及从细菌毒素中分离出。能够用于实施本发明的透明质酸的例证性来源包括牛和绵羊的睾丸、蠕虫、水蛭、蜂和蛇毒以及细菌。透明质酸的细菌来源包括但不限于米勒氏链球菌(P.F.Unsorth，J.Clin.Pathology，(Iondon)1989，42(s)，506—510)；化脓链球菌(W.L.HynesandJ.J.Feritti，InfectionandImmunity，1989，57(2)，533—539)；类马链球菌(R.Stingetal.，MedSci，Res.，1989，Vol.17，No.17，p723—725)；难辨梭状芽胞杆菌(S.V.Seddonetal.，J.MedMicrobiol，1990，V.31，no，3p169—174)；乳房链球菌(P.Schaufussetal.，Zentralbl.Bakteriol.FRG，1989，V.271，no.1，p46—53)和停乳链球菌(A.Hamaietal.Agric.Biol.Chem.1989，V.53，No.8，p.2163—2168)。此外，念珠菌属的酵母也被发现含有透明质酸酶(M.T.Shimizu，Rev.Microbil.，1989，V.19，No.4，p442—445)。在指定的种中，透明质酸酶通常以单体以及含有如常存在相同亚单位的二聚体和四聚体的寡聚体形式存在。已经测定了由链球菌噬菌体产生的透明质酸酶的氨基酸序列(W.L.Hynesetal.，InfectionandImmunity57(1989)533—539)，而蜂毒的透明质酸酶也在最近被测序(M.Gmachletal，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，90，3569—3573，1993)。我们希望编码透明质酸酶基因的测序和克隆将成为用重组DNA技术生产用于实施本发明的透明质酸酶的基础。各种商售的透明质酸制剂都可用于制备本发明的化合物，包括例如牛的透明质酸制剂(REANAL公司出售，目录号为0705)。由此来源获得的透明质酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)表明存在一条分子量约为63KDa的主要蛋白质带。也可使用得自绵羊睾丸的物质(SigmaChemicalCo.出售，目录号为H2126)。由此来源获得的透明质酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出分子量约为39KDa的主要蛋白质带。还可使用得自唾液的透明质酸(目录号为25119和25121)。当得自各种商售来源的透明质酸酶制剂与PAGE所证实存在的优势蛋白质种类不同时，发现透明质酸酶的各种商售制剂都有酶活性，而且彼此也有免疫交叉反应。此外，实际上所研究的所有制剂都含有至少是痕量的、分子量约60—69kDa的蛋白质，因此不能排除在所用PAGE法的还原条件下存在的较短多肽链在生理条件下组装成约60—90kDa的寡聚体。我们希望利用得自公羊和公牛睾丸的透明质酸酶的本发明化合物可以提供具有特别需要的免疫原性、投入更有效和便利等多种优点。纯化这类透明质酸酶的方法已发展得相当成熟，包括通常所用的提取、沉淀、离心、超滤、离子交换和凝胶色谱等步骤。利用得自绵羊或牛睾丸之透明质酸酶的本发明化合物激发了对蠕虫免疫应答。利用从绵羊或牛睾丸的透明质酸酶也比从蠕虫分离透明质酸酶具有更高的投入有效性。已发现从睾丸来源的透明质酸酶裂解透明质酸，并能识别硫酸软骨素(Bartoluccietal.，Int.J.TissueReact.，13(6)(1991)，P.311)。据此，有关本发明化合物的特别优选的实施方案是利用得自公羊或公牛睾丸的透明酸酶制成的。在这方面，已知Sigma化学公司出售的绵羊或牛透明质酸酶适用于实施本发明。已观察到，利用得自除接受本发明治疗的动物之外的动物来源透明质酸酶的本发明化合物通常比利用得自被治疗动物的透明质酸酶的免疫原性要强。例如，从绵羊分离的透明质酸在牛中易于比得自牛的透明质酸酶诱导更强的免疫应答。就治疗绵羊和牛中的投入有效性和便利方面而言，应考虑使用从公羊和公牛透明质酸酶混合物制备的化合物。本发明范围内的化合物包括如上所述的透明质酸酶与一种免疫刺激性载体的反应产物。本文所用术语“免疫刺激性载体”所指的化合物是其在与特定抗原相结合时能提供一种可以有效免疫甚至是对特定抗原仅有较低反应性的个体的高免疫原性复合物(抗原—免疫刺激剂)。可用于实施本发明的免疫刺激性载体的例子在下列出版物中描述Khaitov，R.AnnalsNewYorkAcademyofSciences，685，788—802，June23，1993，该文献包括了有关应用合成的聚离子作为免疫刺激剂的讨论。可参考该文章中与用于本发明的Synpol相当的polyoxidonicum。在优选实施方案中，与透明质酸酶反应的免疫刺激性载体为Synpol。本文所用术语“Synpol”是指亚乙基哌嗪N-氧化物和N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物的共聚物，相应的通式如图1所示，其中，n＝200—2000；q＝(0.2—0.35)n；z＝(0.4—0.65)n；m＝(0—0.4)n。不同于许多其它的载体和佐剂，Synpol为非免疫原性的。据认为，Synpol没有可识别的抗原决定簇，因此不能激发免疫应答，故而避免了用于疫苗制剂中许多其它佐剂和载体所观察到的不希望有的副作用。为了易于区分各种Synpol，在使用术语“Synpol”时与前述的各个字母“n”，“q”，“z”和“m”的值相连用，例如，n＝1000，q＝0.35，z＝0.60和m＝0.05的亚乙基哌嗪N-氧化物和N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物称为“Synpol1000—35/60”。成功地用作本发明疫苗实施方案中的免疫刺激性载体的具体Synpol共聚物的例子在本文中称为“Synpol1000—20/50”。分子量至少约为15kDa或更大的Synpol优选用于实施本发明，而分子量大于至少约30kDa的Synpol更为优选。本发明的化合物可以通过影响透明质酸酶与免疫刺激性载体的化学连接的任何适宜方法制备。例如，通过将透明质酶与免疫刺激性载体共价偶联。这类共价键可以在透明质酸酶上和免疫刺激性载体的反应基团之间直接形成，或者通过一个或多个连接基团形成。如下文的实施例所示，制备透明质酸酶和本发明优选的免疫刺激性载体(即Synpol)的反应产物的优选方法包括使用叠氮化物法。该方法包括通过使用肼将Synpol的酸或酯转化成酰肼，继而在产生透明质酸酶与Synpol共价偶联反应产物之条件下将其与透明质酸酶连接。另外，如下文实施例所述，另一个制备透明质酸酶和Synpol反应产物的优选方法包括形成琥珀酰亚胺醚或Syn-pol，然后在能生成用于实施本发明的化合物之条件下将琥珀酰亚胺醚与透明质酸酶结合。据信本发明的化合物可用于更广泛地保护脊椎动物免受蠕虫感染。为此，所优选的是将透明质酸酶与免疫刺激性载体的反应产物以疫苗形式应用。本文所用术语“疫苗”是指含有本发明化合物并为能够施用于脊椎动物的形式的组合物。典型的情况下，所述疫苗包括本发明之化合物悬浮或溶解其中的常规用盐或缓冲水溶液介质。以此形式，本发明的化合物可以便利地用于预防、改善或治疗蠕虫感染。在优选的形式中，本发明的疫苗另外还包括相对于本发明的化合物而言以较小或较大比例存在的一种佐剂，本文所用术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激剂，当与本发明的疫苗联合应用时能提供增强的免疫应答。各种佐剂都可以使用。佐剂的例子包括完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。在本发明优选的实施方案中，Synpol用作佐剂，与本发明的化合物相混合。如上所述，本发明的化合物将用于保护脊椎动物免受蠕虫感染。可用本发明治疗的脊椎动物的例子包括人和各种家畜，例如包括牛、绵羊、猪、狗、马、猫和山羊以及其它马科动物、水牛、骆驼科动物和家畜。确切地说，希望本发明的化合物能有效地预防和治疗与利用透明质酸酶之蠕虫接触的动物受蠕虫感染。本发明的化合物可以通过肌内、皮下或皮内等途径经胃肠外施用。对特定的生物体而言，优选的给药途径可参考本发明应用的实施例部分，优选的剂量范围可视被治疗的特定动物以及在特定环境中最流行的蠕虫种类的不同而变化，但一般情况下，发现疫苗剂量约0.05mg蛋白质/kg动物体重时有效。参考下文的实施例部分可发现更有指导意义的有关有效剂量范围。已发现能够优选应用与Synpol共价偶联的透明质酸酶的温和条件不以明显的方式影响透明质酸酶的抗原表位，据此得到了高免疫原性化合物。固相酶联免疫测定(ELISA)已显示，抗透明质酸酶的抗体能识别已与Synpol连接的透明质酸酶的表位，这说明所述表位依然存在。还发现透明质酸酶的酶学位点在该酶与Synpol共价偶联后仍然维持。确切地说，已观察到单用透明质酸酶的底物降解率基本上与用已和Synpol共价偶联的透明质酸酶的底物降解率相同。而且，透明质酸酶在与Synpol偶联后，它比天然酶形式要稳定得多。这一点已用透明质酸酶灭活试验证实，所述试验包括热稳定性试验和对肝素介导的抑制作用的抗体。因与Synpol连接而赋予透明质酸酶更稳定的性质为本发明化合物提供了其它的广谱应用。除了能抑制蠕虫感染外，还希望本发明的化合物可用于诱发针对其它病原或生物体的免疫应答，例如那些利用透明质酸酶消化组织的病原体或生物体，如某些细菌或其毒素。此外，本发明的化合物还可用于阻断含透明质酸酶的毒液(如蜂毒和蛇毒)的作用或局限其扩散。在本发明范围内还包括利用与Synpol共价偶联的透明质酸酶治疗脊椎动物纤维变性的方法，包括施用含有与Syn-pol共价连接的透明质酸酶的组合物。此外，本发明的化合物可作为使皮肤更光滑柔嫩的和其它产品中的活性成分而用于美容术。在这一方面应注意。含有人精子的材料在俄罗斯已被用作护肤产品。然而，这类产品因透明质酸酶的不稳定性而使其应用受到很大限制。因为本发明的化合物是稳定的、可溶的和非毒性的，所以很快在这一领域得以应用，并且已经显露了在美容方面应用的真正好处。在本发明范围内还包括与Synpol共价连接的透明质酸酶作为扩散因子以增强药品效力的应用。它还可以在医疗实践中用于改善扩散和促进吸收，例如，作为兽医应用中治疗牛乳腺炎的抗生素溶液的成分。过去。不稳定的透明质酸酶已被用于这些方面(例如参见TheMerckIndex，8th)。据此，可望本发明提供的稳定形式的透明质酸酶比使用天然形式的透明质酸酶之组合物提供更显著的益处。在本发明范围内还包括将与Synpol共价连接的透明质酸酶用于下列治疗方面，其中游离(不稳定)的透明质酸酶已显示出有益的作用心肌梗塞(参见E.J.Flintetal.，TheLancet，April17(1982)P817—874；D.Macleanetal，Sci-ence，Vol，194，P199—200(1976))；改善肾功能(参见B.S.Winkleretal，Arch.Opthalmol.103(1985)p.1743—1746)；与细胞生长抑制剂一起用于治疗癌症(G.Baumgartneretal.，J.Ep.Clin.Cancer.Res.4(1985)p3，；W.Scheithaueretal.，AnticancerRes，Vol8，p391—395(1988))；治疗结核性脊柱蛛网膜炎(参见M.Gouric—Devietal.J.Neurol.Sci，Vol102，p105—111(1991))；治疗高危病人的包裹性脑脓肿(参见A，Pasaogln，ActaNeurochir.Vol.100，p79—83(1989))。而且，透明质酸酶已在体外，例如用于无细胞体系中的透明质酸解聚，或者在如细胞培养法中刺激透明质酸合成(L.H.Philipsonetal.Biochemistry，24(1985)p7899—7906)。在本发明范围内还包括含有与Synpol共价连接的透明质酸酶之组合物在上述方面的应用。此外，在本发明的范围内还包括含有类似于透明质酸酶之蛋白质抗原的Synpol—抗原结合物疫苗，例如，含有被病原体用于消化/降解组织的其它酶(包括不同特异性的胶原酶和蛋白酶)作为抗原的疫苗。在本发明范围内还包括使用与变应原偶联的Synpol以削弱宿主对特定变应朱的变态反应。深入的研究表明，施用这类抗原—Synpol结合物优选诱导抗所述变应原的非变应原性抗体同种型的产生。这些正常的非病原性同种型与先前存在的变应原(例如IgE免疫球蛋白)竞争，特异性地削弱变态反应。这一特异性脱敏法已被清楚地证明，并且目前已用于一期临床试验。本发明范围还包括应用Synpol与下列抗原偶联，以增强偶联抗原的免疫原性，籍此促进对有效的预防性免疫应答的诱导作用，所述抗原包括霍乱毒素的β亚单位，A型和B型流感病毒包膜的血凝素、炭疽杆菌的p.90毒素、沙门氏菌的Vi抗原、E.coli和沙门氏菌细胞壁的porin蛋白，HIV—1gp160包膜蛋白的合成片段和免疫球蛋白的F(ab)2片段(为了诱导抗独特型反应)。实施例如实施例中述的，前两个实施例制备两种Synpol的说明。实施例1Synpol1000—20/50的制备采用三步法合成亚乙基哌嗪N-氧化物与N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物的共聚物。(1)在第一步中合成起始聚合物1，4-亚乙基哌嗪鎓。为了达到该目的，按照下列方案进行1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷的活性链聚合。将10克预先预先已升华的单体与0.05克溴化铵密封入10ml玻璃安瓿中。用真空泵在安瓿中产生残余压力为5×10-3mmHg的真空。将安瓿置于200℃的恒温箱中25小时。聚合物产率约为100％，M.W.120,000(由LALLS—低角度激光散射所估计)。(2)进行第二步以制备聚-1，4-亚乙聚哌嗪的N-氧化物。将5克聚-1，4-亚乙基哌嗪(M.W.120,000，n＝1000)溶于250ml1％乙酸溶液中。然后，加入30％H2O24ml，氧化持续36小时。超滤和冷冻干燥后，获行聚-1，4-亚乙基哌嗪N-氧化物(M.W.110000，z＝0.5n)(3)第三步中将上述聚-N-氧化物烷基化。将第二步中制备的聚-1，4-亚乙基哌嗪N-氧化物溶于125ml甲醇中，并加入16.5g溴乙酸。烷基化反应于25℃进行10小时。于真空中挥发溶剂，将沉积物溶于水，对水渗析24小时，冷冻干燥。最后获得下述通式的亚乙基哌嗪鎓N-氧化物与N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物的共聚物(见图2)。产率为95％。由比色法(或钛盐滴定法)以及2.5—4.5m.d.区中PMR—谱带的积分强度比估量氧化比率。比色法或钛盐滴定法指的是由二价铬盐或三价钛盐还原的N-氧化物基团定量测定法(Broors，R.T.andP.D.Sternglanz，Anal.Chem，1959，V.31，N4，p.561—565)。氧化比率为z＝0.5n。由IR谱(1735cm带)与PMR谱(2.5—4.5m.d.区)测定烷基化率，为q＝0.2n。实施例2Synpol200—35/65的制备用类似于实施例1的三步法合成亚乙基哌嗪N-氧化物与N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物的共聚物，其M.W.25000(n＝200，q＝0.35n，z＝0.65n)。(1)在第一步中将10克预先已升化的单体与0.11克溴化铵密封10ml玻璃安瓿中。用真空泵使安瓿中达到其空(5×10-3mmHg)，将安瓿置于200℃中15小时。聚-1，4-亚乙基哌嗪产率为给100％，M.W.80000(由LALLS测定)。(2)第二步中按如下方法进行聚-1，4-亚乙基哌嗪的N-氧化。将在第一步中得到的5克聚-1，4-亚乙基哌嗪溶于250ml1％乙酸溶液中。然后于2-4℃一边轻轻搅动，一边加入4.6ml30％H2O2，氧化持续48小时。在超滤净化和冷冻干燥后，回收聚-1，4-亚乙基哌嗪的N-氧化物(M.W.50000，z＝0.65n)。(3)将上述步骤(2)制得的聚-1，4-亚乙基哌嗪N-氧化物溶于125ml甲醇中，然后加入16.5克的溴乙酸。于30℃进行烷基化反应24小时。于真空中挥发溶剂并将沉积物溶于水，对水渗析24小时，冷冻干燥。从而产生了具有下列通式的亚乙基哌嗪N-氧化物与N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物的共聚物(见图3)。产率为95％。由如实施例1中一样所估计的氧化与烷式化比率分别为z＝0.65n和q＝0.35n。下面四个实施例为在本发明范围内的化合物制备的说明，它们包括透明质酸酶的反应产物与一种免疫刺激载体的多种类型，即为上述实施例1和2主题类型的Synpol。实施例3带Synpol1000—20/50的造的质酸酶(HYA)共价连接物的制备用叠氮化物法分两步进行合成HYA与Synpol1000—20/50的连接物。(1)第一步是制备Synpol1000—20/50的酰肼。按照实施例1描述的方法(除第三步有改变外用溴乙酸的乙酯取代溴乙酸进行烷基化)合成亚乙基哌嗪N-氧化物与N[乙基乙酰基]亚乙基哌嗪鎓溴化物(n＝1000，q＝0.20，z＝0.5)的共聚物。将500mg的共聚物溶于25ml的甲醇中。然后加入0.2ml酰肼水合物(0.2mmol)并于20℃持续反应24小时。在甲醇挥发后，收获反应产物并溶于水。然后进行醚提取，经中空纤维(Amicom)上的超滤分离主要产物并冷冻干燥。经修饰的多聚物中酰肼基团含量是利用以2，4，6-三硝基苯磺酸进行伯氨基测定的常规方法来估计的[S.L.Sny-derandP.Z.Sobooimsry，″Improved2，4，6—trinitroben—zene-sulfonicacidmethodfordeterminationofamine，″Anal.Biochem-.，1975，V.64，N1，P.284—288].(2)第二步中进行HYA与Synpol1000—20/50酰肼的缩合反应以制备共价蛋白多聚物连接物。为达到该目的，将100mgSynpol1000—20/50的酰肼溶于4ml1MHCl中。将溶液搅动冷却至0—2℃，与此同时加入1.15ml3％亚硝酸钠溶(0.5mmol)。15分钟内用2MNaOH将已活化的Synpol1000—20/50溶液的pH调节到8.5。然后，将溶于10ml0.05M磷酸缓冲液(pH8.5)，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠)的12mgHYA之溶液加到前述活化的Synpol1000—20/50溶液中。将反应混合物搅动并冷却(2—4℃)，并用2MNaOH在12个小时的反应时间内将pH保持在8.5。应用在Biogelp—100上的凝胶过滤以分离反应混合物的各成分并纯化HYASynpol连接物。用来自BioradInc的BiogelP—100填充层析柱(26×900mm)，并用含0.05MNa-Cl的0.05M磷酸缓冲液(pH7.5)平衡。用同样的缓冲液洗脱级分，以流式光度计(226nm)控制排出量。将所获连接物进行荧光光谱分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以估量蛋白质含量及分析连接物。结果表明1mg连接物制备物含有0.10mgHYA。实施例4透明质酸酶(HYA)与Synpol200—35/65的共价连接物的制备按照上文实施例2中描述的方法合成亚乙基哌嗪N-氧化物与N-乙酸亚乙基哌嗪鎓溴化物之共聚物(M.W.25000，n＝200，q＝0.35，z＝0.65)。按上文实施例3描述的方法进行HYA与该共聚物的连接。于pH＝8以多聚物/蛋白质比率5∶1进行多聚物与HYA的缩合，连接物的最后制备物在每1mg连接物中含0.15mgHYA。实施例5用活化醚法进行的透明质酸酶与Synpol1000—20/50的连接按照上文实施例1的方法合成亚乙基哌嗪N-氧化物与N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物之共聚物(n＝1000；q＝0.2n；z＝0.5)。采用了两步化学法以获得HYA与该共聚物的共价连接物。(1)第一步中，制备该共聚物的琥珀酰亚胺醚。为达到该目的，将100mg共聚物悬浮于4ml二甲基甲酰胺中，并于搅动中加入77.2mg(0.30mmol)双环己糖二酐-碳化二亚胺(dicyclohexid—carbodiimide)与36mg(0.30mmolN-羟基琥珀酰亚胺。反应持续24小时，其间搅动并冷却(2—4℃)反应混合物。用二噁烷、乙醚和丙酮洗涤反应混合物数次并使之在真空干燥盆中干燥。通过n-丁醇∶水∶乙酸(4∶1∶1)中″Silufol″板上的薄层层析未显示低分子混合物的存在。因而以标准方法(T.MironandWilcher，Anal.Biochem.，1982，V.126，N2，pp.433—435)(0.1M氨水溶液，pH＝8.5，259nm，消光系数＝9700l/mol×cm)估量活化醚基团的含量。由Lam-bert—Beer方程计算摩尔消光系数“epsilon”D＝epsilon×C×L其中D—光密度值；C—检测溶液中化合物的浓度；和L—光程。活化醚基团的含量为每克修饰的共聚物含9×10-4mol。(2)在此方法第二个步骤中，进行HYA与上述共聚物之琥珀酰亚胺醚共价耦联。为达到此目的，将于第一步中制得的活化共聚物100mg溶于10ml0.05M磷酸缓冲液(pH6.0)中，冷却，并于连续搅拌期间加入溶于12ml0.05M磷酸缓冲液(pH7.5)的15mgHYA溶液。缩合反应于0℃进行18小时，然后用于BiogelP—100(BioRad)柱上进行的柱层析将连接物从反应混合物中分离出来，如上文实施例3所述进行分析。该蛋白质—多聚物连接物最终制备物于每毫克连接物中含0.10mgHYA。实施例6连接物中HYA与Synpol为2∶1的共价连接物的制备。按上文实施例1所述方法合成Synpol1000—20/50。按上文实施例3所述的方法(在操作方案中只有一处改变Syn-pol与HYA在反应混合物中的起始比例为2∶1)进行HYA与Synpol的连接。终连接物制备物每毫克含0.3mgHYA。实施例7疫苗制备制备的疫苗包括HYA—Synpol连接物与本身作为免疫佐剂的另外数量的Synpol。如实施例1获得1000—20/50。以聚合物/蛋白质起始比例为1∶1如实施例3进行HYA与Synpol的连接。即用酰肼法将5mgHYA与5mgSynpol1000—20/50连接。然后将40mgSygnpol1000—20/50的水溶液加到纯化的连接物中，混合且冷冻干燥。如实施例3分析终复合制备物中HYA的含量，结果显示每毫克制备物含0.1mgHYA。实施例8含有作为免疫佐剂的胞壁酰二肽衍生物的疫苗复合物制备的疫苗复合物由HYA—Synpol连接物与为已知免疫佐剂的胞壁酰二肽的葡糖胺基衍生物组成。如实施例1合成Synpol1000—20/50。以聚合物/蛋白质比例为1∶1如实施例3获得HYA与Synpol的共价连接物。即将5mgHYA与5mgSynpol1000—20/50连接。然后加入10mgN-乙酰葡糖胺基-N-乙酰—胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(GMDP)，复合混合物冷冻干燥。实施例9含作为免疫佐剂的氢氧化铝的疫苗复合物疫苗复合物包括HYA—Synpol连接物和作为免疫佐剂的氢氧化铝如实施例1获得Synpol1000—20/50。在用实施例3的方法进行Synpol与HYA的共价连接过程中，应用聚合物/蛋白质的比例为1∶1。在免疫动物前，临时将连接物制备物与氢氧化铝悬液充分混合。实施例10H—Polyvac的临床前安全性评价H—Polyvac为针对游走形式的蠕虫的聚合物—抗原疫苗。该疫苗是透明质酸酶HYA与聚合物免疫刺激剂Synpol的连接物。蛋白质抗原HYA对多种形式的蠕虫幼虫是共同的。本发明人发展了Synpol并详尽地对其进行了研究。已显示此聚合物在0.25mg/kg的剂量时对人安全，因而可以推荐作为独立的免疫刺激剂和作为佐剂和/或疫苗的载体。免疫生物药品方面的委员会已批准Synpol作为连接物疫苗的一个化合物进行的注射。对于农业动物绵羊、小牛)H—Poly-vac的推荐剂量为4mg/只，含有0.5mgHYA抗原。本研究的目的是对H—Polyvac进行毒理评估以评价其安全性。为了增加所得数据的可靠性，在3种动物(小鼠、大鼠和豚鼠)上进行此研究。不仅研究了接近于接种剂量之剂量的影响，而且也研究了高于接种剂量10—100倍的过量剂量的作用。在毒理研究中应用高剂量使人们可以找出靶器官以及获得所用制备物的毒理特征。在注射高剂量期间检出的病理学改变并不被认为是临床试验的禁忌，而是给出了关于所试制备物限制的有价值的信息。在提供试验的实际详情及所得数据之前，在解释结果时下列陈述是有帮助的。如下文表8中所见，在对照安慰剂组大鼠中有10—20％发生肺炎、肺不张和肺脓肿。动物病理学专家熟知这样一个事实，即在大型实验室动物饲养设施中标准条件下饲养的大多数大鼠、小鼠和其它动物并不是全部都健康。它们的事实上患有多种病理学改变，这些改变通常在未对其内部组织和器官进行病理形态学检查时是无法发现的。例如，对实验室动物已仔细地调查了细菌病因的潜伏感染(K.Benirschke，editor，PathologyofLaboratoryAnimals，NewYork，1987)。对照组大鼠(临床上健康)的肺部疾病患病率非常高。根据G.Paget和P.Lemon，超过99％的对照实验室大鼠在其肺中有潜伏病理学改变(PathologyofLaboratoryAni-mals，Eds.W.RibelinandJ.McCoy，Springfield，1965，pp.382—405)。与此相似，J.Nelson已显示对照实验室大鼠81％有肺炎(PatholohyofLaboratoryRatsandMice.Eds.E.CotchinandF.Roe.Oxford，1967.P.259).J.Innes等人已描述了实验室大鼠所谓的“潜伏的慢性呼吸疾病“的病理形态学(Am.J.Path.；1956，V.32，pp.141—160；andinPathologyofLaborato-ryRatsandMice.Eds.E.CotchinandF.Roe.Oxford，1967，pp.229—259)，J.Lindsey等人也进行了描述(DiseaseofLaborato-ryAnimalsComplicatingBiomedicalResearch，Chicago，1971，pp.675—716)。根据J.LindSeyCop.cit)、E.Venzon等人(Philipp.J.Vet.Med.，1979，V.18，pp.117—124)和M.VanZwieten等人(Lab.Anim.Sci.，1980，V.30，pp.215—221)的意见，大鼠肺中隐匿的病理学过程主要是由肺炎支原体、螺旋巴斯德菌和/或小鼠肺炎病毒所导致。对临床上正常的WAG、August和Wistar近交大鼠以及俄罗斯医学科学院非近交繁殖群动物的广泛检查显示40—96％的大鼠患有慢性呼吸等疾病。呼吸器官部分或全部卷入上呼吸道、气管、支气管慢性卡他性或卡他性一脓性炎症以及慢性病灶性间质肺炎的发展中(E.Abfdrashitova，Respirato-ryorgansofratsbredinthepreductionColonies，Bull.Acad.Med.Sci.Russ.，1993，Na，81—85)。对于慢性肠炎，我们注意到它的准确的病因还不清楚，但可能它们是隐匿的感染性疾病的症状。在这种情况下最可能是由上述某种细菌引起的临床上隐匿的慢性炎症。因而已清楚所谓“正常”动物常常患有隐匿的感染。已广泛接受的概念是这种情况的发生是由于在大多数动物园通常发现的不理想的生活条件所致。这种情况对于研究工作和化合物的动物试验并不理想，然而，对于实验中的对照动物也有一些阳性结论由于“隐匿”感染，所用动物体质虚弱，所以本试验结果显示H—Polyvac完全的安全性(10×剂量注射了10倍)，不仅对健康动物，而且甚至对虚弱的动物。最后，还可以加上一条，即于正常感染的实验室动物所得的试验结果明显更接近于自真实农场条件下所得的结果。1.研究的材料与方法H—Polyvac临床前安全性评价的计划包括对小鼠腹腔输注急性毒性的评价、对以高于接种剂量10倍的量每天注射H—Polyvac持续10天的慢性毒性的评价；同时进行外周血分析，肝肾功能检查、心血管系统检查以及内部器官变化的病理形态学分析。另外，也进行了对注射的局部反应以及过敏性、突变性、致热性和致瘤性的的研究。疫苗的1次剂量为4mg(对10—15kg的绵羊用0.5mg蛋白质)。2.H—Polyvac急性与亚急性毒性评价在基础体重25克的小鼠上所做的急性实验中得出了H—Polyvac的平均致死剂量。根据小鼠的体重，仔细选择动物，所选的每只小鼠的体重变化距基础体重小于1克，即小于5％，每一剂量试验6只动物，观察16天，每天检查死亡情况。观察2周末时，杀死动物，检查其器官的形态学。将H—Polyvac样品溶于生理溶液后，制备5％溶液，然后以分别含3g/kg和0.75g/kg疫苗的剂量进行腹腔注射。用Litchfield和Wilcockson的概率单位—分析技术测定平均致死剂量，该项技术应用最为广泛并使人们得到相对完整的信息。表1的数据显示了H—PolyvacLD50为10.66±0.04g/kg。3.对H—Polyvac注射的局部反应的评估皮内注射按照苏联卫生部第31号令“免疫生物药品控制技术的统一”所推荐的技术进行H—Polyvac注射局部反应评估的实验。该实验用5只豚鼠；将生理溶液与H—Polyvac(0.1ml中含800mg)(稀释至1∶10和1∶100)以0.1ml的体积1次皮内注射到去毛后的皮肤不同区域。观察时间为1个月。结论在观察期内未见皮肤炎症的可见体征。4.H—Polyvac的亚急性毒性的评价用60只基础体重270—320克的雄性Wistar大鼠进行实验。将动物分成3组，每组20只。第一组动物接受0.4mg/kgH—Polyvac，第二组接爱4mg/kgH—Polyvac，而第三组作为对照组接受生理溶液。将H—Polyvac肌内注射每天一次共10天。将一些动物于H—Polyvac用药结束后立即处死，其余的则在结束四周后处死。进行生理、生化、血液学和组织学检查以及常规体重评价。然后用统计学方法评估结果。结果整个观察期间(6周)，实验组与对照组相比，动物的体重增加没有显著差异；同时，接受4mg/kg组动物体重的增加低于0.4mg/kg组动物(图4)。4.1肝、肾功能检测用F—901BiochemicalAnalyzer(Finland)和诊断试剂盆LAHEMA(USSR)进行血清分析。结果示于表2。该表显示0.4mg/kg剂量组及4mg/kg剂量组ALT活性有一些增加(分别为14.5％和19％)。实验结束后四周时，实验组动物血清生化指标与对照组之间并无差异。为评估肾功能，检查了每天的尿量及利尿速度。另外，也检测了肾小球滤过及肾小管重吸收情况。结果示于表3和4中。所得数据分析显示每天注射H—Polyvac共2周既不会影响肾滤过膜通透性、肾小管重吸收，也不会影响肾小球滤过。4.2血液学分析用GoryaevChamber检测了红细胞计数与总白细胞计数，并检测了血红蛋白浓度、红血球压积、颜色指数以及细胞血红蛋白浓度(CorpuscularHbComcentration)以评估外周血状态。颜色指数为细胞血红蛋白浓度为Hb(g/l)*3Ht(l/l)*10=%]]>其中Ht＝红血球压积，Hb＝血红蛋白结果示于表5数据显示只在接受10倍剂量的4mg/kg组与对照组比才有血球压积的显著降低。该降低没有超过大鼠该指标正常的生理变化。无论是在10H—Polyvac注射后立即检查，还是在用药终止后一个月检查均无外周血显著的其它异常。4.3中枢神经系统(DNS)状况检查该实验在雄性Wistar大鼠上进行。将H—Polyvac每天肌内注射共10天，而对照组仅注射生理溶液。在最后一次注射后第二天以及一个月后进行H—Polyvac对CNS功能状态影响的评价。进行下述检测—定向反应及活动能力，这两种指标是反映CNS善及神经肌肉活动能力的综合指标；—“Hole”反射，它也是一种定向反应。—脊髓“尾击(tailflick)”反射，它反映了动物痛觉感受性。—伸展(String)″试验，它反映了肌肉张力及运动协调性。结果示于表6和7中。用药结束后两组的活动能力(races)下降，0.4mg/kg组与对照组相比有显著差异(p＜0.05)。恢复期后，其活动能力近似于对照组。其它检测中与对照组动物相比无显著差异。4.4病理形态学分析于雄性Wistar大鼠上进行病理形态学分析。将H—Poly-vac肌内施用共10次，每次分别含0.4mg/kg和4mg/kg。用生理溶液的作为对照。研究标本制备两次H—Polyvac注射结束后直接制备(第一系列，26只动物)，和最后一次用药后一个月时制备(第二系列，恢复期，25只大鼠)。所有动物用去头方法处死。在收集血液进行生化分析后进行尸检，然后对内脏器官、浆膜及腔隙进行放大镜检，并测量器官重量颜色、充血程度、血液动力学紊乱或其它异常。从36只动物处(每组6只大鼠)采取下列器官，器官和组织标本进行组织学检查肝脏、肾脏、心脏、脯、睾丸、肾上腺、胸腺、脾、不同部位淋巴结、脑、脊髓、胃、小肠、胰腺、状腺、垂体、皮下细胞脂肪以及注射部们的肌肉。将全部器官和器官与组织标本在10％甲醛盐溶液中固定、然后冲洗，用乙醇处理并置于石蜡中。将至少2份置于玻片上并以苏木精曙红染色。由于感染及寄生虫疾病的大量传播，在对照组动物的器官中经常可以观察到病理性和反应性改变(见上文)。因此，在各组中均检测到异常改变的发生。4.4.2放在镜检结果在H—Polyvac用药结束后直接以及4周后杀死的动物上所做外部检查以及尸检时观察到的改变显示表8和9中。在H—Polyvac用药结束后直接杀死以及4周后杀死的实验动物之器官颜色和充血程度均与对照组一致。表10显示了第一系列和第二系列实验大鼠内脏器官绝对重量的参数。在第一系列组(0.4mg/kg)，脾重量显著下降；而在4mg/kg组，腹股沟淋巴结重量无显著增加。H—Polyvac用药后直接杀死及4周以后杀死之动物内脏器官重量相对指数与对照组动物相似(表11)。本章中所用的表达“内脏器官重量相对指数”指每一动物某内脏器官重量除以体重，再乘上100％的比率平均数。对H—Polyvac注射部位(皮下细胞脂肪、肌肉)的放大镜检未显示出在H—Polyvac用药结束后直接杀死动物(第一系列)中有任何血液动力学紊乱。只有9只对照动物中的1只以及0.4mg/kg组8只动物中的1只在皮下细胞脂肪中有穿刺出血。在第二系列(恢复期)中，在8只对照动物中有1只在皮下细胞脂肪中有穿刺出血。在两个系列的各组中均无炎症(发红、浸润)体征。4.4.3显微镜检结果注射部位在对第一系列大鼠(对照、0.4mg/kg和4mg/kg)的皮下细胞组织以及臂肌的组织病理学检查中末发现微循环的异常。实验组或对照组均无水肿、皮下浸润和增殖反应。在实验和对照组大鼠肌肉纤维中既未观察到渐进性坏死也未观察到萎缩性改变。在对照大鼠的肌肉组织中无炎症体征。同时，在0.4mg/kgH—Polyvac组的6只动物中有3只观察到轻度的单核细胞浸润，以单核白细胞和巨噬细胞居多。在4mg/kgH—Ply-vac组的6只动物中有4只单核细胞浸润的数量及大小有增加。细胞也有变化，以淋巴细胞居多且时常发现浆细胞。仅在1只对照组动物中，及在对1只0.4mg/kgH—Poly-vac组(在H—Polyvac用药结束后4周)的大鼠的注射部位组织学检查中观察到小单核细胞浸润；在肌肉组织中有小单核细胞浸润。没有萎缩性或渐进坏死性变化的微循环异常。内脏器官。H—Polyvac注射结束心脏在6只对照大鼠中的1只以及6只0.4mg/kgH—Polyvac组大鼠中的1只上观察到多个心肌小外周血管出血，在实验组或对照组，未发现微循环系统其它改变。没有水肿或间质肿胀，也没有任何炎性浸润或基质性心肌增殖活动。未观察到心肌纤维盘状解离或心肌细胞裂解。在所有各组的肺中均观察到血管及毛细血管的充血，有时伴出血。在实验组和对照组的某些动物中均检测到肺不张(肺泡的部分挛缩)以及小的病灶性肺气肿。在两组的小间隙中均观察到多核及单核细胞浸润。检测到支气管相连淋巴组织的轻度活动。H—Polyvac并不引起0.4mg/kg组或4mg/kg组微循环系统充血发生的增加，也无任何萎缩性、渐进坏死性或炎性过程的体征。无任何微循环系统改变，肾单位的肾小球和小管无萎缩性或渐进性坏死改变，也没有对0.4mg/kg或4mg/kgH—Polyvac的炎症反应体征。任一组肝脏微循环系统没有异常。实验组和对照组器官结构相似。未发现肝细胞萎缩性改变。1只对照大鼠有小的坏死灶，而在实验组或对照组均无渐进性坏死体征。在任何试验组均未发生炎性改变(网状内皮细胞的增殖和肥大，多核和单核细胞浸润)。在所有受检动物的胰腺中均无微循环系统的改变。未观察到外分泌部分(胰腺腺泡)的结构改变。在H—Polyvac注射的0.4mg/kg组或4mg/kg组，无萎缩性、渐进性坏死性以及炎性过程的体征。食管与胃在H—Polyvac注射的0.4mg/kg组或4mg/kg组均无微循环系统改变。无食管表皮损害的体征，也无心脏、基底或幽门胃区域的任何表皮损害，无炎性反应。在所有对照动物的小肠中观察到慢性肠炎。合并有绒毛的增厚、变形且有时互相粘附。发现了伴有绒毛基质浸润的表皮营养障碍和脱屑在小肠的严重病变部分发生隐窝破坏的重大变化。慢性肠炎的表现从轻度萎缩变为重度萎缩。与对照组相比，接受0.4mg/kg或4mg/kg剂量H—Polyvac的实验组没有发生改变。结肠在接受0.4mg/kg或4mg/kg剂量H—Polyvac注射的小组和对照组的微循环系统中未发生变化。结肠粘膜完整、光滑，无水肿。未见绒毛和隐窝上皮组织破坏、营养不良性改变或脱屑的征象。再生性上皮活性高，无炎性浸润。在对照动物的胸腺微循环系统中没发生改变。6只中的1只大鼠接受0.4mg/kgH—Polyvac，在胸腺的皮层区有出血。在接受4mg/kgH—Polyvac的6只大鼠中有3只出现伴随进一步出血的血管壁通透性增加。这组动物出现了机遇性胸腺退化的征象(表现为皮层区减少和结缔组织区增加)。在任何实验组都未发现炎性反应。脾在注射0.4mg/kg或4mg/kgH—Polyvac的微循环系统，或对照组中没有变化。在实验组中观察到白髓区适度减少的趋势，以及生发中心减小。白髓的细胞结构(生发中心，T依赖的和边缘区的比例)没有改变。实验组中功能区的活性与对照组没有不同成免疫细胞和浆细胞的数量总是很低。有丝分裂像和固缩也一样。在实验或者对照组中均没有营养不良，渐进性坏死或炎症现象。肠系膜和腹股沟淋巴结在实验组或对照组中，微循环系统均没有变化，也没有营养不良，渐进性坏死和炎症现象。在实验和对照组中，按三级系统评估的三种免疫类型(T—、B—和巨噬)的活性相近，而且均在正常范围内。脑在对照组和注射了0.4mg/kg或4mg/kgH—Polyvac的组中，在进行脑切片的组织学检查期间的微循环系统中没有变化。在室或脑膜的血管中没有变化。没有观察到皮质或其它脑神经元的结构改变和增殖性神经胶质反应。脊髓在注射了0.4mg/kg或4mg/kgH—Polyvac对照组的微循环系统中，没有变化。没有发现前柱和后柱，胶质细胞，白质组织有结构上的改变，也没有炎症反应。垂体在实验或对照组的微循环系统中没有变化。注射了0.4mg/kg或4mg/kgH—Polyvac的大鼠中，其垂体的细胞结构(腺垂体，中间部，垂体神经部)与对照动物的相似。所有生产激素的细胞均存在于腺垂体上皮，而且在所有待测组中均没有营养不良，渐进性坏死或炎症反应。甲状腺在所有被研究组的系统中均没有变化。实验组中，甲状腺功能单位(滤泡)的结构组织与对照组没有区别。滤泡由非液泡化的胶体均匀地填充，而上皮细胞有单层立方结构。淋巴细胞和C细胞没有营养不良的迹象，增加生长或坏死。在对照或注射了0.4mg/kg或4mg/kgH—Polyvac的大鼠中，均未发现炎症性的基质反应。肾上腺在注射了0.4mg/kg或4mg/kgH—Polyvac或对照组的微循环系统中，没有变化。在两个实验组中，功能区(皮质和髓质区)的比例仍与对照组相似。在分泌细胞中没有营养不良的迹象或者渐进性坏死的变化，在所有检测组中均没有炎症反应。睾丸在实验或对照组的微循环系统中没有变化。附睾结构仍未损坏，而且没有营养不良或渐进性坏死的变化，在所有被研究组中，精原上皮、足细胞既没有脱落，也没有不产生精子的现象。在莱迪希氏细胞中没有病理学变化或间质炎症发生。因此，病理形态学分析表明——慢性肌肉内注射0.4mg/kg和4mg/kgH—Polyvac在任何检测器官中均不会产生营养不良和渐进性坏死。——在下器官的微循环系统中没有不正常的迹象在注射了0.4mg/kgH—Polyvac的一只大鼠(六分之一)和注射了4mg/kgH—Polyvac的三只大鼠(六分之三)的胸腺中；在一只对照大鼠(六分之一)和注射了0.4mg/kgH—Polyvac的一只实验大鼠(六分之一)的心脏中；——肌肉内注射H—Polyvac不影响自发性肠炎的发生频率和程度；——在两种实验组胸腺和脾的实质工作区(胸腺的皮质区和脾白髓)中有一种减少的趋势；然而，很难认为因激活免疫系统而得到的结果是自发性慢性肠炎发展的结果。恢复期在终止施用H—Polyvac4周后而进行的组织学检测时，于所有检测组中的任何器官中(除上述小肠外)均没有微循环不正常的迹象，营养不良或渐进性坏死的变化，也没有炎症反应。在实验和对照组的肺中，观察到肺膨胀不全和小叶气肿(6只大鼠中的2只)在所有检测组的小肠中，都发现了自发性慢性肠炎的迹象。发现了上皮营养不良和脱落以及绒毛基质的周围细胞浸润。在所有检测组中，肠炎的程度从中度到严重不等。在所有组的胸腺中(对照，0.4mg/kg和4mg/kg)均发现了衰老的迹象，同时伴有限低的皮质活性。脾功能区有中度活性，而且细髓内浆细胞反应程度低并且偶尔有髓质外的红细胞生成病灶。结论在进行了10次肌肉内注射H—Polyvac的动物中完成的病理形态学分析结果表明在注射了0.4mg/kg和4mg/kg的所有检测动物中，H—Polyvac不会产生任何病理学改变。5.实验检测H—Polyvac的变应原性上述实验表明没有Synpol致敏活性。该实验的目的是检测H—Polyvac疫苗的变应原性，本文所用的Synpol与一种蛋白质抗原相结合。对分成4组的40只豚鼠完成该实验第一组—对照组，第二组—蛋白质抗原组，第三组—Synpol，和第四组—H—Polyvac组，皮下注射2mg/kg4次，每周一次。用2％的蛋白质水溶液和Synpol溶液完成皮滴试验。用P.L.Zeltser和V.N.Drozdov在1980年报道的用于评估酶水解制剂之变应原作用的组胺剌激技术检测致敏反应。该技术包括腹腔内和皮内注射待测抗原和0.03mg/kg组胺，然后进行1.5—2小时的过敏反应。根据该技术，组胺是作为一种更迅速清楚地反映弱变应原之致敏持征的血管辅剂。在10只实验和30只对照动物中估测不同淋巴细胞种群在双玫瑰花形成和用于豚鼠检测的以前修改的促细胞分裂剂刺激的玫瑰花形成(MSRF)反应(Dudintsavaetal.，1982)(表12)中的定量性比例和功能状态以确定H—Polyvac对免疫淋巴细胞的影响。结果表明在使用H—Polyvac后的第一分钟内，2％蛋白质抗原溶液只有初级的刺激性作用，反映在血管扩张和充血方面。没有发展立即或延迟的致敏反应。这些实验表明用聚合抗原疫苗处理人后，淋巴细胞既没有产生致敏作用，也没有定量的或功能失常。如果出现矛循的结果，则应考虑对血管的特定付作用。6.评估H—Polyvac诱导显性致死突变的能力按USSRMinistryofHealth于1981年编辑的“Recommen-dationsonNewDrugMutagenicPropertiesControl”完成这些实验。在精子生成的减数分裂前和后期连续进行5个星期的实验。以0.6mg/小鼠和30mg/小鼠的剂量腹腔内注射H—Polyvac，然后将3只处女雌性与H—Polyvac处理的雄性放在一起。18天后，对雌小鼠进行尸检，并考虑死的和活的数量。结论在小鼠胚胎细胞中，H—Polyvac不会诱导致死突变。同时施用接近LD—50的30mg/小鼠(1.5g/kg)，等于1.66＋0.04g/kg，在施用后第一天，引起雄性小鼠死之。7.估测H—Polyvac的致癌活性按“TheCommitteeonCarcinogenicSubstances”的说明估测H—Polyvac致癌活性。进行该实验的原因在于在疫苗中有聚合的化合物Syn-pol。用2种动物完成实验基线重为150—180g的400只雌性Wistar大鼠和40只对肿瘤产生敏感的小鼠(C57BI/6)。在两星期间隔的14—15个注射疗程中，腹腔内注射0.5ml在生理盐水中的0.1％H—Polyvac溶液，一星期2次，共8个月。这些动物注射的总剂量为100mg蛋白质/kg。给对照动物腹腔内施用生理盐水。持续进行观察直到动物自然死亡，同时杀死一些大鼠(有肿瘤而衰竭，病的)，确定肿瘤的大小，在10％甲醛溶液中固定后，拍摄内部器官的肉眼图片。实验持续2年1个月。在实验开始的9个月的不同时期内，对照组中有四只患自发性肿瘤的大鼠，在实验组中有3只。在实验大鼠中出现的第一个肿瘤比对照组中的晚半年。在实验组大鼠中，脾和肿瘤发展大小也明显要低。为了突出H—Polyvac的致癌活性，在C57BI/6小鼠中完成另一系列的实验以估测H—Polyvac对肺Luis癌发展的影响。根据体重(16g)仔细筛选小鼠，然后分成4组，每组10只。通过皮下注射0.5ml1∶1的肿瘤溶液与199培养基而将表皮Luis肺癌转移到所有动物中。组1是对照组，组2和348小时后分别腹膜内和皮下注射5mg/kg的H—Polyvac，而组4皮下接受2.5mg/kg的载体，相当于施用于组2和3小鼠中之载体的量。每天都进行所述的处理，连续5天。肿瘤转移后一星期，即施用H—Polyvac的第5天末，确定动物的体重和肿瘤大小。杀死小鼠，测量其体重，然后测量并分离其肿瘤，再称量其重量。结果列于表14。该表表明单独使用H—Polyvac和载体均会使肿瘤的发展降低43—28％(重)。与对照组相比，在所有组中肿瘤的大小和重量明显较低。可推测聚免疫刺激剂Synpol有抗肿瘤活性。在聚合物—抗原共轭物中，这些特性得到保留和/或提高(表14，栏2，4)。8.结论在TheLaboratoryofDrug—DiagnosticFormsoftheRus-sianMinistryofHealth完成H—Polyvac的完整和临床前的安全性评估研究。H—Polyvac是蛋白质抗原与聚合免疫刺激剂Synpol的共轭物。剂量为0.05mg蛋白质/kg动物体重的H—Polyvac是一种抗迁移形式蠕虫的疫菌，该剂量相当于肌肉内注射2倍0.4mg/kgH—Polyvac。按ThePharmacologicalCommitteeoftheUSSRMinistryofHeath的要求(1983.12.31的规定)和“TheVeterinaryPharma-cologicalCommittee”(1974)的要求完成H—Polyvac的安全性评估。在不同种动物小鼠(CBA和C57BI/6系)220只；Wistar大鼠，180只；豚鼠，85只中完成这些实验。结果表明在腹膜内输注期间，H—Polyvac是一种LD—50为1.66＋064mg/kg的实践上非毒性物质(危险级为5，根据SOST12.1.07—76)。以接种(0.4mg/kg)和10倍(4mg/kg)的剂量，每天多列注射H—Polyvac以检测慢性毒性。根据血液学、生理学、生化、免疫学分析，H—Polyvac对动物体重、行为，中枢神经系统，心血管系统、肝和肾功能以及血液没有副作用。经病理形态学分析表明，在任何内部器官和组织中均没有病理学改变。还证实用注射以外的方法也没有刺激性，还没有变应性免疫毒性和诱变性。在延长施用H—Polyvac(8个月)和2.2年的观察期间，没有检测到致癌性。因此，H—Polyvac安全性评估研究的结果表明了H—Polyvac的安全性和广泛的治疗率区(大于400)。认为4mg/kgH—Polyvac的治疗剂量是绝对安全的。实施例11实验性的和巴斯德试验为了评估本发明疫菌实施方案的有效性，在上文的USSR完成一系列实验和巴斯德试验。本实施例部分所用的术语“H—Polyvac”指本发明的疫苗组合物。1.由H—Polyvac赋予的抗细粒棘球绦虫的实验性的保护作用1.1引言细粒棘球绦虫的生活周期由几个连续节段组成，首先在狗中，然后在羊、猪或人中。两种不同时期特异性的细粒棘球绦虫作为寄生虫生活在提及的种中。头节带形式的生活在狗的肠中；所述带的最后一节(含有约成千的细粒棘球绦虫六钩蚴(oncospnerae)与蠕虫分开，然后散布于宿主的排泄物中。细粒棘球绦虫的卵可经口侵入羊、猪或人。然后棘球绦虫的囊(囊)形式损害上述动物或人的肝和/或肺。为了估测H—Polyvac疫苗抗棘球蚴的效力，对用细粒棘球绦虫人工攻去动物和自发侵性均进行研究。用原头节人工感染狗，而用细粒棘球绦虫的六钩蚴感染羊羔和小猪。1.2狗抗细粒棘球绦虫之实验性攻击的保护作用首先，人们要确定H—Polyvac对细粒棘球绦虫是有保护作用，并估测对狗的有效剂量的近似范围。在第一个实验中，使用了24只3月龄的狗，研究0.5mg到50mg之间的H—Polyvac。用0.5mg，5mg或50mg之间的H—Polyvac分别肌肉内注射三组各含6只狗的组，注射2次。第一次后的21天，进行加强免疫。安慰剂组的6只狗注射0.9％NaCl盐加强免疫后2星期，用16000个细粒棘球绦虫的原头节经口服感染24只狗中的每一只。一个月后，杀死所有所用的狗并解剖，测量寄生在肠的细粒刺球绦虫蠕虫数量。表15中所列的结果清楚地表明预先免疫狗明显地提高了其对细粒棘球绦虫侵入的抗性。在H—Polyvac免疫的狗肠中所发现的棘球绦虫数比安慰剂对照组中的小150—120倍。此外，保护作用的强度明显依赖于H—Polyvac的剂量。以约5mgH—Polyvac重复注射2次免疫狗似乎是最佳的。下列实验的目的在于重复测量H—Polyvac抗棘球蚴病的保护作用，并研究5mg左右的H—Polyvac是最佳的。为了达到这些目的，这次用4组狗，每组3只，共12只(表16)。第I组狗接受2次4mg(i/m)的H—Polyvac，第一次和第二次免疫之间间隔21天。第II组狗接受2次8mg的H—Polyvac。第III组狗先用4mg，再用8mgH—Polyvac加强。第IV组中的狗接受盐并作为安慰剂对照。加强免疫后2周，通过口服5，000细粒棘球绦虫的原头节而人工感染所有的狗。一个月后，杀死动物，解剖，通过计数肠中的细粒刺球绦虫数而确定所得的侵入强度。所得的结果列于表16，并证实了前述实验的数据。它们首先表明了H—Polyvac在保护狗免于细粒棘球绦虫侵染方面的高效性，其次表明用5到10mg的H—Polyvac肌肉内免疫狗是最佳剂量。事实上，未接受H—Polyvac的第IV组对照狗受到严重地侵染，在其肠中有约2,000棘球绦虫，相反，在注射了2次4mgH—Polyvac的第I组狗中，有少于100—300倍的棘球绦虫。将H—Polyvac剂量增加到8mg使其抗棘球绦虫的保护效力得到提高。在分别用(8mg＋8mg)或(4mg＋4mg)方式的H—Polyvac免疫的第II和III组狗的肠中，只发现了少量(0到3)个(表16)。1.3H—Polyvac对猪抗细粒棘球绦虫的实验性攻击将共40只1月龄的小猪分成4组，每组10只。用5mgH—Polyvac给第I、II和III组中的所有动物注射2次。在第一次注射H—Polyvac后7天(第I组)，14天(第II组)，或21天(第III组)进行加强注射。第IV组的10只小猪接受盐代替H—Polyvac。加强免疫后20天，口服10,000六钩蚴的细粒棘球绦虫人工攻击所有动物。7个月后，将这些猪杀死，计数肝中的棘球绦虫的囊形式。安慰剂IV组的所有猪经棘球绦虫侵染。发现了15—20mm的大棘球绦虫囊，每个肝中的蠕虫数从8到12泡不等(表17)。相反，在注射了H—Polyvac的大多数猪中都没有棘球绦虫。第I、II和III组的猪中，分别有70％，90％和80％的动物绝对没有棘球。此外，若发现了蠕虫，则其数目为每肝1到4个棘球绦虫囊不等。另外，在用H—Polyvac免疫的猪中所见到的蠕虫细虫很小(约2—3mm)。毫无疑问，表17中所列的数据表明第一次和第二次注射H—Polyvac的间隔，对于免疫小猪来说，间隔14—21天是优选的。所得的数据清楚地表明了H—Polyvac对于预防在猪中实验性诱导的棘球蚴病的高效性。另外，上述结果确定了用H—Polyvac有效接种小猪的剂量和免疫方式。1.4保护羊抗细粒棘球绦虫的实验性攻击在这些研究中用2—5月龄的羊羔。三种不同的实验分别用12，20和20只羊羔完成。设计开始的实验以检测对狗和小猪有效的剂量，即5mg和10mgH—Polyvac在羊中的作用。将3—4月龄的12只羊羔分成3组，每组4只(表18)。通过肌肉内注射2次5mgH—Polyvac而免疫第I组羊羔，第一次和加强注射间间隔为21天。用相同的方法，给第II组施用2次10mgH—Polyvac。剩下的4只羊羔作为安慰剂对照它们接受0.9％NaCl盐。第二次免疫后2周，通过口服10,000六钩蚴用细粒棘球绦虫感染所用的羊羔。400天后，杀死三组羊，交其解剖，计数在其肝和肺中的细粒棘球绦虫的囊数。所得的结果列于表18，其中在安慰剂组羊中的强度侵染是显而易见的。在这组羊的内脏器官中发现了大量细粒棘球绦虫的棘球蚴(平均值为88每只动物)。用H—Polyvac免疫的动物在其内部器官中有少于8—15倍的棘球。此外，在H—Polyvac免疫的羊中，棘球囊的大小为1—2.5mm，与在非免疫对照动物中的4—9mm形成对比。随后相似的实验用20只3周龄的羊羔，将其分成3组。间隔21天，用5mgH—Polyvac肌肉内(i/m)将8只羊羔免疫2次(表19)。给另一组的8只羊羔皮下(s/c)注射5mgH—Polyvac。间隔21天注射2次。最后，剩下的4只羊羔接受0.9％NaCl盐，作为安慰剂对照。加强免疫后2周，用10,000细粒棘球绦虫的六钩蚴感染所有的动物。表19中列出的该实验的结果与开始的实验的结果(见表18)相似。除在保护羊羔免于10,000六钩蚴的实验性攻击方面有免疫(经注射2次5mgH—Polyvac而完成)高效性外，表19的结果还表明肌肉内和皮下注射H—Polyvac均是可接受的接种方法。在第三个结论性实验中，按表20中所列的方法，将20只4.5月龄的羊羔分成3组。用两种不同批次的H—Polyvac进行免疫。用5mg第1批H—Polyvac将第I组的8只羊羔免疫2次。第II组的8只羊羔接受5mg第2批的H—Poly-vac。剩下的4只羊羔作了安慰剂对照。然后在加强免疫后2周，通过口服10,000个六钩蚴而用细粒棘球绦虫感染所有的20只羊羔。在攻击后的第425天，杀死所有的动物并进行解剖，然后计数在其肝和肺中的蠕虫数。所得的结果再次表明了H—Polyvac在保护羊抗大量细粒棘球绦虫六钩蚴的实验性侵染方面的高效性(表20)。事实上，安慰剂组的对照羊受到严重侵染，在其肝和肺中带有大量(平均值二65蠕虫/动物)的棘球绦虫。注射了2次5mg(肌肉内)第1批和第2批H—Poly-vac后，均可显著提高羊羔对细粒棘球绦虫攻击的抗性。这些动物中的一部分(在第I组的8只中有3只，即37.5％)在其内部器官中完全没棘球绦虫。其余接受免疫的羊在其肝和肺中有少量(在第I和II组中，平均值分别为3和2.5/只动物)的棘球绦虫囊。此外，在H—Polyvac免疫的羊中，蠕虫棘球蚴(2—3mm)比对照动物(5—7mm)中的小。1.5H—Polyvac防止狗、猪和羊中的实验性棘球绦虫病的效力在上述1.1—1.4中，有关在用大剂量细粒棘球绦虫人工感染的动物中，H—Polyvac活性的研究可以使我们得出下列结论(a)预先免疫狗、羊和猪可以显著提高其对细粒棘球绦虫侵染的抗性；(b)用H—Polyvac免疫可使上述动物防御甚至抗棘球绦虫的强有力的攻击(通过用成千的侵染性蠕虫人工急性攻击动物而模仿的)；(c)H—Polyvac抗细粒棘球绦虫的保护性作用紧紧地依赖于H—Polyvac的剂量。在第一次和加强免疫之前间隔14—21天，肌肉内或皮下注射2次5mg的H—Polyvac对于免疫小狗，1月龄小猪或3—5月龄羊羔均是最佳的。2.H—Polyvac赋予的抗Dictyocaulusfilaria实验性攻击的保护作用对于常用于不同蠕虫种的包含在H—Polyvac中的透明质酸酶—抗原，人们希望H—Polyvac的保护作用不仅限于抗棘球绦虫，也能抗其它蠕虫种。本节将说明为了评估在羊中，H—Polyvac的保护作用而做的研究，是就羊对大量D.fi-laria人工攻击的抗性而论。感染动物蠕虫是侵染期3的动虫(L3)，它们经口进入生物体内。这些寄生虫然后穿过肠壁并在宿主中迁移，最后到达肺。在此，它生长数周，发育到成熟期。在肺组织中生长时，3—10cm的成熟肺蠕虫破坏其微环境从而导致肺炎、肺膨胀不全和肺脓肿。考虑到实验攻击羊羔中D.filaria的生活周期，用500L3—幼虫口服感染羊羔，2或3个月后，计数肺中的D.filaria。共用3组不同的实验确定H—Polyvac对人工诱发的网尾线虫病(dictyocaulasis)的作用。在第一个实验中，用12只3—4月龄的羊羔；其中4只肌肉内注射2次5mgH—Polyvac(第1批)，而另4只接受相同剂量的第2批H—Polyvac。在初次免疫后第21天，进行加强免疫。其余4只作为安慰剂对照(表21)。加强免疫后2周，用500个网尾线虫(dictyocaulae)幼虫口服人工攻击动物。2个月后，杀死动物，计数每只生物体中的D.filaria数。用H—Polyvac免疫羊羔使其对D.filaria数。用H—Polyvac免疫羊羔使其对D.filaric的强烈急性侵染(口服500个幼虫)有抗性。攻击后2个月，约15％接受免疫的动物完全没有D.filaria。其全H—Polyvac免疫的动物只受到少量(平均约4或5个蠕虫/个体)的侵染，而对照组中未免疫的动物受到网尾线虫的严重侵染(平均值＝67个蠕虫/动物)。在表22中总结的下列两个实验得到了与表21相似的结果。总之，用5mg(肌肉内，间隔21天，2次)H—Polyvac免疫2—3月龄羊羔可保护动物抵御500个D.filaria幼虫的强烈攻击。因此，H—Polyvac的保护作用不限于细粒棘球绦虫。正如本节中清楚表明的，在D.filaria强烈侵染羊羔的实验模式中，H—Polyvac也是有效的。发现相同H—Polyvac剂量和免疫方式在所研究的两种蠕虫病中均是有效的。3.H—Polyvac赋予的抗肝片吸虫实验性攻击的保护作用在下文讨论的两个实验中使用3—4月龄的羊羔。按表23和24所述的方法，用3—10mg的H—Polyvac免疫动物。加强注射后2周，用肝片吸虫人工侵染接受免疫的和对照(安慰剂)动物。为了达到该目的，口服50或100个侵染性幼虫，即后囊蚴。5到7个月后，杀死动物并解剖，然后计数在其肝中的片数。所得的结果表明了H—Polyvac的显著保护作用。注射2次3或5mg的H—Polyvac可使宿主生物中存活的蠕虫数降低50％，甚至在例如口服100个后囊蚴的强烈攻击后，也是如此(见表23)。只要后囊蚴的攻击剂量减少一半，H—Polyvac的保护作用就会达到95—96％(见表24)。已完成的实验清楚地表明H—Polyvac诱导了对大量小片之人工侵染的免疫防御。将1和2部分综述的数据放在一起，它们说明了H—Polyvac对三种不同虫，即肝片吸虫，D.fi-laria和细粒棘球绦虫的多特异性保护作用。此外，如果H—Polyvac免疫可以使动物抵御所用大量蠕虫的强烈急性攻击，则人们可以肯定在自然条件下，在遭受自发蠕虫侵染的动物中，所述疫苗也有保护作用。巴斯德试验表明这些期望是正确的。4.用H—Polyvac抗细粒棘球绦，D.filaria和肝片吸虫自发侵染的多特异性预防熟知的事实是特定的蠕虫侵染是牧场和/或动物饲养区常见的现象。有些地区(或农场)就网尾线虫片来说，其它就幼绦虫侵染，片吸虫病等来说是不利的。词语“不利的”在此指年复一年，在农场/地区生长的新一代动物都会受到相同的侵染，而且受到侵染的动物的百分比很高(常常高于50％)，最后，寄生于动物的具体蠕虫侵染种的数量会很高以致在动物中呈现蠕虫病的临床症状。考虑到这点，就不利的棘球绦虫，网尾线虫或片吸虫病来说，在不同的动物牧场和牧区进行H—Polyvac的牧草试验。在这些试验期间，不时发生了多种蠕虫(上述的)侵染。4.1在牧草条件下防止细粒棘球绦虫羊和狗在称为KaragandaDistrict(CentralKazakhstan)的“Koyadinsky”USSR国家羊牧场和Chadyr—Langoon区(Moldo-va)的收集的羊牧场“Leninskypoot”完成开始的试验。就棘球绦虫而言，两个牧场都出现了不利情况。事实上，这些牧场上60％以上的羊都受到棘球绦虫的侵染。根据表25和26中所列的方法，在牧场“Koyadinsky”共用了25只2—3月龄的羊羔，在牧场“LeninskPoot”共使用了135只羊羔和11只牧羊狗。用5或10mg第1批工中第2批H—Polyvac将动物免疫2次。在H—Polyvac免疫期间和加强免疫后2周，将它们与它们所属于的畜群分开。然后使它们回到畜群，在正常牧草条件下生活，与棘球绦虫侵染的动物相接触。在“Koyadinsky”牧草一年后，在“LeninskyPoot”牧场8个月后，将羊杀死，然后计数在其肝和肺中的棘球绦虫数。正如在表25和26中可看到的，对照的未免疫的羊受到棘球绦虫的严重侵染。相反，已用H—Polyvac免疫的羊对侵染有明显的抗性。在H—Polyvac的保护下，受侵染动物的百分比从78％降到26％，在“Koyadinsky”每只受侵染动物的棘球绦虫的平均数从25降到2或者在“LeninskyPoot”从4.8降到1.8。注意到第1批和第2批H—Polyvac的保护作用没有明显的差异。除棘球绦虫外，在“LeninskyPoot”的杀死的动物中，发现了由有关其它种绦虫，即Coenuruscerebralis和Cysticercustenuicollis引起的侵染。表26所列的数据表明H—Polyvac免疫实质上不仅提高了羊对棘球绦虫侵染的抗性，而且也提高了对C.cerebralis和C.tenucollis侵染的抗性。在“LeninskyPoot”牧场，将11只羊狗与135只羊一起牧草。它们是成羊狗，而且由于它们已受到绦虫的侵染，所以用称为“Droncit”的抗蠕虫剂处理它们，以使其在H—Polyvac免疫前，使其摆脱蠕虫。随后，用10mgH—Polyvac(肌肉内，21天的间隔)给其注射2次，然后与它们通常照顾的畜群生活在一起。每月检测所有11只狗的排泄物以检测狗是否再次受到绦虫的侵染。最后，H—Polyvac免疫后8个月，这些狗接受抗蠕虫剂以确定绦虫的侵染。在整个观察新时期，在已接受H—Polyvac的狗中没有发现绦虫。4.2保护羊羔免于D.filaria的自发侵染在集中性羊牧场“Druzhba/(BolshenarymskyRegion，East-erKazakhstan)和羊牧场“Maximoka”(AnnenyNoyRegion，Moldova)(这两个牧场均受网尾线虫病的干扰)完成这些牧草试验。在“Druzhba”和“Marimoka”通常90％—100％的羊受到网尾线虫的侵染。在““Druzhba”和“Marimoka”分别共使用220和68只1.5—2月龄的羊羔。用H—Polyvac免疫羊羔，加强免疫后2周将其送到牧场牧草并与它们所属的畜群生活在一起。免疫后7个月杀死“Druzhba”的羊；然后确定其肺中的网尾线虫数(表27)。不杀死本试验所用的“Marimoka”的羊羔，但在用H—Polyvac免疫后5个月，通过对其粪便进行网尾线虫细虫的粪便学分析来确定D.filaria侵染的程度(表28)。4.3在牧草条件下，预防羊羔肝片吸虫的自发侵染用“PootRybaka″(Dagestan，RussianFederation)的羊和属于StavropolStationforVeterinaryResearch(StavropolDisrict，RussianFederation)的羊完成这些试验。在所述试验中，分别共使用了Dagestan和Stavropol牧场的243只和50只羊羔。此外，在Dagestan羊牧场中的三个不同畜群使用三个不同批次的H—Polyvac，即批号IG—4，IG—8和IG—16。在Stavropol牧场的相同畜群中使用两个批次的H—Polyvac(第1和第2批)。用H—Polyvac免疫这些羊羔，2周后，将其送回它们的畜群以使其在正常牧草条件下生活。6、7或10个月后，杀死羊羔，计算在其肺中的片吸虫数。表29和30所示的数据表明H—Polyvac免疫明显降低了羊羔对片吸虫侵染的敏感性。所用所有批次的H—Polyvac对于预防羊羔中的片吸虫病均是有效的。要知道5mgH—Polyvac与20mg作为附加的免疫辅剂的Synpol结合比单独使用5mgH—Polyvac的保护作用稍高。后来，在大规模H—Polyvac试验中这种观察结果得到证实和利用(见下文5.2)因此，尽管用大量侵染性蠕虫(细粒棘球绦虫，D.filaria，肝片吸虫)急性人工攻击而产生的感染的特征与正常牧草条件下自发攻击的特征显著不同，但H—Polyvac的实验和牧草试验均说明该制剂在预防上述蠕虫病方面的高效性。5.H—Polyvac的国家试验总结了上述所得的实验和牧草试验的数据后，前苏联的StateChiefDirectorateforVeterinaryMedicine和StateVetri-naryInspection决定在牧草条件下，完成大规模的H—Poly-vac试验(1990，5，21第46号)。国家对照设计追求只少两个目的首先证实H—Polyvac对位于国家不同地理和气候区的动物牧场的高效性，第二，用大动物种群估测H—Polyvac的保护作用5.1受到棘球绦虫病，网尾线虫病或片吸虫片侵害的羊牧场包括位于Ukraine(kharkov和SoomyRegions，CrimeaDis-trict)，Moldova(AnnenyNoyReg.和GaraklyRegion)，Georgia，Uzbekistan(SamarkandRegion)，Central，South和EasternKaza-khstan，俄罗斯联邦的南部(Dagestan和StavropolDistricts)和俄罗斯联邦的中部(NyzhnyNovgoroel，Voronezh，Belgorod和BelayaTserkov)的牧场。表31总结了国家试验所用的位置和动物数。来自所有试验的数据完全证实了上文所得到的结果。总之，用效力系数(EC)可以很方便地总结所得的结果即EC=C-VC×100%]]>其中C是对照组中平均每个生物体的蠕虫数，V是接受H—Polyvac的接种动物中的相同参数。用效力系数，数据表明在预防网尾线虫中，H—Polyvac的效力在82％到90％之间，预防片吸虫中为约90％，最后在预防棘球绦虫中与接近100％。作为完成试验的方法的实例见下文来自在EasternKazakhstan用数千只羊完成的实验数据的简要讨论。5.2H—Polyvac在牧草条件下对大羊种群的试验在流行病学和动物流行病学家普遍接受的观点是所研究的种群越大，有关感染流行病学的资料越精确。这对于确定疫苗的效力也是有利的，因此，对数千只羊羔所做的H—Polyvac试验的数据有很大的价值。下文列举了一些实例。在集中性牧场“Druzhba″(EasternKazakhstan)对11000只牧草的羊羔检测H—Polyvac保护特性。在将羊羔送去牧草前，以5mg/动物的剂量给20—30天的羊羔以21天，45天的间隔施用2次疫苗。一年后，杀死1127只羊羔，在6只羊羔中发现了3—4多头蚴/动物，而未发现网尾线虫、片吸虫或棘球绦虫。侵染动物占未接种羊的百分比在牧场的不同畜群中从80％到100％不等。第二年，在相同的集中性牧场“Druzhba”对牧草的11700只羊羔进行H—Polyvac试验。在将其送到牧草前，这次用5mg加20mgSynpol/动物的剂量，将疫苗以21天，45天的间隔给20—30天的羊羔注射2次。7个月后，杀死5000羊羔，在25只羊羔中发现了1—3个网尾线虫，但未发现片吸虫或棘球绦虫。在对照(未接种)畜群中的侵染程度为90—100％。H—Polyvac的两个大规模试验均清楚地表明在真正的动物饲养条件下，其效力很高。表1H—POLYVAC急性毒性评价表2H—POLYVAC肌内注射期间雄性大鼠血清生化参数参数单位对照H-POLYVAC0.4mg/kg4mg/kg10次注射后肝重系数4.15±0.113.87±0.103.85±0.10总蛋白g/l36.59±0.5636.34±1.1535.07±1.04葡萄糖mM/l8.90±0.248.65±7.289.28±0.27胆固醇mM/l45.88±3.3778.90±3.5153.17±4.05尿囊mM/l6.58±0.326.44±0.307.17±0.27肌酐mcM/l74.4±3.1172.4±4.3777.9±2.66氯mM/l101.5±0.84101.0±0.72102.2±1.43ALTU/l62.9±3.6572.0±2.57*74.9±3.97*ASTU/l391.1±41.87386.5±19.70398.4±32.12APU/l363.9±71.62825.3±125.9837.1±70.38用药结束后4周肝重系数3.71±0.183.74±0.123.31±0.09总蛋白g/l38.70±1.2841.00±0.7641.62±1.49葡萄糖mM/l8.76±3.208.16±4.098.73±3.57胆固醇mM/l54.15±5.3950.01±3.2146.49±5.73尿素mM/l7.36±0.246.52±0.366.90±0.39肌酐mcM/l98.88±3.1391.33±5.98102.48±4.78氯mM/l99.1±0.26100.0±1.53100.3±0.83ALTU/l75.8±7.9078.2±6.0869.4±4.26ASTU/l343.7±21.47376.6±28.51355.9±18.50APU/l491.0±35.9461.9±33.4518.3±31.3表3H—POLYVAC注射期间肾功能评价*CLEAR.-清除率表4H—POLYVAC注射后1个月肾功能的评价CLEAR.-清除率表5肌肉注射H—POLYVAC10天后雄性大鼠的外周血分析<>表6肌内注射H—POLYVAC10天后雄性大鼠CNS功能状况参数参数对照H-POLYVAC0.4mg/kg4mg/kgN-9N-8N-9方向探素行为(U)-活动能力72.8±6.343.0±8.0(P＜0.01)55.2±7.5-组25.2±4.725.5±7.526.0±7.9-″HOLES″-反射3.1±0.72.0±0.55.1±0.8疼痛感觉阈值(c)6.76±0.427.04±0.426.57±0.23“伸展”—试验(mm)56.7±3.054.4±4.151.1±3.9表7肌内注射H—POLYVAC后重恢复期一个月雄性大鼠CNS功能状况参数参数对照H-POLYVAC0.4mg/kg4mg/kgN-9N-8N-9方向探素行为(U)-活动能力40.6±5.140.6±8.433.9±5.7-组14.6±4.228.4±7.918.7±6.4-″H0LES″-反射3.7±0.82.6±0.63.6±0.4疼痛感觉阈值(c)6.76±0.427.04±0.426.57±0.23“伸展”—试验(mm)56.7±3.054.4±4.151.1±3.9表8用药结束后直接杀死动物观察到的病理体征出现频率对照H-POLYVAC改变0.4mg/kg4mg/kgN-9N-8N-9肺炎212肺不张111肺脓肿112胸腺点状112出血腹股沟淋巴355结点状出血心肌点状出血012注射部位点状出血110肝脏点状出血100表9H—POLYVAC用药结束后4周尸检中病理改变出现频率对照H-POLYVAC改变0.4mg/kg4mg/kgN-9N-8N-9肺炎112肺部点状出血010胸腺点状122出血腹股沟淋322巴结点状出血注射部位100表10应用H—POLYVAC动物的绝对内脏器官重量(INmg)组用药结束对照H-POLYVAC0.4mg/kg4mg/kg器官N-9N-8N-9肝13.99±0.4912.70±0.6512.59±0.53肾2.25±0.082.28±0.072.16±0.05心1.07±0.041.07±0.041.04±0.03肺1.63±0.051.57±0.071.53±0.04胸腺0.38±0.040.35±0.050.34±0.03脾1.81±0.091.53±0.08*1.83±0.09肾上腺0.06±0.0020.057±0.0020.056±0.002睾丸3.20±0.093.45±0.093.27±0.10腹股沟淋巴结0.08±0.0070.07±0.0060.09±0.002体重(g)317.7±11.2327.4±10.7326.4±7.9组恢复期对照H-POLYVAC0.4mg/kg4mg/kg器官N-8N-8N-9肝13.69±0.4113.87±0.4812.00±0.70肾2.54±0.062.57±0.092.43±0.08心1.15±0.041.12±0.041.17±0.05肺1.64±0.051.76±0.081.67±0.06胸腺0.25±0.020.24±0.020.24±0.02脾1.27±0.081.49±0.091.48±0.13肾上腺0.064±0.0020.064±0.0010.06±0.001睾丸3.38±0.113.36±0.123.44±0.09腹股沟淋巴结0.048±0.0060.063±0.0080.071±0.03*体重(g)370.3±7.1373.0±15.4367.8±12.3*-与对照组比有显著差异(P＜0.05)表11应用H—POLYVAC动物的相对内脏器官重量(1Nmg)组用药结束对照H-POLYVAC0.4mg/kg4mg/kg器官N-9N-8N-9肝4.16±0.113.87±0.093.85±0.10肾0.67±0.010.70±0.020.69±0.02心0.32±0.010.33±0.010.32±0.01肺0.48±0.020.48±0.020.47±0.02胸腺0.11±0.0090.11±0.010.11±0.01脾0.54±0.030.47±0.020.56±0.02肾上腺0.02±0.00070.02±0.00080.02±0.0009睾丸0.96±0.041.06±0.031.00±0.08腹股沟淋巴结0.02±0.0020.02±0.0020.03±0.001体重(g)337.7±11.2327.4±10.7326.4±7.9组恢复期对照H-POLYVAC0.4mg/kg4mg/kg器官N-8N-8N-9肝3.72±0.163.74±0.113.31±0.12肾0.69±0.020.69±0.020.68±0.03心0.31±0.0080.30±0.110.33±0.008肺0.44±0.0090.47±0.020.46±0.012胸腺0.07±0.0070.07±0.0060.07±0.016脾0.34±0.020.40±0.020.42±0.03肾上腺0.02±0.00050.02±0.00060.02±0.0005睾丸0.91±0.020.91±0.030.94±0.03腹股沟淋巴结0.011±0.0010.02±0.0020.02±0.002体重(g)370.0±7.1373.0±15.4*-与对照组相比有显著差异(P＜0.05)表12豚鼠用H—POLYVAC处理后不同淋巴细胞群的量比及功能状态表13小鼠胚胎细胞优势突变的登记注在实验和对照中均用10个雄性表14H—POLYVAC和POLYOXIDONIUM对小鼠表皮路易斯肺癌发展的影响<P＜0.014表15<p>表16表17*)EI—侵染程度(受侵染动物的百分比)；**)II—侵染强度(蠕虫数/动物)表18<p>表19表20<<p>表21表22表23表24表25在牧场“KOYADINSKY”的H—POLYVAC的牧草试验</tables>表26在牧场“LENINSKYPOOT”的H—POLYVAC的牧草试验EL—侵染程度；**)II—侵染强度(参见表3)表27在羊牧场“DRUZHBA”的H—POLYVAC的牧草试验<p>表28在羊牧场“MAXIMOKA”的H—POLYVAC的牧草试验<便学表29在牧场“POOTRYBAKA”的H—POLYVAC的牧草试验>权利要求1.保护脊椎动物免受蠕虫感染的化合物，包括与一种免疫刺激性载体共价偶联的透明质酸酶。2.包括权利要求1的化合物的疫苗组合物。3.如权利要求2的疫苗，其中所说的免疫刺激性载体是Synpol。4.如权利要求2的疫苗，其中所述透明质酸酶选自透明质酸氨基葡糖苷酶、透明质酸葡糖苷酸酶和葡糖醛酸裂解酶。5.如权利要求2的化合物，其中所述透明质酸酶分子量约为63KDa。6.权利权要求2的疫苗，还包括一种佐剂。7.如权利要求6的疫苗，其中所述佐剂实质上包括Syn-pol。8.如权利要求7的疫苗，其中所述佐剂实质上包括氢氧化铝。9.如权利要求7的疫苗，其中所述佐剂实质上包括修饰的胞壁酰二肽。10.保护脊椎动物免受蠕虫感染的方法，包括给脊椎动物施用治疗有效量的、含有与一种免疫刺激性载体共价偶联之透明质酸酶的化合物。11.如权利要求10的方法，其中的化合物以疫苗施用于脊椎动物。12.如权利要求10的方法，其中所述免疫刺激性载体是Synpol。13.如权利要求11的方法，其中所述透明质酸酶选自透明质酸氨基葡糖苷酶、透明质酸葡糖苷酸酶和葡糖醛酸裂解酶。14.如权利要求10的方法，其中所述透明质酸酶分子量约为63KDa。15.如权利要求11的方法，其中所述疫苗还包括一种佐剂。16.如权利要求15的方法，其中所述佐剂实质上包括Synpol。17.如权利要求15的方法，其中所述佐剂实质上包括氢氧化铝。18.如权利要求15的方法，其中所述佐剂实质上包括修饰的胞壁酰二肽。19.如权利要求10的方法，其中所述治疗有效量包括所述脊椎动物的每公斤体重约0.05mg。20.如权利要求10的方法，其中所述脊椎动物选自人、牛、绵羊、猪、狗、马、猫、山羊、水牛、骆驼科动物和家禽。21.在脊椎动物中诱发针对蠕虫的免疫应答的方法，包括给所述脊椎动物体内施用含有与一种免疫刺激性载体共价偶联的透明质酸酶的化合物。22.如权利要求21的方法，其中所述的化合物以疫苗施用于脊椎动物。23.如权利要求22的方法，其中所述免疫刺激性载体是Synpol。24.如权利要求22的方法，其中所述的透明质酸酶选自透明质酸氨基葡糖苷酶、透明质酸葡糖苷酸酶和葡糖醛酸裂解酶。25.如权利要求22的方法，其中所述的透明质酸酶分子量约为63KDa。26.如权利要求22的方法，其中所述疫苗还包括一种佐剂。27.如权利要求26的方法，其中所述佐剂实质上包括Synpol。28.如权利要求26的方法，其中所述佐剂实质上包括氢氧化铝。29.如权利要求26的方法，其中所述佐剂实质上包括修饰的胞壁酰二肽。30.透明质酸酶与一种免疫原性载体的反应产物。31.如权利要求30的产物，其中所述的免疫原性载体是Synpol。全文摘要本发明公开了保护脊椎动物免受蠕虫感染的化合物，包括与一种免疫刺激性载体共价偶联的透明质酸酶。在优选的形式中，与透明质酸酶共价偶联的免疫刺激性载体包括亚乙基哌嗪N-氧化物和N-乙酰亚乙基哌嗪鎓溴化物的共聚物(称为Synpol)。本发明还公开了保护脊椎动物免受蠕虫感染的方法，包括给脊椎动物施用治疗有效量的化合物，该化合物含有与免疫刺激性载体，优选的是Synpol共价偶联的透明质酸酶。在优选的形式中，以疫苗形式施用于脊椎动物的化合物包括与化合物混合的Synpol。本发明还包括在使透明质酸酶与所述免疫原性载体共价偶联的时间及温度条件下使透明质酸酶与免疫刺激性载体反应的方法。文档编号A61K39/00GK1130876SQ94193357公开日1996年9月11日申请日期1994年9月12日优先权日1993年9月10日发明者莱姆·V·佩丘夫,莱克希姆·M·卡哈伊托夫,莱夫斯汉I·阿托拉克哈诺夫,阿尔克地V·内克拉索夫,艾玛K·道格列娃申请人:佩丘威克斯L·L·C·