沙门氏菌菌苗的制作方法

专利名称：沙门氏菌菌苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及菌苗。
本发明是在政府支持下完成的，由国家健康研究院(NationalInstitute of Health)的No.AI 30479和No.00917款项资助。政府对本发明拥有法权。
伤寒肠热病和腹泻(例如，伤寒和霍乱)是发展中国家高发病率以及高死亡率疾病的主要病因，参见Hook等人，1980，In Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，9th Ed.，641-848，McGrawHill，New York。研制针对细菌疾病的菌苗的传统途径包括将纯化的成分或杀死的细菌进行非肠道注射。这些非肠道给药的菌苗需要比较先进的技术进行制备，并且相当昂贵，由于人们不愿进行针注射，因而经常受到患者的抵制。活的口服菌苗与非肠道菌苗相比有几方面的优点成本低，给药方便，以及制备简单。
由于没有从分子水平上弄清所要对付的疾病的致病机理，因而常常限制了活疫苗的研制。候选的活菌苗菌株需要有不可逆转的遗传变化，这种遗传变化应该影响该有机体的毒性，但不影响免疫应答的诱导。基于毒素基因缺失的、解释霍乱弧菌的毒素产生机理的研究使得制备活菌苗菌株成为可能，参见Mekalanos等人，1983，Nature 306551，Levine等人，1988，Infect.Immun.56161。
最近的研究已开始解释鼠伤寒沙门氏菌巨噬细胞生存及其毒力的分子基础，参见Miller等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA865054，引入本文作为参考。在正调节作用的调节子phoP中带有突变的鼠伤寒沙门菌菌株在对BALB/c小鼠的毒力方面已被明显地减弱。phoP调节子是由一个操纵子中存在的两个基因组成的，称为phoP和phoQ。 phoP和phoQ基因产物与细菌其他的两种成分转录调节器十分相似，它们应答环境中刺激并且控制许多其它基因的表达。在受phoP调节区调节的基因之一pagC发生的突变可使毒力欠缺。带有pagC，phoP或phoQ突变的菌株对随后受野生型伤寒沙门氏菌的攻击可提供部分保护作用。
沙门氏菌引发的临床疾病包括伤寒肠热病以及急性胃肠炎，Hook等人，1980，文献同上。在受免疫抑制的人中由沙门氏菌引发的感染更普遍，Celum等人，1987，J.Infect.Dis.156998。引起伤寒的伤寒沙门氏菌仅能感染人，参见Hook等人，1980，文献同上。由于伤寒沙门氏菌的窄范围宿主特异性，因而将感染了鼠肠炎伤寒沙门氏菌(S.enteriditis typhimurium)的鼠广泛地用作伤寒的实验室模型，Carter等人，1984.J.Exp.Med.1391189。鼠伤寒沙门氏菌感染较宽范围内的宿主，可引起人类的急性胃肠炎以及在鼠和牛中引发类似于伤寒的疾病。
沙门氏菌感染是通过口服摄食获得的。该生物体在穿过胃以后在小肠中繁殖，Hornik等人，1970，N.Eng.J.Med.283686。沙门氏菌能够侵入肠道粘膜细胞，并且伤寒沙门氏菌能够通过该粘膜障碍并通过派伊尔氏淋巴集结传播到粘膜固有层和局部淋巴结。然后在菌血症发生之后出现了宿主的网状内皮组织细胞移生。伤寒沙门氏菌能够在人网状内皮组织系统细胞内存活和复制对于其病理作用机理是必要的，Hook等人，1980，文献同上，Hornick等人，1970，文献同上，以及Carter等人，1984，文献同上。
对伤寒沙门氏菌的免疫力包括体液和细胞介导的免疫，Murphy等人，1987，J.Infect.Dis.1561005，并且可通过免疫接种获得这种免疫性，Edelman等人，1986，Rev.Inf.Dis.8324。近来，人体内的试验证明，在用部分纯化的Vi抗原进行肌内免疫接种之后，具有明显的抵抗伤寒沙门氏菌感染的效果，Lanata等人，1983，Lancet 2441。已证明在接受了活伤寒沙门氏菌菌苗的个体中出现了T细胞对伤寒沙门氏菌的杀伤作用随抗体增加而加强，这种现象表明这些抗体对于宿主产生细胞介导的免疫应答可能是必要的，参见Levine等人，1987，J.Clin.Invest.79888。细胞介导的免疫应答对于伤寒免疫性是重要的，因为不能诱导这种免疫应答的死疫苗对人体没有保护性，Collins等人，1972，Infect.Immun.41742。
本发明提供了不会引发瞬时菌血症的沙门氏菌菌苗。总的来说，本发明的特征是一种细菌细胞，优选的是一种沙门氏菌细胞，例如，一种伤寒沙门氏菌、鼠肠炎伤寒沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌细胞，通过在phoP调节子中进行第一突变以及在芳香族氨基酸合成基因中进行第二突变而使该细胞的毒力减低。本文所述的phoP调节子被定义为一种含有一个沙门氏菌毒力基因表达单位的DNA，该表达单位的特征在于有两个调节基因，phoP和pohQ，以及其表达受phoP和phoQ调节的结构基因，例如phoP调节区抑制的基因(prg)或phoP调节区激活的基因(pag)。这样的一种细菌细胞可用作菌苗。用于免疫接种一种哺乳动物使之抵抗沙门氏菌病。
沙门氏菌细胞可以是任何血清型，例如，鼠伤寒沙门氏菌，甲型副伤寒沙门氏菌，乙型副伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，S.pylorum，都柏林沙门氏菌，海德堡沙门氏菌，纽波特沙门氏菌，明尼苏达沙门氏菌，婴儿沙门氏菌，维尔肖沙门氏菌或巴拿马沙门氏菌。
第一个突变可以是在phoP/phoQ位点中的一个不可回复的无效突变。该突变优选的是至少100个核苷酸缺失；更优选的是，该突变缺失至少500个核苷酸；进一步优选的是，该突变至少缺失750个核苷酸；最优选的是，该突变缺失phoP/phoQ调节位点的第376至1322位核苷酸。
第二个突变可以是在aroA位点中一个不可回复的无效突变，或在aroC/aroD位点中的一个不可回复的无效突变，或者是在涉及芳香族氨基酸生物合成的另一个位点的不可回复的无效突变。
为了进一步降低本发明的细菌细胞的毒力，该细胞还可以在非芳香族氨基酸合成基因中含有另一突变(例如一个缺失)，例如，可以使细胞成为对于非芳香族氨基酸(例如组氨酸)的营养缺陷型。在优选实施方案中，本发明的细菌细胞是具有AroA-，His-，phoP/phoQ-基因型的伤寒沙门氏菌细胞，例如，TyLH445。
本发明还可包括其毒力受处于双成分调节系统控制下的基因的组成型表达而降低的沙门氏菌细胞。在优选实施方案中，该组成型表达是双成分调节系统中的一种成分发生突变的结果。在优选实施方案中，细菌细胞包括能减低毒力的第二个突变。
在该菌苗的其他优选的实施方案中，该双成分调节系统是phoP调节区，以及处于该双成分调节系统控制下的基因是phoP调节区调节的基因，例如，一种prg基因(例如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH)，或pag基因(例如pagC)。在优选的实施方案中，组成型表达是在被调节基因的启动子或在phoP调节区的启动子中发生改变或突变(例如缺失(优选的是一种不可回复突变))的结果，例如在phoQ或phoP基因中的突变，例如phoPc突变。
另一方面，本发明的特征在于一种包括细菌细胞的菌苗，该细菌通过phoP调节区(例如，一种prg基因，如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH)的控制使毒性基因的表达降低而被减毒。
在该菌苗的优选实施方案中，该沙门氏菌细胞包括减弱其毒力的第一个突变(例如，一种缺失)，例如，phoP或phoQ基因中的一个突变，如phoPc，或在phoP调节区调节的基因中的一个突变，和减弱其毒力的第二个突变，例如，在芳香族氨基酸合成基因(如aro基因)中的一个突变，在phoP调节区调节的基因中的一个突变，例如，prg基因(如，prgA，prgB，prgC，prgE，或prgH)中的一个突变，或pag位点(如pagC)的一个突变。
在其它优选实施方案中细菌细胞包括在phoP调节区基因内有第一个突变，在芳香族氨基酸合成基因(例如aro基因)内有第二个突变。
另一方面，本发明特征在于一种菌苗，优选的是一种包括细菌细胞的活菌苗，该细菌的毒力由于在受双成分调节系统控制下的基因中发生了突变(例如一种缺失)而得到减弱。在优选实施方案中，该细菌细胞包括在第二个基因(例如芳香族氨基酸合成基因，如aro基因)中发生了减弱其毒力的突变。
在该菌苗的其他优选实施方案中，该细菌细胞是沙门氏菌细胞，该双成分调节系统是phoP调节区，以及受其控制的基因是prg基因，例如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH或者是pag基因例如pagC基因。
在另一方面，本发明特征在于包括沙门氏菌细胞(例如伤寒沙门氏菌，鼠伤寒肠炎沙门氏菌或者猪霍乱沙门氏菌细胞)的一种菌苗，优选的是一种活菌苗，其中的细胞在其芳香族氨基酸生物合成基因(例如aro基因)中有第一个减弱毒力的突变，以及在phoP调节区基因内有第二个减弱毒力的突变(例如phoP-突变)。
在另一方面，本发明特征在于一种细菌细胞，或该细胞的基本上纯化制剂，优选的是一种沙门氏菌细胞，例如伤寒沙门氏菌，鼠伤寒肠炎沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌细胞，该细胞组成型地表达一种受双成分调节系统控制的基因，该基因包括一种减弱毒力的突变(例如一种缺失)，这种突变不会导致受双成分调节系统控制的一种基因进行组成型表达。在优选的方案中，该细菌细胞包括在双成分调节系统的一种成分中发生了突变。
在优选的方案中，该细菌细胞是沙门氏菌细胞，该细胞组成型表达一种受phoP调节区调节的基因(这种组成型表达优选是由在phoP调节区中的一种突变(优选的是一种不可回复突变如缺失)，例如在phoQ或phoP基因中一种突变例如phoPc，而引起的)。并且该细胞包含一种减低毒力的突变，优选的是一种不可回复突变(例如一种缺失)，这种突变优选的是在芳香族氨基酸合成基因例如aro基因中，或者在受phoP调节区调节的基因，例如prg基因(如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH)，或者pag基因(例如pagC)中，这种突变不会导致受phoP调节区控制的基因进行组成型表达。
在另一方面，本发明特征在于一种细菌细胞或其基本上纯化的制剂，例如一种沙门氏菌细胞，例如伤寒沙门氏菌细胞，和鼠肠炎伤寒沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌细胞，该细胞在受双成分调节系统调节的基因中有减低其毒力的突变。在优选的实施方案中，该减低毒力的突变是在受phoP调节区调节的基因，例如prg基因(如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH)，或pag基因(例如pagC)中。
在优选的实施方案中，该细菌细胞包括在芳香族氨基酸合成基因(如aro基因)，或者在phoP调节区基因(如phoP或phoQ基因)，或者在受phoP调节区调节的基因如prg基因(如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH)或pag基因(如pagC)中有第二个突变，这种突变减低毒力但并不导致受phoP调节区调节的基因进行组成型表达。
本发明特征还在于一种活的沙门氏菌细胞，或者其基本上纯化的制剂，例如一种伤寒沙门氏菌，鼠肠炎伤寒沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌细胞，在细胞的毒力基因中插入了一个编码异源蛋白质的基因或其调节因子，所述毒力基因例如是位于phoP调节区中的基因或一种受phoP调节区调节的基因，例如prg基因(如prgA，prgB，prgC，prgE，或prgH)或者pag位点(如pagC)。
在优选实施方案中，活的沙门氏菌细胞携带了减低毒力的第二个突变，例如一种aro突变，如aroA突变，如aroA-或者aroADEL407。
在优选实施方案中，编码异源蛋白质的DNA是处于一种受环境调节的启动子控制之下。在其他优选的方案中，活的沙门氏菌细胞进一步包括处于受环境调节的启动子控制之下的编码T7聚合酶的DNA序列以及一个T7转录敏感性启动子，该T7转录敏感性启动子控制异源抗原的表达。
本发明的特征还在于一种能够整合到沙门氏菌染色体中的载体，该载体包括编码异源蛋白质的第一DNA序列；编码一种标记物例如选择性标记的第二DNA序列(可任选)，例如提供对重金属具抗性的基因或者是与待转化的菌株携带的营养缺陷型突变互补的基因；以及第三种DNA序列，例如一种phoP调节子编码的基因，如prg基因如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH或pag位点如pagC，该序列编码受phoP调节区调节的基因产物，是具毒力所必须的，该第三DNA序列由于发生了突变而失活。
在其他优选方案中第一DNA序列被安置于该载体中，是为了使第三DNA序列突变失活；该载体不能在野生型沙门氏菌菌株中复制；异源蛋白质处于环境调节的启动子控制之下；并且该载体进一步包括处于受环境调节的启动子控制之下的编码T7聚合酶的DNA序列以及T7转录敏感性启动子，该T7转录敏感性启动子控制异源抗原的表达。
在另一方面，本发明包括给一种动物如一种哺乳动物如一个人免疫接种，使之抵抗由细菌例如沙门氏菌引起的疾病的方法，该方法包括施用本发明所述疫苗。
本发明还包括一种含有编码pagC基因产物的DNA的载体；一种由该载体转化的细胞；一种制备pagC基因产物的方法，该方法包括培养该转化细胞以及从细胞或培养基中纯化pagC基因产物；以及本发明还包括一种纯化的pagC基因产物制剂。
在另一方面，本发明包括检测一个样品中沙门氏菌存在的方法，该方法包括将该样品与pagC编码DNA接触，并检测该pagC编码DNA与样品中核酸的杂交反应。
本发明还包括一种含有编码prgH基因产物的DNA的载体；一种用该载体转化的细胞；一种生产prgH基因产物的方法，该方法包括培养转化细胞，并从细胞或培养基中纯化prgH基因产物；以及prgH基因产物的纯化制剂。
在另一方面，本发明包括检测一个样品中存在的沙门氏菌的方法，该方法包括将该样品与prgH编码DNA相接触，并检测prgH编码DNA与样品中核酸的杂交反应。
在另一方面，本发明特征在于使细菌毒力减低的方法，该细菌含有双成分调节系统，所述方法包括使处于双成分系统中的基因进行组成型表达。在优选实施方案中，该细菌是沙门氏菌，例如，伤寒沙门氏菌，鼠肠炎伤寒沙门氏菌，或猪霍乱沙门氏菌，以及该双成分系统是phoP调节区。
在另一方面，本发明特征在于基本上纯化的DNA，该DNA含有SEQ ID NO5中给出的序列或其片段。
本发明还包括一种基本上纯化的DNA，该DNA含有编码pagD的序列，例如SEQ ID NO5的91-354位核苷酸(pagD开放阅读框(ORF))及其简并变异体，这些简并变异体编码一种基本上具有SEQ ID NO6中给出的氨基酸序列的产物，也包括pagD ORF以及其5′非编码区(SEQ ID NO15的4-814位核苷酸)，该非编码区含有pagD启动子。位于pagC ORF和pagD ORF(SEQ ID NO15的4-814位核苷酸)之间的区域内的DNA，包含pagC启动子(SEQ ID NO15的第562-814位的核苷酸)的DNA，以及仅包含pagD启动子(SEQ ID NO15的第4-776位核苷酸)的DNA也在本发明要求的范围内。
本发明还包括基本上纯化、包括一种编码envE的序列的DNA，例如SEQ ID NO5的第1114-1650位核苷酸(envE ORF)及其简并变异体，它们编码的产物基本上具有SEQ ID NO7中给出的氨基酸序列。
本发明的另一方面特征在于一种基本上纯化的DNA，该DNA包括编码msgA的序列，例如SEQ ID NO5的第1825-2064位核苷酸(msgAORF)及其简并变异体，它们编码一种基本上具有SEQ ID NO8中给出的氨基酸序列的产物，以及带有其5′非编码区的msgA ORF，该非编码区为含有msgA启动子的SEQ ID NO5的第1510-1824位核苷酸。仅含有msgA启动子(SEQ ID NO5的第1510-1760位核苷酸)的基本上纯化的DNA也在本发明范围内。
在另一方面，本发明特征在于一种基本上纯化的DNA，该DNA包括编码envF的序列，例如SEQ ID NO5中的第2554-3294位核苷酸(envF ORF)及其简并变异体，该简并变异体编码的产物基本上具有SEQ ID NO9中给出的氨基酸序列，以及带有其5′非编码区的envFORF，该非编码区为含有envF启动子的SEQ ID NO5的第2304-2553位核苷酸。
包括SEQ ID NO10中给出的序列或其片段的基本上纯化的DNA也在本发明范围内。
本发明也包括基本上纯化的DNA，该DNA包括编码prgH的序列，例如SEQ ID NO10的第688-1866位核苷酸(prgH ORF)以及其简并变异体，该简并变异体编码的产物基本上具有SEQ ID NO11中给出的氨基酸序列，以及带有其启动子区域(SEQ ID NO10的第1-689位核苷酸)的prgH ORF。
本发明也包括基本上纯化的DNA，该DNA包括编码prgI序列，例如SEQ ID NO10的第1891-2133位核苷酸(prgI ORF)及其简并变异体，该简并变异体编码的产物基本上具有SEQ ID NO12中给出的氨基酸序列，以及带有其启动子区域(SEQ ID NO10的第1-689位核苷酸)的prgI ORF。
在另一方面，本发明特征在于基本上纯化的DNA，该DNA包括编码prgJ的序列，例如，SEQ ID NO10的第2152-2457位核苷酸(prgJ ORF)以及其简并变异体，该简并变异体编码的产物实质上具有SEQ ID NO13中给出的氨基酸序列，以及prgJ ORF和其启动子区域(SEQ ID NO10的第1-689位核苷酸)。
在另一方面，本发明特征在于基本上纯化的DNA，该DNA包括编码prgK序列，例如SEQ ID NO10的第2456-3212位核苷酸(prgKORF)以及其简并变异体，该简并变异体编码的产物实质上具有SEQID NO14中给出的氨基酸序列，以及带有其启动子区域(SEQ ID NO10第1-689位核苷酸)的prgK ORF。
本发明还包括一种细菌细胞，在该细胞的选自于下组pagD，pagE，pagF，pagG，pagH，pagI，pagJ，pagK，pagL，pagM，pagN，pagP，envE和envF的一个或多个基因中发生了突变(例如缺失)而减低了细胞的毒力。本发明还包括一种细菌细胞。在该细胞的选自于下组pagC，pagD，pagJ，pagK，pagM和msgA的一个或多个基因中发生一个突变(例如缺失)而减低了该细胞的毒力。一种细菌细胞，在该细胞的选自prgH，prgI，prgJ和prgK的一个或多个基因发生了一种突变(例如缺失)而减低了其毒力，也在本发明范围内。
本文中使用的双成分调节系统是指一种细菌调节系统，该系统应答环境信号，控制多种蛋白质的表达。术语中涉及的双成分是一种感受器，它能察觉到例如一种环境参数，并且应答该参数，通过例如促使第二种成分，即激活子的磷酸化作用而促进活化。该激活子影响处于双成分系统控制下的基因的表达。一个双成分系统可以包括例如一种组氨酸蛋白激酶以及一种磷酸化的应答调节子，如在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中看到的。在大肠杆菌，例如已经鉴定了10个激酶和11个应答调节子。它们控制趋药性，氮调节，磷酸调节，渗透调节，孢子形成，以及许多其他细胞功能，参见Stock等人，1989 Microbiol.Rev.53450-490，引入本文作为参考。一种双成分系统还控制根癌土壤杆菌植物瘤形成的毒力，Leroux等人，EMBO J 6849-856，引入本文作参考。类似的毒力调节子涉及百日咳博德特氏杆菌的毒力，Arico等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866671-6675，引入本文作参考，以及涉及弗氏志贺氏菌的毒力，参见Bernardini等人，1990，J.Bact.1726274-6281，引入本文作参考。
本文中使用的“受环境调节”是指一种表达方式，其中细胞中一种基因的表达依赖于细胞生存的环境中某些特性或成分的水平。实例包括在生物合成途径中的启动子，它根据一种特异性成分或几种特异性成分的水平而进行开启或关闭，例如，铁、温度应答性启动子，或在特定细胞区间例如在巨噬细胞或液泡中更有活力地表达的启动子。
本文中使用的疫苗(菌苗)是一种包括与合适载体相结合的能激发所需生物应答(例如一种免疫应答)的材料的制剂。该疫苗可以含有活的细菌，这种疫苗通常口服使用；或者含有杀死的细菌或或其成分，这种疫苗通常是非肠道施用。本发明疫苗中使用的细胞优选是活的，因而能移殖于被接种动物的肠内。
本文中使用的突变是指在一种有机体的DNA序列内的任何变化(与其适当的亲代菌株比较)。这些突变可以是由例如自发产生的，或者采用化学手段，施用能量例如X-射线，或其他形式诱导产生，或采用遗传工程手段，或者是交配或其他形式遗传信息交换的结果。突变包括例如碱基交换，缺失，插入，倒置，易位或重复。
如果突变结果使突变型细胞的毒力水平与其亲代菌株细胞的水平相比有降低，则这种突变减低了毒力，可由下列情况来测定a)与亲代菌株相比突变菌株的毒力显著降低(例如至少降低50％)，或者b)与亲代菌株相比，突变菌株中被确定为毒力因子的多肽的量显著降低(例如至少50％)。
本文中所说的不可回复的突变是指一种不能由单个碱基对的变化而回复的突变，例如缺失或插入突变，以及指含有一个以上损伤的突变，例如含有两个单独的点突变的突变。
本文中使用的phoP调节区是指一种双成分调节系统，该系统控制pag和prg基因的表达。该区域含有phoP位点和phoQ位点。
本文中使用的受phoP调节区调节的基因是指诸如pag和prg这样的基因。
本文中使用的pag是指受phoP调节区正调节的一种基因。
本文中使用的prg是指受phoP调节区负调节的一种基因。
本文中使用的芳香族氨基酸合成基因是指一种基因，该基因编码的酶能催化芳香族氨基酸合成中的一个步骤。aroA，aroC，以及aroD是沙门氏菌中这种基因的例子。这些基因中发生突变可以减低毒力而不会全部丧失免疫原性。
本文中使用的不正常表达是指高于或低于野生型的表达。
本文中使用的异源蛋白质是指一种在野生型中不能表达或者从不同的染色体位点进行表达的蛋白质，例如，由插入第二种基因中的一个基因编码的蛋白质是一种异源蛋白质。
本文中使用的毒力基因是一种基因，它的失活导致沙门氏菌细胞的毒力低于该基因没有被失活的类似的沙门氏菌细胞。这样的例子包括phoP，pagC，prgH基因。
在本文中使用的标记物是指基因产物，该标记的存在很易被测定，例如提供对重金属具抗性的基因产物或者在给定的条件下允许或抑制生长的基因产物。
本文中使用的纯化制剂是指一种(例如蛋白质)制剂。它是从蛋白质，脂质和其他与之相结合的材料中纯化出来的。优选的制剂至少纯化2-10倍。
本文中所用的组成型表达是指与合适对照菌株(例如亲本或野生型菌株)中相同基因的表达相比，被调制或调节的程度较低。例如，如果在第一套条件下一种基因通常被阻遏并且在第二套条件下该基因的表达被消阻遏，组成型表达是以同样水平进行的表达，例如在阻遏水平，消阻遏水平或中间水平上进行，而不管条件如何。部分组成型表达包含于所定义的组成型表达中，并且当与合适对照菌株(例如一种野生型或亲本菌株)相比时，两种表达水平之间的差异降低就出现了部分组成型表达。
一种基本上纯化的细菌细胞制剂是一种细胞制剂，其中没有所需突变基因型的污染细胞的组成低于该制剂中细胞总数的10％，优选的是低于1％并且更优选的是低于0.1％。
本发明通过在双成分调节系统和/或在受这些系统调节的基因发生突变而使细菌毒力减弱以及使含有细菌的菌苗(尤其使含有活细菌的菌苗)毒力减弱。本发明的菌苗毒力被大大地减弱但保留了免疫原性，因而它们是既安全且有效。使用本发明的载体可以快速地构建含有编码异源蛋白质(例如抗原)的DNA的菌株。编码异源蛋白质的DNA被整合到染色体上，因而是稳定的。与质粒系统不同，质粒系统是依赖于抗生素抗性或其他选择压力条件来保持其稳定性。本发明所述的沙门氏菌活细胞，其中异源蛋白的表达是受一个环境应答的启动子控制的，在不需要这样的表达时，例如培养期间，菌苗制备或贮存时并不表达异源蛋白质，这有利于细胞的存活。但是当给人或动物施用时，这种细胞表达大量的异源蛋白。这种特性是必须的，因为在沙门氏菌中许多异源蛋白质的高表达是与对该细菌的毒性相关的。仅使用编码异源蛋白质的单整合拷贝DNA也是由于在不需要表达时最小程度地表达异源蛋白质的需要。在实施方案中，当毒力基因(例如pagC基因或prgH基因)含有编码异源蛋白质的DNA的整合位点时，则该细菌的毒力被大大减低。
本文中使用的基本上纯化的DNA是指一种核酸序列、片段或区段，它是从正常状态下与该片段相邻近的序列中纯化出来的。例如在天然存在的基因组中从与该片段相邻接的序列中切除下来的DNA。该术语也适用于这样的DNA，它基本上是从天然状态下伴随该DNA的其他成份中纯化出来的，例如从细胞中天然伴随的蛋白质中纯化出来的DNA。
本发明的其他特征和优点将在下面描述的优选实施例和从权利要求中予以说明。
附图描述

图1图解表示在巨噬细胞内沙门氏菌菌株的存活。
图2pagC位点的限制性核酸内切酶位点图谱。
图3pagC区的DNA序列图谱(SEQ ID NO1)。
图4hil位点内prgH定位的图谱。箭头表示插入到hil位点内的Tn5B50新霉素启动子的定位方向以及prgH1∷TnphoA融合蛋白转录的方向。限制性核酸内切酶位点由B，BamHI；H，HindIII；X，XhoI；S，SacI；V，EcoRV表示。
图5是来自prgH基因的一个DNA序列(pIB01质粒)(SEQ ID NO3)。
图6表示将野生型(ATCC 14028)，phoP-无效突变体(CSO15)以及pag∷TnphoA突变菌株对NP-1防御的敏感性比较结果的柱形图。Y轴代表防卫素致死指数(Defensin Killing Index，DKI)，该DKI值表示与NP-1接触而杀死的细菌的计量单位。DKI的定义是对照细菌与用NP-1温育后生存的细菌之比例的对数函数[DKI＝log(没有NP-1时的CFU/有NP-1时的CFU)。每个条线代表5个单独实验的平均值和标准误差。X轴表示被突变的等位基因。对于所检测的每个pag∷TnphoA菌株，测到的平均DKI值与野生型沙门氏菌没有不同。(P＜0.05)。与之相反，phoP突变体显著不同(P＜0.0001)。
图7表示pagC染色体区的限制性核酸内切酶位点的部分物理图。在每一基因上标出了对于pagD，envE，msgA，和pagC中插入了转座子的菌株的鼠50％致死剂量(LD50)。水平箭头指明转录方向。垂直箭头表示TnphoA插入处并且中空的三角形表示MudJ插入处。染色体图谱的下方是代表插入pCAA9质粒中的DNA，该DNA插入物用TnphoA和MudJ诱变。字母的含义A，AccI；C，ClaI；E，EcoRI；H，HpaI；P，PstI；以及V，EcoRV。
图8是pagC上游的区域的DNA序列以及转译的每个ORF的DNA序列。图中指明了该区域的起始以及末尾的HpaI和ClaI位点。划有底线的为Shine-Delgarno区，在序列的上面和底下都有一条线的表示茎-环结构(潜在的不依赖于Rho的终止子)。箭头表示的是每个基因中插入的代表性的转座子的位置。在pagD和msgA启动子区中水平向的箭头标明转录起始位点，而星号标明-10至-35的序列。在括号中包含的是EnvF中共有脂类吸附位点。在SEQ ID NO5中pagD ORF开始于第91位核苷酸而结束于第354位核苷酸；而envE ORF在SEQ IDNO5中起始于第1114位核苷酸，结束于第1650位核苷酸；msgA ORF起始于SEQ ID NO5的第1825位核苷酸，结束于第2064位核苷酸；envF ORF起始于SEQ ID NO5的第2554位核苷酸而结束于第3294位核苷酸。
图9包含有prgH，prgI，prgJ和prgK基因的DNA序列。底下划线处为每个基因的起始密码子(ATG)，星号指明终止密码子。在SEQID NO10中prgH ORF起始于第688位核苷酸并于第1866位核苷酸处结束；prgI ORF起始于SEQ ID NO10的第1891位核苷酸并结束于第2133位核苷酸；prgI ORF起始于SEQ ID NO10的第2152位核苷酸，结束于第2457位核苷酸；prgK ORF起始于SEQ ID NO10的第2454位核苷酸，于第3212位核苷酸处结束。
图10是显示亲代沙门氏菌株(AroA-)以及菌苗菌株(AroA-，phoP-)的生长速率的曲线图。
图11是显示鼠菌苗菌株(鼠伤寒沙门氏菌)的防卫素敏感性的柱状图。
图12是显示用pagBLacZ记录融合构建体测定LacZ活性而计量出的phoP激活的柱状图。
图13是伤寒沙门氏菌菌苗菌株TyLH445与AroA-亲代菌株相比的防卫素敏感性的柱状图。
图14A是显示AP融合蛋白的组成型表达(610和617)以及phoP调节的(pagC和pagD)表达的相对表达情况。
图14B是对脂多糖(LPS)的免疫应答情况。
图14C显示对异源抗原模型AP的免疫应答情况。
图15是含有pagC-pagD基因间区域的DNA序列。底下划线处为pagC转译起始位点(位于相对DNA链上的ATG)(SEQ ID NO15的1-3位核苷酸)。用指向左方的箭头表示pagC转录起始处(第562位核苷酸)。pagD转录起始(ATG)处也有底下划线(SEQ ID NO15的第815-817位核苷酸)。用指向右边的箭头表示pagD转录起始处(第776位核苷酸)。
根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，下列生物物质已保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，该中心位于美国马里兰州的Rockville。
申请人的受让人，Massachusetts综合医院认为ATCC是一个可进行永久性保藏的保存机构，并且如果专利被批准，公众可得到这些菌种。一旦专利授权，对公众得到这些如此保藏的材料的所有限制即可被取消。在专利申请审查期间；任何人可根据37 CFR 1.14和35 U.S.C.§122授权的委员会的决定而得到该材料。在要求提供该保藏的质粒样品的最近请求之后至少5年内，将仔细地维持该保藏的材料使之保持存活以及不被污染，并且在任何情况下，在保存日之后至少三十年或该专利的可实施期间(以较长的期间为准)，保持该材料存活以及不被污染。申请人的受让人承认当由于保存条件的问题保藏机构不能为请求方提供该样品时，受让人有责任替换该保藏物。
phoPc菌株CS022(下文中将描述)已寄存于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)并且所给予的ATCC保藏号为55130。
含有prgH基因的pIB01质粒于1993年7月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，并且所给予的ATCC保藏号为75496。
phoP调节子的组成型表达减低了沙门氏菌的毒力以及在巨噬细胞中的存活性phoP组成型等位基因(phoPc)，pho-24，导致pag位点的消阻遏。用二乙基硫酸盐对鼠伤寒沙门氏菌LT-2，Ames以及合作者分离到的TA2367 pho-24菌株(在本节中涉及到的所有菌株，材料以及方法将在下文中描述)进行诱变，使菌株含有一个phoP位点突变，导致在丰富培养基中酸性磷酸酶进行组成型产生，Kier等人，1979，J.Bacteriol.138155，引入本文作参考。该phoP调节的酸性磷酸酶是由phoN基因(一个pag位点)编码的，Kier等人，1979，文献同上，Miller等人，1989，文献同上。为了分析该pho-24等位基因是否能提高其他pag位点的表达，确定pho-24等位基因对其他pag位点表达的影响，pho-24等位基因对其它pag位点的影响最近用需要phoP和phoQ的转录(例如pagA和pagB)和转译(例如pagC)融合蛋白的表达来表示，参见Miller等人，1989，文献同上。构建pag基因融合菌株，除pho-24等位基因以外是同基因的，并分析融合蛋白的活性。在丰富培养基中pagA∷MudJ和pagB∷Mu dJ菌株的phoPc衍生物分别产生480U和490U的β-半乳糖苷酸，比带有野生型phoP位点的融合菌株的值提高9-10倍，参见表1。
pagC∷TnphoA基因融合产生350U的AP，比CS119菌株中产生的量提高3-4倍，该融合体中除pho-24突变外是等基因的，参见Miller等人，1989，文献同上。这些结果相当于在导入pho-24等位基因的CS022菌株中酸性磷酸酶活性提高9倍。因此，对于pag基因表达的这些分析结果证明，pho-24突变体的突变引起pag位点而不是phoN的组成型表达。
表1细菌菌株和特性菌株 基因型酶活性(U)a参考或来源10428 野生型 180(A) ATcc；Miller etal.，1989，见上文TA2367pho-241,925(A) Kier etal.，1974，见上文CS003ΔphoPΔpurB＜10(A) Miller etal.，1989，见上文CS022pho-24 1,750(A) 本发明CS023pho-24 phoN2 25(A) 本发明ZXX∷6251Tn10d-CamCS012pagA1∷MU dJ 45(B) Miller etal.，1989，见上文CS013pagB1∷MU dJ 120(B) Miller etal.，1989，见上文CS119pagC1∷TnohoA phoN2 85(C) Miller etal.，1989，见上文zxx∷6251Tn10d-Camsc024pagA1∷Mu dJ pho-24 450(B) 本发明sc025pagB1∷Mu dJ pho-24 980(B) 本发明sc026pagC1∷TnphoApho-24phoN2 385(B) 本发明zxx∷6251Tn10d-CamCS015phoP102∷Tn10d-Cam＜10(A) Miller etal.，1989，见上文TT13208 phoP105∷Tn10d＜10(A) --baA.酸性磷酸酶；B.β-半乳糖苷酶；C.碱性磷酸酶(AP)。b由Ning Zhu和John Roth赠在phoPc突变菌株中被阻遏以及被激活的蛋白质种类的鉴定分析CS022菌株的全细胞蛋白质，以估测潜在地受phoP调节子调节的蛋白质种类的数目。显然，采用单向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析由phoPc表现型菌株产生的蛋白质的结果表明，一些蛋白质种类的表达降低，而许多被推定的pag基因产物由pho-24突变完全诱导。在phoPc菌株中降低的蛋白质可能代表受phoP调节子阻遏的基因产物。对于受phoP阻遏的基因，即编码由pho-24等位基因降低的蛋白质的基因被命名为prg位点。将野生型，phoP-以及phoPc突变菌株的蛋白质进行比较，结果显示，在37℃ LB培养基中的生长条件代表阻遏pag基因产物的条件，但对于prg基因产物是消阻遏条件。
为了估测潜在地受phoP调节的基因产物的总数，采用双向凝胶电泳方法分析在LB上生长的野生型和phoPc突变型菌株的总细胞蛋白质。至少有40种蛋白的表达在应答pho-24突变中经历了巨大波动。
phoPc菌株的毒力缺失值得注意的是，有单个pho-24突变的菌株对于鼠的毒力被明显降低(表2)。采用腹膜(i.p.)途径攻击方法杀死50％的BALB/C鼠(LD50)需要的phoPc细菌的数目(2×105)接近于使用phoP-细菌所需数目(6×105)，Miller等人，1989，文献同上。在丰富和基本培养基上，phoPc菌株的生长情况相当于野生型细菌的生长。还检测了phoPc突变体中脂多糖的改变情况，这种改变可解释所观察到的毒力缺失。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳和染色方法测定结果，CS022菌株对噬菌体P22有正常的敏感性，对针对O抗原的抗体发生正常的B级反应，并且其脂多糖分布情况相同于亲代菌株的分布。
表2phoPc和phoP-沙门氏菌菌株的毒性和保护效率接种剂量 起始存活 用下列剂量的野生型攻击后存活数/总数数/总数5×1075×1055×1045×103PhoPc细菌15 13/13 5/5 4/550 4/4 4/41.5×10211/11 4/4 3/35×10216/16/41.5×1035/53/3 2/25×1034/4 4/41.5×1045/53/3 2/25×10419/234/41.5×1055/53/3 2/25×1051/4 1/15×1060/63×109(*) 5/5 5/53×1010(*) 5/5 5/51.5×1011(*)5/5 5/5PhoP-细菌6×10336/36 0/12 0/12 0/126×10436/36 0/12 0/12 3/126×10519/36 0/6 0/6 4/75×1010(*) 7/7 3/7(*)口服施用的细菌。在所有其他实验中，通过i.p.攻击施用微生物。
由于可用化学诱变方法构建TA2367 pho-24菌株，并且可能有另一相连锁突变使其毒性缺失，因而分离出phoPc的回复体测定pho-24等位基因是否对所观察到的毒力减弱起作用。在从用CS022菌株感染的鼠的肝脏中回收到的细菌中分离可根据丰富培养基中酸性磷酸酶正常水平而鉴定出的表现型phoPc回复体。发现命名为CS122-CS128的六个单独的表现型回复体是有完全毒性(对于BALB/c小鼠其LD50低于20个细菌)。通过与噬菌体P22共转导，对所有六个被检测毒性的回复体制作其对回复变异表现型起作用的位点的图谱，发现具有与phoP位点连锁的特征(与purB的连锁大于90％)。这些资料表明，这些回复变异突变体不是基因外的抑制物，而是基因内的抑制物，或是pho-24突变的真正回复体。因此，phoPc突变体的毒力缺失可能是phoP位点中单个可回复突变引起的，而不是在诱变期间所得到的第二个不相关突变引起的。
phoPc表现型回复的频率调查在鼠体内phoP突变的回复频率，以评估回复突变是否降低了该菌株的LD50。通过腹膜内注射，给八个动物中的每一个施用106，101，102个攻击细菌，以检测CS022菌株是否存在回复体。在第7天，接受了106个phoPc细菌的三个动物死亡。在那天，收集所有动物的肝和脾，并在盐水中匀质化。在经过适当的稀释之后，将该组织的10％置于含有生色的磷酸酶底物XP的LB平板上培养。与phoPc细菌相比，回复体的菌落是较淡的蓝色，并采用定量的酸性磷酸酶检测法进行验证。分别从三个不同的攻击剂量的动物中，从每个器官回收到大约107、105和103个微生物。仅在最高剂量时鉴定到回复体，并在死亡时每个器官含有0.5-1％或105个这种细菌。看来回复体似乎能在这些含有巨噬细胞的器官中更有效地竞争性生长，因为在巨噬细胞内CS022菌株不能存活(见下文)。但是，如果在攻击剂量中使用低于105的细菌则不能鉴定出回复体，表明回复频率可能是大约10-5。当以同样的菌落表现型进行评判时，对于在LB上生长的CS022细菌phoPc表现型的回复频率实际上是6×10-4。从接近死亡的动物中回收的回复体的百分数表明，对于选择phoPc表现型的回复体，体内具有选择压力，并且暗示，对于带有不可回复的phoPc突变的菌株，所观察到的毒力缺失从定量角度分析可能更高。
在巨噬细胞内phoPc菌株不能存活由于在巨噬细胞内生存对沙门氏菌的毒力的重要性(参见Fields等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835189，引入本文作参考)，我们检测了phoPc细菌的这一性能。与野生型细菌相比，CS022菌株不能在巨噬细胞中生长和维持(图1)。在图1中，将培养的巨噬细胞中CS022(phoPc)菌株的存活性(用三角形表示)与野生型鼠伤寒沙门氏菌ATCC 10428(用圆圈表示)的存活性进行比较。所显示的实验是一个代表性实例。两菌株在4和24小时时的差异是显著的(P＜0.05)。从定性角度看，phoP-细菌似乎具有phoPc细菌相类似的巨噬细胞生存欠缺情况，但是在一起完成的实验中看出其存活力比后者强2-3倍。在富含巨噬细胞的鼠器官中回复到phoPc表现型的细菌的回收率增加与phoPc突变体的体外巨噬细胞存活率降低相一致。
将phoPc菌株用作活疫苗前面曾经报道过phoP-菌株可用作保护鼠抵抗伤寒的活疫苗，Miller等人，1989，文献同上。将用作减毒活疫苗的phoPc在鼠中的免疫原性与phoP-进行比较。对在前面已接种了分成等级的剂量的两种活菌苗菌株的鼠，用分成等级的攻击剂量的野生型ATCC 10428菌株攻击，同时测定生存情况而完成上述比较步骤。两种活菌苗是CS015 phoP∷Tn10d-Cam和CS022 pho-24，并以盐水作为对照。获得的结果(表2)显示下列结论(i)小剂量腹膜内注射的phoPc菌株(例如15个细菌)能有效地保护小鼠抵抗大致5×105个细菌的攻击剂量(代表腹膜内注射大于104的半致死量的攻击剂量)，(ii)通过口服施用大剂量的phoPc细菌能完全保护小鼠抵抗含有5×107野生型细菌的口服攻击剂量(超过200个口服野生型LD50)以及(iii)比较起来，大剂量的phoP-细菌(5×105)不能提供同样的保护作用。phoPc突变在体内发生回复使将这些菌株用作菌苗的分析变得复杂，因为CS022菌株的回复体(即野生型细胞)增加了免疫原性。但是，通过对从接受了104或者更少细菌的那些鼠中获得的10％的脾和肝脏组织进行检查，我们不能鉴定出回复体。
菌株、材料和方法在上面描述的研究phoP调节子的工作中使用了下列菌株，材料和方法。
保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的14028菌株，是一种光滑型的有毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株，它是所有毒力研究的亲本菌株。TT13208由Nang Zhu和John Roth赠送。TA2367菌株是Gigi St-ortz和Bruce Ames慷慨赠送的礼物，Kier等人，1979，文献同上。细菌噬菌体P22HT int用于转导杂交中，以构建除phoP位点突变以外为同基因的菌株，Davis等人，1980，Advanced Bacterial Gen-etics，p.78，87。Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spr-ing Harbor，NY，引入本文作为参考。以Luria液体培养基作为丰富培养基，并且基本培养基是M9，Davis等人，1980，见上文。将生色的磷酸酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(XP)用于定量地估测固体培养基中酸和AP的产生。
在利用菌株CS003ΔphoPΔpurB进行的P22转导杂交中，以TA2367菌株作为purB基因的供体构建带有pho-24突变的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 10428的衍生物，Miller等人，1989，文献同上。然后在基本培养基上选择出能够生长的菌落。将能在丰富培养基上合成1750U的酸性磷酸酶(比野生型在丰富培养基上生产量提高9倍)的命名为CS022的转导子(表现型phoPc)用于进一步研究。
通过噬菌体P22转导杂交法，并利用TnphoA-或Mu dJ-编码的卡那霉素抗性进行选择，构建含有pag基因融合的CS022菌株以及CS023 pho-24 phoN2 ZXX∷6251 Tn10d-Cam衍生物以及CS022的酸性磷酸酶阴性的衍生物。通过验证在phoP105∷Tn10d或phoP102∷Tn10d-Cam等位基位导入时融合蛋白活性适当的损失，对菌株的完整pag基因融合进行检查。
如前所述，对酸性磷酸酶，AP和β-半乳糖苷酶进行分析，参见Miller等人，1989，见上文，并且按照Miller定义的单位来表示，1972，Experiments in molecular genetics，P.352-355，Coldspring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，引入本文作为参考。
在鼠毒力和免疫接种研究中，用普通盐水将于Luria液体培养基中过夜生长的细菌进行洗涤并用该盐水进行稀释。在所有活疫苗攻击研究中都使用CS022的野生型亲代菌株(ATCC 10428)。当以腹膜内注射(i.p.)途径施用时，对于首次做实验的成年BALB/c鼠该菌株的50％致死剂量(LD50)低于20个细菌，当溶于NaHCO3中口服途径施用时50％致死剂量为5×104。小鼠是从Charles River Breeding Labo-ratories，Inc.(Wilmington，Mass.)购买的，并且在小鼠生长至5-6周龄时开始第一次攻击。所有腹膜注射接种都是按照前面描述方法完成的，参见Miller等人，1989，见上文。口服攻击试验是用生长于LB液体培养基的并经过离心而浓缩的细菌来完成的。将细菌重悬于0.1M NaHCO3中以便中和胃酸，并且将动物用乙醚麻醉后以0.5ml药丸形式给动物喂服。进行菌落计数以准确地估算出施用的细菌的数目。所有攻击试验是在腹膜接种后1个月以及口服攻击后6周进行。攻击接种可采用类似于免疫接种同样的途径。按照Massachus-etts中心医院和哈佛医科学校动物管理委员会的规定饲养这些动物。
蛋白质电泳按如下方法完成单向蛋白质凝胶电泳是按Laemm-li，1970的方法(Nature 227680，引入本文作为参考)，对Luria液体培养基中过夜生长的固定相细胞的全细胞蛋白质提取物进行的。将凝胶固定后用溶于10％乙酸-10％甲醇中的考马斯亮蓝R250进行染色。双向蛋白质凝胶电泳是采用O′Farrell 1975的方法(J.Biol.Chem.2504007，引入本文作为参考)，用同样的全细胞提取物进行的。用1.5％pH为3.5-10的ampholine(LKB Instruments，Balti-more，Md.)电泳9,600Vh(700V进行13小时45分钟)完成等电聚焦。根据一个表面pH电极(BioRad Laboratories，Richmond，Calif.)测定以及在相邻管中电泳的带色的乙酰化的细胞色素pI标记物(Calbio-chem-Behring，La Jolla，Calif.)可测出最终的管凝胶pH梯度从pH4.1延伸到pH8.1。按照Merril等人，1984，Methods Enzymol.104441(引入本文作为参考)的方法对凝胶法进行银染。
在巨噬细胞存活性检测中，试验是按前面描述，Miller等人，1989，见上文，按照从Lissner等人，1983，J.Immunol.1313006(引入本文作为参考)方法修改，Buchmeier等人，1989，Infect.Immun.571(引入本文作为参考)的方法进行的。将静止期细胞在普通鼠血清中调理30分钟，然后与从BALB/c小鼠收集到的骨髓衍生的巨噬细胞培养物相接触。在感染之后一小时，加入硫酸庆大霉素(8μg/ml)以便杀死细胞外细菌。在所有时间点都有三个重复，并将实验重复三次。
phoPc突变体菌株是更为有效的活疫苗当用作抵抗鼠伤寒的活疫苗时，鼠伤寒沙门氏菌phoPc突变体是十分有效的并且优于phoP-的细菌。采用腹膜内施用途径只要少至15个phoPc细菌就可保护小鼠抵抗105LD50(50％致死剂量)的野生型细菌(表3)。这表明，pag基因产物对于抵抗鼠伤寒的保护免疫作用是重要的抗原。初步实验结果已经证实，由慢性伤寒载体血清识别的抗原可识别伤寒沙门氏菌的受phoP调节的基因产物。如果仅在宿主中表达保护性抗原，那么仅在丰富培养基中生长的死疫苗不能诱导抵抗这些蛋白质的免疫应答。
对于在phoP调节子中含有不同突变的不同的鼠伤寒沙门氏菌死疫苗制剂的使用情况进行评估。如在表3中看到的，没有一种死细胞制剂作为疫苗(即使含有phoP-和phoPc细菌的混合物的制剂)能象活细菌一样有效。这表明，活疫苗有其他特性，即免疫原性提高或重要的受非phoP调节的抗原不在这些制剂中。被研究的在动物中仅在最低攻击剂量时才在用phoPc细菌免疫的动物中观察到保护作用。这进一步表明，受phoP激活的基因是重要的保护性抗原。
表3带有phoP调节子突变的沙门氏菌用作死疫苗接种菌株 表现型 野生型细菌的攻击剂量6×1036×105未接种 (3) (5)ATCC10428 野生型 (8) (9)CS015 phoP-(10) (13)CS022 phoPc2/7(*) (14)CS022/CS015phoP-/phoPc(8) (13)CS0l5＝phoP102∷Tn10d-Cam CS022＝pho-24用5×108个福尔马林杀死的细菌给BALB/c鼠接种两次，间隔7天。在第二次接种之后三星期，用野生型细菌按标明的两种剂量攻击小鼠。括号内数字表明在攻击之后没有存活者以及至死之时的平均天数。
(*)存活者与受攻击数的比例。
phoPc表明由phoP激活的基因进行未受调节的组成型表达，以及phoP阻遏的基因没有表达。
phoP-表明受phoP激活的基因的没有表达以及受phoP阻遏的基因的表达。
aroA phoP调节子双重突变菌株Stocker，Levine以及其同事们最近的研究目标已集中于将芳香族氨基酸和嘌呤途径中的营养缺陷型突变的菌株用作活疫苗，Hoseith等人，1981，Nature 291238，引入本文作为参考，Sto-cker，1988，Vaccine 6141，引入本文作为参考，以及Levine等人，1987，J.Clin.Invest.79888，引入本文作为参考。已发现嘌呤突变可大大减低免疫原性，可能是因为哺乳动物宿主内细菌不能得到嘌呤，Sigwart等人，1989，Infect.Immun.571858，引入本文作为参考。由于通过与来自于环境中细菌的野生型拷贝进行同源性重组或者通过在宿主中获得所需的代谢物，营养缺陷突变可以得到弥补，因此，对于活疫苗而言含有在不同毒性机理中的第二种减毒突变(即不是仅在相同代谢途径中的第二个突变)似乎是可取的。此外，在鼠中aroA突变体有一些残余毒力。对带有aroA突变和phoP调节子突变的不同菌株进行调查，观察其毒力的减弱以及免疫原性。表4证明，phoP-或phoPc突变进一步使鼠伤寒沙门氏菌aroA突变体的毒力至少减低100倍，并且至少在高水平接种细菌时保留免疫原性。具有pagC-和phoPc表现型的菌株比单独哪一种突变都更进一步减低其毒力。因此，phoP调节子突变可以提高aroA活疫苗制剂的安全性。
表4A由phoP调节子突变对aroA突变体带来的额外减毒作用不同数目的沙门氏菌突变细菌的幸存者(*)菌株表现型 1061071081091010(**)CS004aroA-6/61/60/60/66/6SL3261 aroAdel His-6/61/60/60/66/6CS322aroA- PhoPc6/66/66/61/66/6CS323Sl3261 PhoPc6/66/66/62/66/6CS315aroA- PhoP-6/66/66/62/66/6CS316SL3261 PhoP-6/66/66/61/66/6CS026pagC-Phopc6/64/60/60/66/6
表4B带有aroA/phoP调节子突变的沙门氏菌的保护效率野生型细菌的攻击剂量的幸存者(*)菌株 表现型 接种物 5×1055×107CS004aroA-1064/4 5/5SL3261 aroAdel His-1064/4 4/5CS322aroA-PhoPc1065/5CS323SL3261 PhoPc1065/5CS322aroA-PhoPc1075/5CS323SL3261 PhoPc1075/5CS322aroA-PhoPc1085/5CS323SL3261 PhoPc1085/5CS315aroA-PhoP-5/5CS316SI3261 PhoP-1085/5(*)幸存者与被攻击的鼠数目的比例。(**)表示该实验为口服接种，所有其他实验是腹膜接种。CS004＝aroA554∷rn10.SL3261＝aroADEL407 hisG46.CS322＝aroA554∷Tn10 pho-24.CS323＝aroADEL407 pho-24.CS315＝aroA554∷Tn10 phoP102∷Tn10d-Cam.CS316＝aroADEL407 hisG46 phoP102∷Tn10d-Cam.CS026＝pagC1∷TnphoA pho-24 phoN2 zxx∷6251TN10d-Cam.
伤寒沙门氏菌phoP调节子突变在伤寒沙门氏菌DNA杂交研究中phoP调节子至少是部分保守的，P22噬菌体转导杂交也证明，在伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌之间，phoP、phoQ以及pagC基因似乎是高度保守的。使伤寒沙门氏菌中的这些基因发生突变。
沙门氏菌活疫苗作为异源抗原的释放系统在疫苗释放系统中使用的载体是由Miller等人，1988，J.Bact.1702575描述的pJM703.1的衍生物(引入本文作参考)。该载体是一种在pir基因中带有缺失的R6K衍生物。该R6K衍生物需要pir基因的蛋白质产物才可复制。含有以λ噬菌体前噬菌体形式存在的pir基因的大肠杆菌能支持该载体的复制。不含有pir基因的细胞不能支持该载体以质粒形式复制。该载体还含有RP4的mob区域，它可使从例如SM10λpir的大肠杆菌菌株通过交配转移到其他革兰氏阴性细菌中，它可提供反式转移功能。
pagC区示于图2和3中。图2显示pagC座位的限制性内切酶位点。粗线条表示pagC编码序列。倒置的三角形表示TnphoA插入。箭头表示转录方向，是从左到右。编号表示相对于推定的pagC转译起始密码子的核酸内切酶位点的位置，以碱基对编号表示，编号为正数表示起始密码子下游位置，编号为负数表示起始密码子上游位置。A是AccI，B是BglI，C是ClaI，D是DraI，E是EcoRI，H是HpaI，N是NruI，P是PstI，S是SspI，T是StuI，U是PvuII，V是EcoRV，以及II是BglII。图3表示pagC∷TnphoA的DNA序列(Sequence I.D.No.1)及其转译。底下划粗线的序列表示一种潜在的核糖体结合位点。底下划单条或双条细线指明该序列是用于构建与这些核苷酸相互补的引物，用于RNA分析方法中的引物延伸。星号表示估计的转录起始点。箭头表示转录方向。划框的序列表示有聚合酶结合和识别作用的区域。倒置的三角形表示经过测序的TnphoA插入连接位点。箭头表示单一序列切割的潜在位点。
将含有pagC基因的3Kb DNA(从PstI限制性内切酶位点，即从pagC转译起始位点5′方向1500个核苷酸处，至EcoRI限制性核酸内切酶位点，即pagC转录终止位点下游1585核苷酸处)插入到上面讨论的pJM703.1衍生物中。从ClaI限制性核酸内切酶位点的pagC序列被缺失(490个核苷酸)并且用一个合成的寡核苷酸多接头(polylink-er)替代，该多接头创造了独特的限制性核酸内切酶位点。可将编码一个或多个异源蛋白质(例如抗原)的DNA插入该位点。这样制造了一种载体，该载体可允许多个外源基因插入到pagC周围的DNA中。
采用交配或任何其他释放系统(例如热休克，噬菌体转导或电穿孔方法)可将该载体移入沙门氏菌中。由于该载体不能复制，因此只有将pagC基因两侧的同源DNA进行位点特异性重组而将该载体插入到沙门氏菌中。这将破坏天然pagC座位并使之失活，并用该载体上携带的破碎的pagC DNA替代。
根据标记物交换，以及如果插入到pagC座位中的外源DNA是供了生长优势可在选择性培养基上培养而鉴定出这种重组的发生。用于选择的抗生素抗性基因的插入很少是令人满意的，因为这会使天然细菌群体中抗生素抗性增加。可以用提供对除抗生素以外的物质(例如重金属或砷)具抗性的基因(对于汞抗性，参见Nucifora等人，1989，J.Bact.1714241-4247，引入本文作参考)识别转化体。另一种可选用方法，可用沙门氏菌受体菌株(该菌株携带了代谢途径中的营养缺陷型突变)以及携带互补于营养缺陷型突变的DNA的一种载体进行选择。许多沙门氏菌活菌苗原型在组氨酸或嘌呤途径中含有突变，因而可用这些代谢营养缺陷体的互补性来选择整合体。(嘌呤突变在人体中使用时已显示出毒性过低)。根据氨苄青霉素抗性(携带于质粒主链上)的丧失或通过印迹杂交分析可进一步证实标记物的交换。
通过与代谢营养缺陷型菌苗菌株的互补性，可以将用于选择的基因进行克隆。具体的实例包括克隆编码purB和phoP的DNA，它是通过与缺失了这些基因功能的菌株互补而进行的。根据本领域内已知的方法，在pLAFR粘粒载体(Frindberg等人，1984，Anal.Biochem.137266-267，引入本文作参考)中构建沙门氏菌基因文库。pLAFR粘粒是广谱宿主质粒，该质粒可从大肠杆菌转移到沙门氏菌。可将这样的菌株的整个库移到沙门氏菌菌苗菌株中，并通过营养缺陷型的互补进行选择(例如在没有腺嘌呤的培养基中的purB生长)。然后识别出能够与这种缺陷体互补的DNA，并将它克隆到抗原释放载体中。
如上所讨论，可将异源基因插入到多接头(polylinker)中，该多接头被插入到载体的pagC序列中。该异源基因可处于受环境调节的许多启动子系统的任何一种控制之下，该启动子系统可在宿主中表达而在实验室中关闭。由于外源基因的表达，尤其是膜蛋白(它为最重要抗原)常常对细菌有毒，因而使用受环境调节的启动子是非常令人满意的，这些启动子可在哺乳动物组织中高水平地表达，但它可在实验室中生长而不表达异源抗原。另外，通过将细菌的代谢燃料转换成合成的异源蛋白质，在宿主组织中高水平地表达抗原可导致该细菌的减毒作用增加。如果外来抗原特异地在吞噬细胞宿主中表达，则可以增加对这些蛋白质的免疫应答，因为是这些细胞来进行抗原加工的。
可能有用的启动子系统包括那些当一种特定的营养成分不能被哺乳动物宿主中的细菌获得时而受营养状况调节的启动子系统。在宿主内例如嘌呤和铁是不能得到的，Sigwart等人，1989，Infect.Immun.，571858以及Finklestein等人，1983，Rev.Infect.Dis.5S759。因而受铁调节的启动子，例如aerobactin基因启动子，以及在嘌呤途径中生物合成基因的启动子都是优秀的候选者，以检测其能否作为在高浓度的这些营养物中生长时可被关闭的启动子。其他可用的受环境调节的沙门氏菌启动子包括控制为特定地在巨噬细胞中表达的蛋白质(例如Dnak和GroEL蛋白质，在高温下生长时它们的表达提高)，以及一些受phoP激活的基因产物而编码的基因的启动子，参见Buchmeier等人，1990，Science 248730，引入本文作为参考。因此，例如pagC 5′控制序列这样的启动子，以及被详细描述的控制热休克基因的启动子，例如GroEL和DnaK，被期望在巨噬细胞中被特异地激活。巨噬细胞是抗原加工的场所，热休克基因在巨噬细胞中的表达以及热休克基因在自然界中广泛的保守性可以解释这些蛋白质的免疫优势。一种共有的热休克启动子序列是已知的，并且可用于载体中(Cowling等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 822679，引入本文作为参考)。
载体可以包括用于表达异源蛋白的受环境调节的T7聚合酶扩增系统。例如，处于铁调节的启动子控制下的T7聚合酶基因(由StanTabor和Charles Richardson克隆，参见Current Protocols inMolecular Biology ed.Ausubel等人，1989(等3.5.1.2页)JohnWiley and Sons，引入本文作参考)，可包含于上述讨论的载体中。我们已经将大肠杆菌的aerobactin基因启动子，序列为CATTTCTCATTGATAATGAGAATCATTATTGACATAATTGTTATTATTTTACG(SEQ ID NO2)(Delorenzo等人，J.Bact.1692624，引入本文作参考)插入到T7聚合酶基因的前面，并且证明其基因产物受铁调节。这种载体将还包括受T7聚合酶启动子控制的一个或多个异源抗原。从合成的寡核苷酸T7启动子和纯化的T7在体外可以合成RNA是公知的。当细菌遇到低铁环境时，T7聚合酶被合成，这有助于T7启动子控制的基因进行高水平的表达。
鼠伤寒沙门氏菌中的pagC融合蛋白在巨噬细胞内处于phoP调节的启动子控制下的异源抗原的表达可用作使沙门氏菌减毒并且增强外源抗原的免疫性的有效方法。如上所讨论的，在加工抗原的细胞即巨噬细胞中诱导出了pagC的表达。因此，在巨噬细胞中也可能诱导处于pagC启动子控制下的异源抗原的表达。
为评估对处于诱导型pag启动子控制下表达的异源抗原的免疫应答，用pagC或pagD调节序列控制下表达抗原AP的细菌接种小鼠。在这些细菌中从编码AP的单拷贝染色体基因产生了pag-AP融合蛋白。该细菌可用两种方法产生TnphoA诱变，以及利用自杀载体的遗传工程技术，两种方法在上文都有描述。
作为对照，用处于组成型启动子控制下表达AP融合蛋白的细菌接种小鼠。该组成型启动子完全不依赖于phoP调节子中基因的调节作用。用上文描述的方法构建了这样两株细菌，菌株610和菌株617。在610菌株中AP表达量是中等的，而在617菌株中AP的表达量是高的(参见图14C)。
将这些菌株从腹膜注射到BABL/c小鼠中。接种三个星期后获取血清样本。将正常鼠血清用作对照。利用标准的ELISA分析方法检测血清中是否存在AP特异性抗体。还利用鼠伤寒沙门氏菌LPS检测血清中的LPS-特异性抗体。在所有测试的鼠血清中都检测到了针对LPS的抗体，但仅在其中以pag融合蛋白形式从单个染色体基因拷贝中表达AP的那些菌株中产生了针对模式异源抗原(AP)的免疫应答(参见图14A和图14B)。
尽管在617菌株中AP融合蛋白的组成型表达约高出10倍以上，但在用617菌株接种后对该抗体仅产生最小量的免疫应答。相反，在用能表达pag-AP融合蛋白的菌株接种的小鼠中观察到强应答。这些资料表明，在体内导致巨噬细胞内诱导出蛋白质表达的phoP调节作用提高了处于pag启动子控制下表达的异源抗原的免疫性。在巨噬细胞内或其他提供抗原的细胞内，指导一种蛋白质进行细胞特异性、可诱导性表达的任何启动子，例如本文描述的pag，可用于提高沙门氏菌中表达的抗原的免疫原性。
pagC基因和pagC基因产物菌株，材料和方法在pagC克隆以及该基因和基因产物的分析方法中，使用了下文描述的菌株，材料和方法。
丰富培养基是Luria液体培养基(LB)，基本培养基是M9，Davis等人，1980，文献同上，构建鼠伤寒沙门氏菌株CS119 pagC1∷TnphoA phoN2 2XX∷6251 Tn10d-Cam的方法在前文已经描述，参见Miller等人，1989，文献同上。美国典型培养物保藏中心(ATCC)的鼠伤寒沙门氏菌菌株10428包括除phoP105∷Tn10d以外与CS119为等基因的CS018，参见Miller等人，1989，文献同上，还包括CS022pho-24，Miller等人，1990，J.Bacteriol.1722485-2490，引入本文作参考，以及CS015 phoP102∷Tn10d-cam，Miller等人，1989，文献同上。用于制备染色体DNA的其他野生型菌株包括鼠伤寒沙门氏菌LT2(ATCC 15277)，鼠伤寒沙门氏菌Q1和S.drypool(Dr.J.Peterson U.Texas Medical Branch，Galveston)，以及伤寒沙门氏菌Ty2(Dr.Caroline Hardegree，Food and Drug Administrati-on)。利用含有pRK 2013的大肠杆菌MM294将pLAFR粘粒从大肠杆菌转移到鼠伤寒沙门氏菌，Friedman等人，1982，Gene 18289-296，引入本文作参考。利用生色的磷酸酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(XP)在固体培养基上筛选AP活性物。AP的检测是按照前面描述的方法进行的，Brickman等人，1975，J.Mol.Biol.96307-316，引入本文作参考，并且以Miller定义的单位进行报道，Miller，1972，文献同上，pp.352-355。
根据Laemmli的方法完成单向蛋白质凝胶电泳，参见Laemmli，1970，Nature，227680-685，引入本文作参考，按照前面描述，利用针对AP的抗体进行印迹杂交试验，Peterson等人，1988，Inf-ect.Immun.562822-2829，引入本文作参考。通过在SDS-pagE样品缓冲液中将细胞煮沸，而从37℃，LB中通气培养的饱和培养物中制备全细胞蛋白质提取物，Laemmli，1970，文献同上。根据O′Fa-rrell的方法进行双向凝胶电泳，O′Farrell，1975，J.Biol.Chem.2504007，引入本文作参考。通过银染观察10％聚丙烯酰胺凝胶板上的蛋白质，Merril等人，1984，Methods in Enzymology，104441，引入本文作参考。
根据Mekalanos的方法制备染色体DNA，参见Mekalanos，1983，Cell，35253-263，引入本文作参考。根据Southern，1975，J.Mol.Biol.98503-517(引入本文作参考)的方法，将在琼脂糖凝胶上进行大小分级分离的DNA转移至硝酸纤维素膜上。根据随机引物方法，Frinberg等人，1984，文献同上，将用于Southern杂交分析的DNA探针进行放射性标记。采用CaCl2和热休克方法，Mekalanos，1983，文献同上，或者是利用由制造商推荐的基因脉冲(Genepuls-er)设备(Biorad，Richmond，Ca.)进行电击穿(Dower等人，1988，Nucl.Acids Res.166127-6145，引入本文作参考)，将质粒DNA转移到大肠杆菌和沙门氏菌中。采用Sanger等人，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467(引入本文作为参考)的双脱氧链终止方法，并按照SEQUENASER(U.S.Biochemical，Cleveland，Ohio)的改良方法，完成对DNA的测序。用Applied BiosystemsMachine合成寡核苷酸，并将它用作为测序反应以及RNA的引物延伸反应的引物。将特异地针对TnphoA的两个末端的特定引物，其中一个引物与AP编码序列相一致，另一个与右边IS 50序列相一致，用于将转座子插入连接处进行测序。
按如下方法在pLAFR3中构建鼠伤寒沙门氏菌粘粒基因库，并筛选含有野生型pagC DNA的克隆。利用限制性核酸内切酶Sau3A将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 10428菌株的DNA进行部分消化，然后在10-40％蔗糖密度梯度上进行选择。利用T4 DNA连接酶将大小为20-30 Kb的染色体DNA连接到粘粒载体pLAFR3上，pLAFR3是pLAFR1的衍生物，Friedman等人，1982，Gene 18289-296，引入本文作为参考，它是用限制性核酸内切酶BamHI进行了消化。利用从Stratagene，La.Jolla，Ca.购买的提取物将粘粒DNA进行包装并转染到大肠杆菌DH5-α菌株中。采用印迹杂交方法筛选菌落。
按如下方法对通过体外转录/转译检测而从克隆的DNA产生的蛋白质进行分析。这些检测是用无细胞提取物来完成的(Amersham，Arlington Heights，Illinois)，并且使用制造商描述的条件来完成。最后生成的放射性标记蛋白质是采用SDS-pagE进行分析的。
采用热苯酚方法从早对数生长期以及静止期的沙门氏菌培养物中纯化RNA，Case等人，1988，Gene 72219-236，引入本文作参考，并在琼脂糖-甲醛凝胶上电泳以进行印迹杂交分析，Thomas，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 775201，引入本文作参考。按前面描述的方法，Miller等人，1986，Nuc.Acids.Res.147341-7360，引入本文作参考，利用AMV逆转录酶(Promega，Madison，Wisconsin)以及与pagC座位的第335-350位核苷酸和550-565位核苷酸互补的合成的寡核苷酸引物进行RNA的引物延伸分析。
在鼠伤寒沙门氏菌pagC突变体中缺失的18KDa蛋白质的鉴定采用双向蛋白质电泳分析pagC突变菌株CS119，以检测由于TnphoA插入而导致缺失的蛋白质种类。当进行这一分析时，在除插入的转座子外是等基因的菌株中仅观察到约18KD并且pI-8.0的单一缺失蛋白质。在用带有phoP和phoQ突变的沙门氏菌进行类似分析时，也发现该18KDa种类的缺失。尽管双向蛋白质凝胶分析不能检测出CS119菌株中表达的蛋白质的细微变化，但这意味着由于pagCTnphoA插入，导致了一个主要蛋白质种类的缺失。
双向凝胶分析法进行的其他检查显示了一种可能是pagC-AP融合蛋白的约45KDa的新蛋白质种类。采用Western印迹分析法以及针对AP的抗血清还对该pagC-AP融合蛋白进行了分析，并且发现其大小与天然AP(45KDa)相似并且不能在phoP-鼠伤寒沙门氏菌中表达。
pagC∷TnphoA插入片段的克隆从鼠伤寒沙门氏菌CS119中制备染色体DNA，并且利用TnphoADNA片段作为探针，采用印迹杂交分析法测定pagC∷TnphoA融合区域中限制性核酸内切酶的粗略的物理图谱。该项工作结果表明，用限制性核酸内切酶EcoRV进行消化产生单一DNA片段，该片段除包括几个Kb的侧面DNA外还包括插入的pagC∷TnphoA。用EcoRV消化CS119菌株的染色体DNA(平齐末端)，并连接到细菌质粒载体pUC19(New England Biolabs)上，该pUC19载体已用限制性核酸内切酶SmaI消化(平齐末端)。将该DNA电击穿孔到大肠杆菌DH5-α菌株(BRL)，并将菌落在含有卡那霉素抗菌素(TnphoA编码)以及氨苄青霉素(由pUC19编码)的LB琼脂上平板培养。选择出单个的含有命名为pSM100质粒的氨苄青霉素和卡那霉素抗性克隆作进一步研究。
从pSM100构建放射性标记的DNA探针，并将其用于CS119菌株和其野生型亲本ATCC 10428的Southern杂交分析中，以证实pagC∷TnphoA融合体已被克隆了。该探针含有在AP基因相对的末端与转座子紧密相邻的序列，用HpaI核酸内切酶消化后产生的DNA片段包含有转座子的右边IS50的186个碱基以及沙门氏菌DNA的1278个碱基(图2)。正如所期望的，由pSM100衍生的探针与从含有插入转座子的CS119菌株中得到的用AccI核酸内切酶消化的11-12Kb的DNA片段相杂交。该探针大约比与之杂交的野生型菌株中存在的3.9KBAccI片段大7.7Kb(TnphoA的大小)。另外，将质粒pSM100的衍生物，pSM101(它不能使pagC-phoA基因融合体脱离开lac启动子进行表达)转化到phoP-(CS015菌株)和phoN-(CS019菌株)沙门氏菌菌株中，并且发现被克隆的AP活性依赖于phoP而进行表达。因此，我们可以得出结论被克隆的DNA含有pagC∷TnphoA融合体。
还在鼠伤寒沙门氏菌的其他菌株以及伤寒沙门氏菌和S.dryp-ool中证明存在有pagC基因。所有被检查的沙门氏菌菌株显示出对8.0Kb EcoRV和3.9Kb AccI限制性核酸内切酶片段具有相似的强杂交作用，这意味着pagC是沙门氏菌种普遍具有的毒力基因。
从第-46位核苷酸(以1作为蛋氨酸的第一个碱基)至802位(PstI位点至BglII位点)的pagC基因探针不能与来自弗劳地氏柠檬杆菌，弗氏志贺氏菌，宋内氏志贺氏菌，痢疾志贺氏菌，大肠杆菌，霍乱弧菌，Vibrio vulnificus，小肠结肠炎耶尔森氏菌以及肺炎克氏杆菌的DNA进行交叉杂交。
野生型pagC座位DNA的克隆及其对鼠伤寒沙门氏菌pagC突变体毒力缺失的互补作用将上面描述的同样的限制性核酸内切酶片段用于筛选野生型ATCC 10428菌株的粘粒基因库。一个命名为pWP061的单个克隆含有鼠伤寒沙门氏菌的18Kb DNA，并且可与pagC DNA探针进行强杂交。当采用限制性核酸内切酶分析法以及DNA印迹杂交法进行分析时，发现pWP061含有与pSM100相同的沙门氏菌DNA。也将来自pWP061的探针与来自野生型和CS119鼠伤寒沙门氏菌的DNA进行印迹杂交分析。所观察到的杂交类型与用pSM100观察到的相同。也将pWP061转移到CS119菌株，一种pagC突变菌株中。得到的菌株具有野生型菌株对BALB/c小鼠的毒力(当以IP注射途径施用时其LD50低于20个细菌)。因此，被克隆的DNA互补了pagC突变菌株丧失的毒力。
由于发现含有pagC座位DNA的野生型粘粒互补了pagC突变型鼠伤寒沙门氏菌株缺失的毒力，因而可以得出结论pagC蛋白质，一个188氨基酸(18KDa)的膜(见下文)蛋白，是鼠伤寒沙门氏菌在巨噬细胞中存活及其毒力所必需的。
限制性核酸内切酶位点的物理图谱，DNA测序，以及pagC基因产物的测定对pSM100和pWP061质粒进行限制性核酸内切酶分析，以得到pagC座位的物理图谱，并且对于pSM100还测定其转录方向(图2)。制备DNA亚克隆，并对TnphoA融合体接点以及从HpaI位点，即phoA融合接头5′侧的第828个核苷酸，至RcoRI位点，即插入的TnphoA 3′侧的第1032位核苷酸的沙门氏菌DNA进行测序(图2和3)。根据需要合成一个活性AP基因融合的DNA可以推导出该DNA序列的正确阅读框。该开放阅读框的经推断得到的氨基酸序列编码一种188个氨基酸的预计pI＋8.2的蛋白质。这些数据与CS119菌株的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果相一致，在电泳分析中缺失了一种大约pI＋8.0的18KDa蛋白质。未发现预计将编码大于30个氨基酸的肽的其他开放阅读框。
所推断出的188个氨基酸的开放阅读框的氨基酸序列含有从pagC和AP融合体计数第33位的蛋氨酸起始密码子(图3)。这属于融合蛋白的33个pagC氨基酸与Western印迹分析中观察到的大小相一致，并且根据Kyle等人，1982，J.Mol.Biol.157105-132(引入本文作为参考)的方法，鉴定出含有一个疏水的N-末端区，该区域是典型的细菌信号序列，Von Heinje，1985，J.Mol.Biol.18499-105，引入本文作为参考。特别是第2位氨基酸是一个带正电的赖氨酸，跟随了一个疏水区，而第24位氨基酸是带负电荷的天冬氨酸残基。经推测，该前导肽的共有的切割位点是在第23位氨基酸的丙氨酸残基，Von Heinje，1984，J.Mol.Biol.173243-251，引入本文作参考。该DNA序列也揭示了一个典型的核糖体结合位点，该位点在预测的转译起始点5′侧第6-2核苷酸处(图3，第717-723位核苷酸)，Shine等人，1974，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 711342-1346，引入本文作参考。这意味着事实上开放阅读框被转译了，并且进一步支持了下列假设它正是被TnphoA插入而打断的pagC蛋白质的经推导出的氨基酸序列(图3)。
由被克隆的pagC座位体外合成蛋白质为了检测pagC是否编码其他蛋白质以及为了测定pagC基因产物的粗略大小，完成体外转录/转译偶联分析。将pWP061的5.3KbEcoRI片段插入到pUC19中，以使pagC基因不能从lac启动子表达。在体外转录-转译偶联分析中使用该质粒。该无细胞系统合成了大约22KD的单一蛋白质。该大小与含有前导肽的pagC蛋白质的前体大小相一致。这些资料进一步支持了下列结论单个pagC基因产物已被识别出了。
pagC编码的RNA的鉴别由pagC编码大约1100个核苷酸的RNA。与野生型和受pag激活的phoP组成型表现型相比，与野生型和phoP-细菌相比，具有pag激活的phoP组成型表现型的细胞能高效率地表达pagC基因。在这些印迹杂交试验中，仅在丰富培养基中生长的处于静止生长阶段的野生型细胞中可检测到pagC。该结果与前面的研究(Miller等人，1989，见上文，Miller，1990，见上文)结果结合在一起，证实了pagC是受phoP基因产物的转录调节的，并且仅在丰富培养基中生长的、处于早对数生长期的、具有phoP组成型表现型的细胞中进行表达。
pagC转录产物比编码该188个氨基酸蛋白质所必需的大小约大500个核苷酸。利用特异于pagC序列的寡核苷酸引物进行沙门氏菌RNA的引物延伸分析，以便测定转录的大约起始位点，以及测定该188个氨基酸的pagC基因产物的5′侧或3′侧核苷酸是否被转录。用推测与pagC的550-565个核苷酸(推测的起始密码子的5′侧第150个核苷酸)相互补的寡核苷酸进行引物延伸分析试验，结果产生约300个核苷酸的引物延伸产物。因此，构建了一个更上游的引物，它与pagC的第335-350位核苷酸相互补，并将其用于同样的分析中。观察到180个核苷酸的引物延伸产物是引物特异性的。这与在第170位开始的转录相一致(图3)。在推定的转录起始处的上游(位于153-160位核苷酸之处)，观察到一个典型的RNA聚合酶结合位点，该位点在第-12位核苷酸处的序列为TATAAT，在第-10位核苷酸处的序列为TAATAT。在位于-10区域上游的15-21位核苷酸处没观察到完全匹配的共有RNA聚合酶识别位点(TTGACA)。在第-39位核苷酸(126-131)(TTGGAA)处，在-38(127-132)位核苷酸(TTGTGG)处，以及第-25(135-140)位核苷酸(TTGATT)处是与该序列中最常保守的核苷酸相匹配的序列。
基于上述结果，预测转录是在188个氨基酸蛋白质的转译终止密码子(第1295位核苷酸，图3)附近结束。的确，在1309-1330位核苷酸处已发现茎环构型，它具有转录终止子的作用。这一结果与188个氨基酸蛋白质下游没有存在开放阅读框的证据以及利用克隆的pagC DNA没有其他的转录和转译合成相一致。这进一步暗示，pagC∷TnphoA的插入仅使一种蛋白的合成失活。
pagC与Ail和Lom的相似性利用National Biomedical Research Foundation/ProteinIdentification Resource，George等人，1986，Nucleic AcidsRes.1411-15，引入本文作参考，对蛋白质的相似性进行计算机分析。对蛋白质序列数据库进行处理，以便识别出与pagC具有相似性的其他蛋白质，试图找出该蛋白质分子功能的线索。值得注意的是，发现pagC与噬菌体λ蛋白质Lom具有相似性，在小细胞分析中，Lom已定位于外层膜上，Court等人，1983，Lambda II，Hendrix，R.w.等人ed.Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring HarborNY)，pp.251-277，引入本文作参考，并且证实是由大肠杆菌的λ溶素原表达的，Barondess等人，1990，Nature 346871-874，引入本文作参考。最近，确定了据推测的小肠结肠炎耶尔森氏菌的被克隆的ail基因产物的氨基酸序列，并且发现也与Lom相似，Miller等人，1990b，J.Bacteriol.1721062-1069。因此，利用建立蛋白质序列族和共有序列的计算机规则系统对一个蛋白质家族的序列进行排列校正，Smith等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87118-122，引入本文作为参考。用这些蛋白质之间相似性的内部数据库值(internal data base values)pagC和Lom(107.8)，pagC和Ail(104.7)，以及Ail和Lom(89.8)，来表示该家族的构造。在数据库中，相对于314对照序列寻找这些相同的蛋白质，并且平均值和范围是39.3(7.3-52.9)pagC，37.4(7.3-52.9)Ail，以及42.1(7.0-61.9)Lom。该蛋白质家族的相似性值都比根据与314随机序列的相似性获得的最高得分大3.5标准偏差。在该数据库中未发现其他相似性或其他族内成员。相似性区域不仅定位于前导肽转膜区而且贯穿整个蛋白质。
pag突变菌株的毒力被减低了本发明的带有pagC突变的鼠伤寒沙门氏菌的毒力至少被减低1000倍。
除pagC以外，本发明中描述的其他pag基因可用于研制活的沙门氏菌菌苗。在phoP激活的基因中发生突变可用于构建减毒的活沙门氏菌菌苗。在构建多价的沙门氏菌介导的菌苗时，通过将外源基因表达指定到提供抗原的巨噬细胞中，受phoP激活的启动子可以提高免疫原性。
新的受phoP激活的基因的鉴别为了进一步分析受phoP激活的基因对细菌毒力的作用，采用TnphoA诱变法制备具有活化phoA基因融合的菌株库。CS019菌株是用作TnphoA诱变的亲本菌株，因为它具有野生型细菌的毒力并且携带了phoN2等位基因，从而使背景磷酸酶活性降到最小值。根据在含有XP的琼脂上生长的蓝色菌落表现型而鉴别出带有活性phoA基因融合的菌株。然后筛查这些菌株由于获得了导致phoP无效表现型的phoP12等位基因而降低的融合蛋白活性。
分离到2064个表达AP的菌株并且从240次独立的交配中纯化出菌落。卡那霉素抗性(含有TnphoA)细菌总群体中分离出具有AP活性的菌株的频率为0.8％。从表达AP的菌株库中分离出总共为54个的pag∷TnphoA插入物候选物。在这些候选物中测出有49个在没有功能性phoP/phoQ时其AP活性降低大于6倍以上。因此，表达AP的菌落中的2％被鉴别为pag-phoA基因融合。
十三个独特的pag座位的鉴定利用三种方法测定49个TnphoA插入物是否限定于单独的pag座位中。首先，确定TnphoA插入位点5′侧的EcoRI和HindIII限制性核酸内切酶位点物理图谱。第二，对与已知pag座位高度连锁的转座子插入物进行连锁性分析。第三，筛查由上述方法测出是独特的菌株与已知染色体位点上有转座子插入的一些菌株的连锁性。
印迹杂交分析证实，在49个菌株中有13个在TnphoA插入的5′侧有独特的限制性核酸内切酶位点。在TnphoA插入5′侧有相似物理图谱的菌株数为1-7个。在13个物理图谱中有一个与预期在pagC中有插入物的物理图谱相似，并且可在分离出的作为含有pag∷TnphoA插入物候选物的7个菌中看到。对这7个菌株进行分析，结果表明，仅有三个是pagC∷TnphoA插入，因为用作探针的pagC片段进行印迹杂交分析以及对与pagC高度连锁的转座子插入进行连锁性分析，结果表明，这些插入物中有4个不在pagC中。另一个pag∷phoA融合体被命名为pagP，它具有的5′限制性核酸内切酶物理图谱正好是预期为phoN所具有的。但是，通过连锁性分析和印迹杂交法测出该插入物不是在phoN内。在野生型细菌和含有pagP∷TnphoA和ZXX∷6215 Tn10d-Cam的CS1247菌株之间进行转导性杂交。根据卡那霉素抗性选择转导子，以保证编码卡那霉素抗性的pagP∷TnphoA遗传给子代。然后筛查这些菌落的氯霉素抗性，这种抗性的存在表明，ZXX6215 Tn10d-Cam与pagP连锁。未发现连锁性则表明pagP未与phoN相连锁。还用CS1247完成了以phoN的一部分作为探针的印迹杂交试验，结果表明，该菌株含有一个野生型phoN座位。定义了十三个pag座位并命名为pagD-P。
为了进一步限定13种pag∷TnphoA融合蛋白的phoP调节作用，在除phoP座位以外为等基因的菌株中检测AP活性。对在丰富培养基上生长的处于对数期和静止生长期的细菌检测AP活性(表13)。一个完整phoP座位对于充分表达的依赖性在不同的生长阶段保持不变；但是，随着生长而提高的AP表达的相对量是有限的。当将带有野生型和无效phoP座位的等基因菌株进行比较时，pag基因融合表达的差别在6-48倍范围内变化。
前面鉴别的5个pag座位中，仅phoN，pagC和pagA的染色体定位是已知的。利用含有与pagC连锁的转座子插入物(AK3233和AK3140)的菌株以及含有与pagA连锁的转座子插入物(AK3255)的菌株对13个新鉴别的pag座位进行连锁性分析。发现有三个pag∷TnphoA插入物与AK3140相连锁，它们是在染色体上靠近pagC的24-25染色体小片(minute)的一个区域内。将它们命名为pagD，pagE和pagF。正如前面对pagC的描述，pagD∷TnphoA同样与AK3233(83％)和AK3140(33％)的转座子插入物相连锁。已对该菌株的TnphoA插入物作了进一步限定，它从pagC进行完全不相同的转录。pagE和pagF与AK3233和AK3140的连锁显示出与pagC和pagD的不相同，意味着具有显著不同的染色体定位。该pagE∷TnphoA插入物与AK3233转座子插入物具有39％的连锁性，而与AK3140转座子插入物具有99.1％的连锁性，但pagF∷TnphoA与AK3140插入物的连锁性为31％，而与AK3233没有连锁性。这些不同的连锁关系以及TnphoA插入物5′侧限制性内切酶位点的物理图谱表明，它们是新的pag座位。因此，在25染色体小片区域内发现三个新的pag座位，其中之一是与前面定义的pagC高度连锁。
然后用一组被定义为随机Tn10Δ16Δ17的插入物在带有位置未知的TnphoA插入物的10个菌株中进行连锁性分析。在这10个pag∷TnphoA等位基因中，仅两个被证实与Tn10Δ16Δ17插入物库相连锁。证实pagG∷TnphoA插入物与定位于约30染色体小片处的AK3258转座子插入物有97％的连锁性。该命名为pagH的pag∷TnphoA插入物显示出与AK3091插入物有23％的连锁性。与AK3091转座子插入物的连锁性近似于前面证实的对prgE的连锁性(26％)。因此，该染色体区既含有受phoP激活的基因又含有受phoP阻遏的基因。利用从用限制性核酸内切酶XbaI和BlnI消化的AK3091得到的染色体DNA进行脉冲梯度电泳，对该Tn10Δ16Δ17插入物进行分析。这些资料表明，AK3091的转座子插入物定位于20-25染色体小片区域内，并且pagH和prgE定位于染色体的该区域内。
带有pag∷TnphoA插入物的菌株具有对兔NP-1防卫素的野生型敏感性在phoP操纵子中带有无效突变的鼠伤寒沙门氏菌对各种各样的阳离子型抗菌肽(包括防卫素，爪蟾抗菌素，以及鱼精蛋白)的敏感性增强。防卫素是在嗜中性粒细胞、肺巨噬细胞和肠的帕内特(Paneth)细胞中存在的一族哺乳动物肽。对这些肽的抗性赋于细菌毒性以及移居于粘膜表面的能力。对带有pag∷TnphoA插入物的菌株进行检测，观察其对高活性的兔防卫素NP-1的敏感性。带有单一的pag∷TnphoA插入物的菌株没有一个菌株显示出对NP-1防卫素的敏感性增强(参见图6)。因此，尽管phoP无效突变显示出对兔防卫素NP-1是敏感的，但没有限定出pag座位中哪个突变是与防卫素敏感性相关的。
带有pag∷TnphoA插入物的四个菌株显示出对鼠毒力明显减低为了进一步解释这些新的pag座位是否对鼠毒力起作用，在体内筛查带有pag转座子插入物的13个菌株。将约100个细菌腹膜注射到小鼠中。在pagD，pagJ，pagK和pagM中带有转座子插入物的四个菌株显示出毒力减低。用这些菌株注射的小鼠全部存活，并且没有显示全身感染的迹象，例如肝脾肿大和颈背病症(由于发烧引起竖毛)。将多种剂量的这四种菌株腹膜注射到两次试验中的总共10个鼠中，进一步检测其毒力。测定其平均LD50值，并列于表14中。这些菌株中的含有pagD∷TnphoA插入物的一个菌株具有比野生型鼠伤寒沙门氏菌大10,000倍的LD50。其他三个菌株对鼠的毒力也显著降低，其LD50值比野生型菌株大1000-10000倍。这些资料表明，当受phoP调节的座位，pagD、pagJ、pagK和pagM发生突变时，导致细菌毒力降低。
对鼠毒力减低的pag∷TnphoA菌株降低了左巨噬细胞内的存活力由于phoP突变沙门氏菌不能在巨噬细胞内生存，对对鼠毒力减低的含有pag基因突变的菌株进行检测，观察其在巨噬细胞中存活性降低情况。如表14所示，带有pag突变的所有菌株显示出在巨噬细胞内的存活性明显降低。pag突变体的胞内存活性的降低直至预计的pag得到最大量地表达时才能观察到。
发现在pagC、pagD、pagK、pagJ和pagM座位中带有突变的四个菌株对鼠的毒力以及在巨噬细胞内的生存力被降低。在这5个pag中带有突变的菌株的毒力都有不同程度的降低。在pagJ中带有突变的菌株其丧失的毒力与在pagC突变体中观察到的情况相当(比野生型细菌的LD50大1000倍)。pagD∷TnphoA的插入使毒力得到最大减低，与phoP无效突变相当(比野生型细菌的LD50大10000倍)。pagK和pagM突变体毒力减低的程度居于pagJ和pagD突变体中间。如果相加，并与带有TnphoA插入物后观察到的减毒作用相似，则pagC，pagD，pagJ，pagK和pagM缺失的累积效果可比单独缺失phoP观察到的效果大得多。这些基因中有许多是在没有phoP时在静止期表达的，这一现象表明，功能性pag蛋白质可以在没有phoP情况下于体内产生。一个毒性基因pagM在没有phoP时大量地表达，尽管对于在巨噬细胞吞噬体内仍需要phoP/phoQ诱导。这些资料意味着pag基因产物的缺失可导致产生比调节蛋白缺失更大的减毒作用。
沙门氏菌包膜蛋白作为毒力因子防卫素敏感性基于鉴别pag座位(即与phoA融合的转译基因)的方法，以及pagC基因融合产生AP这一现象，现在已发现许多pag编码细菌包膜蛋白。还未发现带有可赋予对防卫素或其他阳离子肽敏感性的单个pag突变的菌株。该资料意味着由phoP/phoQ介导的、在包膜蛋白的完整聚集体合成中发生改变而导致的细菌包膜的变化对鼠伤寒沙门氏菌毒力可能是至关重要的。
防卫素是长度约为30-35个氨基酸的双亲性阳离子肽，其抗菌作用包括穿透和打碎膜，可以是通过在膜上形成了选择性阴离子通道。尽管防卫素主要是在嗜中性粒细胞和帕内特细胞中发现的，但这些或其他相关分子可能对巨噬细胞具有的吞噬细菌的非氧化性杀死起作用。尽管仍可能存在一种单一的未鉴别出的pag编码的一种蛋白质负责对防卫素抗性，但似乎更可能是几种pag编码的包膜蛋白的表达累积作用导致其对防卫素具抗性。多种细菌包膜蛋白的集体变化可能改变膜电荷，电势或类脂含量，从而可能改变防卫素与细菌膜的相互作用。
与pagC连锁的转录单位的鉴别为了鉴别pagC上游的基因，用转座子MudJ和TnphoA对携带含有位于pagC 5′侧2.8Kb DNA的pWPL17质粒的大肠杆菌(表15和图7)进行诱变，并用生色底物鉴别带有AP或β-半乳糖苷酶活性的菌株。另外，作为鉴别其他受phoP激活基因的实验的一部分，用TnphoA对沙门氏菌染色体进行随机诱变，并筛查具有AP活性的菌株，观察TnphoA插入物与AK 3233菌株的Tn10Δ16Δ17的连锁，它与pagC的连锁性是75％。鉴别出了几种菌株，它们含有质粒，这些质粒带有产生活性MudJ或TnphoA基因的融合。另外，鉴别出了两个菌株，它们含有与pagC紧密连锁的活性染色体TnphoA插入物。制作带有活性质粒或染色体LacZ和phoA基因融合的菌株中转座子插入物周围的限制性核酸内切酶位点的物理图谱，以便测定转座子插入物与pagC的相互关系。该试验结果显示，该DNA的几个区以相对于pagC相反的方向被转录(图7)。鉴别出了几个活性phoA基因融合体的TnphoA插入物。这些资料表明，与pagC连锁的基因编码膜或分泌蛋白。
与pagC连锁的基因编码四种新的蛋白质为了进一步分析由转座子插入物限定的基因，测定该区域的DNA序列(图8)。将含有该区域的DNA进行克隆；并对位于pagC起始密码子上游737bp的HpaI位点至更上游的ClaI位点之间的4Kb DNA进行测序。还测定了所有TnphoA和MudJ基因融合的融合接头处的DNA序列。基于这些资料，确定了每个基因的正确阅读框。基于得自于TnphoA和MudJ插入物的资料，该DNA序列资料显示了推测的被转录和转译的四个ORF。所有ORF显示出有距推定的转译起始位点6-11个碱基的典型的核糖体结合位点。紧接pagC、pagD上游的ORF的转译以及与pagC、pagD方向相反的转录表明，它编码了一个87氨基酸的短包膜蛋白(未加工)。其后紧随着第二个ORF(envE)，它编码一个178氨基酸的包膜蛋白(未加工)。该ORF后面跟随一个结构，该结构具有不依赖Rho的转录终止子的作用(参见图8)。第三个ORF，msgA(巨噬细胞存活基因)编码一个大小类似于第一个基因产物(79个氨基酸)的小蛋白，并且其后也跟随一个结构，该结构也具有不依赖于Rho的转录终止子的功能(参见图8)。该DNA序列预示，该蛋白质是由几个带电残基组成的，并且在羧基末端存在有许多带负电荷的氨基酸。该预测的蛋白质产物在其氨基末端或任何疏水伸展臂中都不含有类似于信号序列的结构；因此，第三个ORF不可能编码包膜蛋白。最后一个ORF(envF)编码278个氨基酸的包膜蛋白(未加工)。对已知的蛋白质基元进行计算机检索结果显示，EnvF含有一个共有的原核细胞膜类脂吸附位点，并且因此可能是一种脂蛋白(参见图8共有位点的位置)。
推测的由pagD、envE和envF产生的蛋白质含有一个典型的细菌信号序列结构。另外，疏水情况证实这些蛋白质的氨基末端具疏水特性。EnvE和EnvF蛋白还含有疏水伸展臂，它具有膜横跨区的功能。在该区域基因的G＋C含量是pagC，43.4％；pagD，42.1％；envE，45.9％；msgA，46.8％；以及envF，40.5％，其含量大大低于鼠伤寒沙门氏菌的平均G＋C含量(52％)。对这四个ORF的预定的蛋白质序列在数据库中进行全面检索，结果显示，没有显著相似性。选择出含有三个不同TnphoA插入物和一个MudJ插入物的菌株作进一步的特性鉴定，其中这些插入物各定位于四个基因之一上。
与pagC相反方向转录的pagD基因受phoP/phoQ的正调节检查带有转座子插入物的典型菌株，以评估在phoP存在下与pagC相反方向转录的基因的合成是否增加。为了准确测定这些基因是否受phoP调节，必须将质粒插入物重组到沙门氏菌染色体中。将含有转座子插入物的基因替代野生型基因后，将从这些菌株制备的P22HTint裂解液转导进phoP缺失(phoP-)的菌株中，并监测AP或β-半乳糖苷酶水平。转座子产生的基因融合之一显示了在phoP-和野生型背景之间活性显著提高，而其他插入物显示未受phoP的调节(表16)。该pagD座位与pagC相邻接，并从pagC上进行不同种类的转录。
在envF中的典型转座子插入物不能重组到染色体中，这可能是由于该转座子下游的同源DNA的量不够充足。为了检查envF基因受phoP调节的可能性，将该基因上游的穿过并包括TnphoA转座子的phoA基因一个区域克隆，它是作为一个3-Kb PvuI(平齐末端)-XhoI片段克隆到自杀载体pGP704的EcoRV-SalI位点。将该克隆交配到沙门氏菌CS019菌株中，并筛选具氨苄青霉素抗性的重组体(形成一个命名为envF∷pGPP2菌株)。将phoP105∷Tnlod-Tet突变转导到该菌株中并形成了一个仅在产生功能性phoP蛋白质能力方面不同的等基因体。如表16所示，phoP105∷Tnlod-Tet的导入并没有影响这两个菌株的AP水平，证实envF不是受phoP激活的基因。
在pagC连锁的基因中插入转座子减低了毒力并导致在巨噬细胞内的存活性下降由于在pagC中插入转座子显著地提高了鼠伤寒沙门氏菌对BALB/c小鼠的LD50，因而对含有与pagC相连锁的转座子插入物的菌株进行评估，检测其对鼠毒力的减低情况。如图7所示，envE中的转座子插入物对菌株毒力没有影响，而与野生型细菌(LD50＜20个细菌)相比，在pagD中的TnphoA插入以及下游1.8Kb处在msgA中的MudJ插入使鼠伤寒沙门氏菌的毒力减低要大300倍。这些资料意味着这两个座位对毒力而言是必要的。
为了检查毒力缺陷的菌株的生存能力，将在pagD或msgA中含有插入物的鼠伤寒沙门氏菌用于感染从骨髓得到的巨噬细胞。表15中显示的结果证实，这两菌株在巨噬细胞中存活性降低。与msgA插入物(MSI＝0.01)相比，pagD插入物(MSI＝0.002)的存活性更低，两种菌株的降低情况相等于或大于phoP-菌株(MSI＝0.01)。
该基因中的转座子插入不能重组到染色体中。因此，有必要证实msgA的毒力和在巨噬细胞中存活性降低不是由于MudJ插入对envF转录的极性作用引起的。因此，将pGPP2重组到msgA∷MudJ菌株中，并将该菌株的AP活性与含有重组pGPP2的CS019的AP活性相比较。该资料(示于表16)证明，envF基因的转录不受msgA∷MudJ插入的影响，并且是从其自身启动子转录的。但是，在不同环境条件下，其他启动子可能被激活，将msgA和envF置于同一转录物中。
msgA和pagD转录起始位点的测定检查这些基因的5′区域，以限定msgA和pagD的转录起始位点。在引物延伸分析中使用与各个ORF的5′末端或上游区域相互补的寡核苷酸。该分析结果显示，pagD转录物是从转录起始点上游的39个碱基开始的。发现推测的-10(TTCCAT)和-35(TTGAAT)区域与大肠杆菌启动子的已知的共有序列相类似。仅在phoPc沙门氏菌RNA中检测到pagD转录物，而在phoP-沙门氏菌RNA中没有检测到。发现msgA的转录起始点开始于转译起始处上游的58个碱基处，并且含有推测的-10(CAAAAC)和-35(TTACGT)序列。这些区域与共有的-10和-35序列不完全一致；但是，在phoPc和phoP-RNA的引物延伸试验中，使用各种引物很容易检测到该转录物的cDNA，并且它可能产生一个高丰度RNA。
在肠杆菌科和两种G＋C含量细菌中pagD和msgA基因的分布pagC染色体区域的G＋C含量比沙门氏菌的平均G＋C含量低得多。编码鼠伤寒沙门氏菌的受phoP调节的酸性磷酸酶的基因(phoN)也具有低G＋C含量(39％)，并且在所检测的几个属中仅发现在两种低G＋C细菌中存在与phoN同源的DNA。通过印迹杂交试验，检查肠杆菌科的几个成员以及两种低G＋C细菌中的DNA，观察其与pagD和msgA的相似性。将各个ORF高度专一性的PCR片段进行标记，并用作探针。该项分析证实了与所有检查的沙门氏菌以及宋内氏志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、肺炎克氏杆菌和弗劳地氏柠檬杆菌的高度严谨性杂交。对于低G＋C细菌摩根氏摩根氏菌或司徒氏普罗威登斯菌没有看到杂交。用两种基因的特异性探针看到相同杂交类型，表明，这些基因在除沙门氏菌以外的细菌中也是连锁的。
鼠伤寒沙门氏菌在巨噬细胞内生存所必需的一个毒力基因簇目前已识别出了处于鼠伤寒沙门氏菌的pagC基因上游并以相反方向转录的四个基因。根据在这些座位处分离到的活性TnphoA插入物以及在每个蛋白质氨基末端存在有典型信号序列，推测三个基因(pagD、envE和envF)是包膜蛋白。这四种蛋白质中没有一种与数据库中的任何蛋白质具显著同源性。
仅测出在pagC上游紧接并且以相反方向转录的基因(pagD)是受phoP调节的。在这一基因中转座子插入大大地减低了毒力以及该细菌在鼠巨噬细胞中的存活能力。已经证明当沙门氏菌位于巨噬细胞吞噬体内时诱导出几种pag(包括pagC)的转录。另外，在巨噬细胞衍生的细胞系感染之后对由沙门氏菌产生的蛋白质进行分析，表明，pag产物被诱导产生，并且pagC是在由于巨噬细胞感染而诱导的最高丰度基因产物中。由于在巨噬细胞中生存需要pagD，因此可能该基因的转录也将在巨噬细胞吞噬体中被诱导。pagD蛋白质是小的(87个氨基酸，未加工)，并且没有强疏水性区域；因此，可能它是一种外周胞质或分泌蛋白。
已发现在msgA基因中插入转座子对鼠毒力和于巨噬细胞内生存产生影响。这可能是该基因也是在酸性化的巨噬细胞吞噬体内诱导的，正如其他在巨噬细胞内存活所必需的基因。如果该基因是受巨噬细胞环境诱导的，它的表达(以及对于在巨噬细胞内生存所必需的其他基因)可能是受独立于phoP/phoQ系统的调节系统控制的。
这些与pagC连锁的基因没有显示出能形成一个操纵子。由于pagD下游的基因没有一个是受phoP调节的，因而它们似乎不是从pagD启动子转录的。在envE基因末端存在的潜在的转录终止子使msgA不可能是与envE共转录的。这些资料暗示，msgA∷MudJ插入物在envF中不是极性的，这表明envF有其自己的启动子。另外，在msgA后有一个潜在的转录终止子以及一个493bp基因内区域使得这些基因不可能被共转录。这些基因的引物延伸分析证实，所有四种基因都是从其自己的启动子转录的。
在该区域鉴别的其他两个基因，envE和envF，可能产生膜蛋白，该膜蛋白含有特征性膜横跨区。根据共有类脂吸附位点的存在，该envF基因产物可能是脂蛋白，并且可能对沙门氏菌毒力起作用。
在pagC区域中存在低G＋C含量的基因，暗示它们可能是由水平传递获得的。用msgA或pagD基因作为探针对低G＋C细菌进行的Sou-thern印迹分析结果显示没有同源性，但这并不能消除这样的可能性，即它们是从另一低G＋C含量细菌获得的。还存在这样的可能性，即这些基因存在于从其他来源获得的移动性遗传成分上。msgA和pagD探针以相同方式与肠杆菌科中除沙门氏菌以外的其他成员进行杂交。但是，已显示pagC基因是沙门氏菌种中独有的。这表明pagC上游基因的产物与pagC没有形成复合物或者它们的功能并不需要pagC的作用。或者，由于与pagC具同源性的蛋白质存在于其他肠杆菌科(没有任何DNA同源性)，因而在其他种内pagC同源物可能与msgA和pagD相连锁，这种情况由DNA杂交试验没有检测到。
pagC/pagD启动子区异源蛋白质的表达pagC和pagD是不同转录的并且都是受phoP激活的。其他的不同转录的、受调节的基因是本领域内已知的(Beck等人，1988，Microbid.Rev.52318-326)，例如肺炎克氏杆菌pulA-malX区域(Chapon等人，1985，J.Bacteriol.164639-645)。大多数这样基因的转录除需要用于活化转录的调节子外还需要辅助蛋白，例如CAP。这两种基因是不同转录的，并且它们的启动子的排列是背对背的。在这些基因的转录起始位点之间存在一个134bp区域，该区域是与pagC和pagD之间的基因间区域相似的。据推测，pulA-malK启动子区含有两个MalT(该系统的调节蛋白)结合位点，分别对应于各个基因。其他受MalT激活的基因需要CAP蛋白进行表达，但pulA和malX基因不需要，可能由于MalT调节子局部浓度高。由于pagC和pagD的转录起始位点(推测的-35序列)之间的区域仅为137bp(SEQID No15的第562-776位核苷酸)，因而可能只有phoP结合位点存在于基因间隔区，并且一个或多个磷酸化phoP分子的结合对两个基因正调节。可用含有不同启动子的pagC/pagD基因间隔区构建表达两个异源蛋白的载体，各处于一个方向。
prg基因正如上面所讨论，phoP/phoQ组成型突变(phoPc表现型)提高了pag的表达并阻遏了受phoP阻遏的基因(prg)编码的约20种蛋白质的合成。phoPc细菌对鼠毒力的降低，暗示prg是毒力基因。
通过使用TnphoA转座子，鉴别出了5个不连锁的prg座位。通常，能激活pag表达的培养条件(饥饿状态)阻遏prg的表达。通过口服和静脉注射途径试验证实一个prg座位，prgH，对鼠毒力起作用。发现在诱导上皮细胞的内吞作用时prgH和phoPc突变鼠伤寒沙门氏菌是无效的。对这些毒力基因进行鉴别和突变在菌苗研制中是有用的。
prgH，prgI，prgJ和prgK基因的核苷酸序列SEQ ID No10描绘一个5100-bp Hind III片段的核苷酸序列，该片段含有高侵染性hil座位。编码四个prg基因的四个ORF定位于该DNA内(参见图9)。底下划线部分为ATG起始密码子，星号表示prgH，prgI，prgJ和prgK终止密码子的位置。这些prg位点是细菌入侵上皮细胞，保持完全鼠毒力以及跨上皮嗜中性粒细胞迁移所必需的。由于这些位点的一个或多个发生突变而减低毒力的细菌可用于接种个体，使之抵抗野生型病原体的感染。
菌株，材料和方法在prg基因定性中使用的所有细菌菌株列于表5中。
表5菌株基因型或描述 相关参照文献或来源鼠伤寒沙门氏菌14028s衍生物14028s野生型 ATCCCS002 phoP12 本研究CS003ΔphoPΔpurB本研究CS012 pagA1∷Mu dJ 本研究CS013 pagB1∷Mu dJ 本研究CS119 pagC1∷TnphoA phoN2 zxx∷6251 Tn10d-Cm 本研究CS015 phoP-102∷Tn10 d-Cm本研究CS019 phoN2 zxx∷6251Tn10d-Cm本研究CS022 pho-24 本研究CS023 pho-24 phoN2 zxx∷6251Tn10d-Cm 本研究CS030 phoN2 zxx∷6251Tn10d-Cm phoP12本研究AD154 phoP12 purB1744∷Tn10由E.Eisenstadt赠送CS031 pho-24 purB1744∷Tn10 本研究IB001 phoN2 zxx∷6251Tn10d-CmΔphoPΔpurB本研究IB002带有prgA1∷TnphoA的CS030本研究IB003带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB002本研究IB004带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB002 本研究IB005带有prgA1∷TnphoA的CS019 本研究IB006带有prgA1∷TnphoA的CS015 本研究IB007带有prgB1∷TnphoA的CS030 本研究IB008带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB007 本研究IP009带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB007 本研究IB010带有prgB1∷TnphoA的CS019 本研究IB011带有prgB1∷TnphoA的CS015 本研究IB012带有prgB2∷TnphoA的CS030 本研究IB013带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB012 本研究IB014带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB012 本研究IB015带有prgB2∷TnphoA的CS019 本研究IB016带有prgB2∷TnphoA的CS015 本研究IB017带有prgC1∷TnphoA的CS030 本研究IB018带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB017 本研究IB019带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB017 本研究IB020带有prgC1∷TnphoA的CS019 本研究IB021带有prgC1∷TnphoA的CS015 本研究IB022带有prgE1∷TnphoA的CS030 本研究IB023带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB022 本研究IB024带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB022 本研究IB025带有prgE1∷TnphoA的CS019 本研究IB026带有prgE1∷TnphoA的CS015 本研究IB027带有prgE2∷TnphoA的CS030 本研究IB028带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB027 本研究IB029带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB027 本研究IB030带有prgE2∷TnphoA的CS019 本研究IB031带有prgE2∷TnphoA的CS015 本研究IB032带有prgE3∷TnphoA的CS030 本研究IB033带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB032 本研究IB034带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB032 本研究IB035带有prgE3∷TnphoA的CS019 本研究IB036带有prgE3∷TnphoA的CS015 本研究IB037带有prgH1∷TnphoA的IB001 本研究IB038带有pho-24 purB1744∷Tn10的IB037 本研究IB039带有phoP12 purB1744∷Tn10的IB037 本研究IB040带有prgH1∷TnphoA的CS019 本研究IB041带有prgH1∷TnphoA的CS015 本研究IB042 Tn5B50-380 in IB040 本研究IB043 pWKSH5 in IB040 本研究IB044 pWKSH5 in CS022 本研究CS032 oxiA1049∷Mu d1-8 supD10本研究CS033 oxiC1048∷Mu d1-8 supD10本研究CS034 oxiE4∷Mu d1ΔnadA100 本研究其他鼠伤寒沙门氏菌衍生物保藏物被Tn10Δ16Δ17插入物随机分隔开的AK3011-AK3314(19)TT520 srl-202∷Tn10 (41)TT2979srl-211∷Tn5 (41)TN3061zcf-845∷Tn10 dcp-l zhg-1635∷Tn10dCm (41)SH7782ompD∷Tn5 (41)x4115 invA∷cat (13)EE517 Δhil-517(Tn5B50-380) C.Lee的礼物JF897 oxiA1049∷Mu dl-8 supD10 (2)JF896 oxiC1048∷Mu dl-8 supD10 (2)JF739 oxiE4∷Mu dl ΔhadA100(2)肠炎沙门氏菌CDC5 临床野生型分离株 (45)SM7 Strr smb (45)大肠杆菌SM10(pRT291)含有源自于pRK290的质粒pRT291(TnphoA)，通过选择Tcr和Kmr。(49)MM294(pPH1JI)含有Gmr质粒pPH1JI，它与pRK290不相容 (49)W42(pWKSH5)含有质粒pWKSH5，一种pSC101的衍生物(51)，它含有hil V，Bajaj和DNA包括prgH的一个5.1Kb HindIII片段C.Lee
细菌按如下条件培养以Luria-Bertani(LB)液体培养基用作丰富培养基。在生长培养基或琼脂中使用下列浓度的抗菌素氨苄青霉素100μg/ml(AP)，氯霉素25μg/ml(Cm)，庆大霉素30μg/ml(Gm)，卡那霉素45μg/ml(Km)以及四环素25μg/ml(Tc)。在琼脂上利用终浓度为40μg/ml的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(对-甲苯胺盐)(XP)检测磷酸酶活性。以对-硝基苯磷酸盐(p-NPP)用作为定量检测AP活性的底物。用1M柠檬酸钠将培养基调整至各种pH范围。按照Davis等人，1980，Advanced Bacterial Genet-icsA Manual for Genetic Engineering.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.的描述制备E培养基(Vog-el-Bonner基本培养基)。按照Kier等人，1977，J.Bacteriol.130399(引入本文作为参考)的描述制备无氮，无碳和无磷酸盐培养基(N-C-P-)。在这种饥饿培养基中补充0.04％(重量/体积)葡萄糖作为碳源，10mM NH4Cl作为氮源，以及1mM NaH2PO4·H2O)作为磷酸来源。碳浓度比Kier等人(见上文)描述的浓度低1个对数值。
用对在不同氧压，37℃振荡或不振荡条件下从单个菌落接种物生长得到的培养物进行检测，测定除phoP座位中发生突变外为等基因的菌株的AP活性。在37℃，具有80％N2，10％O2和10％CO2的气体混合物的厌氧室(Coy Laboratories Products，Inc.)中培养厌氧培养物。对于酸调节，取出对数生长中期的培养物试样，测出起始pH和AP活性。将1M柠檬酸钠(pH＞6.0)或1M柠檬酸(pH4.7)加至等量的培养物中至终浓度为50mM柠檬酸。将培养物在有氧条件，37℃生长2小时，然后进行pH值测定和AP值测定。按前面描述测出AP活性(Michaelis等人，1983，J.Bacteriol.154366-374，引入本文作参考)。根据下列通式计算AP单位按照Miller对β-半乳糖苷酶的定义(Miller等人，1972，Experiments in Moleculargenetics，P.352-355.Cold spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY.)1个单位＝{OD420/[时间(分钟)×体积×OD600]}×1000。
用标准细菌遗传技术研究prg座位。根据本领域内已知方法完成噬菌体P22HTint介导的转导。用广谱宿主质粒(pRT291)进行TnphoA诱变以分送TnphoA(Taylor等人，1989，J.Bacteriol.1711870，引入本文作为参考)。通过使用不相容pPH1JI质粒(Tay-lor等人，见上文)可识别转导到沙门氏菌DNA中的TnphoA。利用CS031，pho-24等位基因的供体菌株，完成对受phoP阻遏的基因的筛查。通过在AD154和CS022菌株之间进行P22噬菌体转导杂交可以构建CS031，AD154和CS022分别含有purB∷Tn10等位基因以及pho-24等位基因。pho-24和purB∷Tn10的连锁性是70％，与purB与其他phoP等位基因的连锁性相似。因此，当在CS031和含有phoA基因融合活性的菌株之间进行P22噬菌体转导杂交时，可以根据四环素抗性的获得而筛查到丧失融合蛋白活性的菌株。起始的筛查步骤包括在大约70％的获得四环素抗性的菌落中检测到AP活性的丧失，因为它被假设含有pho-24等位基因。另外，利用AD154菌株作为对照，该菌株含有与phoP无效等位基因phoP12相连锁的相同的purB∷Tn10等位基因。采用CaCl2和热休克方法(Maclachlan等人，1985，J.Bacteriol.161442)将质粒DNA转化到鼠伤寒沙门氏菌LB5010菌株中。
在受phoP阻遏的基因中带有TnphoA插入的菌株的分离在phoP座位上发生的导致pag的表达以不受调节方式被增加的组成型突变(phoPc表现型)也显著减弱了鼠伤寒沙门氏菌的毒力以及在巨噬细胞中的生存力。phoPc菌株毒力的缺失可由受phoP阻遏的基因(prg)编码的约20种多肽表达的降低来解释。
通过在CS019和CS003之间进行P22转导杂交构建出一个phoP-phoN-菌株(IB001)。然后用TnphoA对IB001进行诱变(以便由phoN编码的背景酸性磷酸酶不会干扰由于phoP座位的改变对融合蛋白活性的测定)并且在含有XP的LB琼脂平板上分离出1800个具有phoA融合蛋白活性的单个蓝色菌落。这些菌落是用约220个库以单独形式进行18次单独的交配得到的。检测这些菌株由于获得pho-24等位基因而降低的融合蛋白活性(CS031)，这样的菌株产生phoPc表现型。然后对除phoP位点外为等基因的菌株的AP进行分析。
通过制备全细胞蛋白质提取物以及进行SDS-PAGE分析，验证这些菌株的phoPc表现型。所有带有phoPc表现型的菌株表现出预期的phoPc菌株特殊方式的蛋白质表达，即特定大小蛋白质种类的阻遏。
用受phoP阻遏的基因的基因融合体鉴别出8个菌株。如表6所示，大多数prg∷TnphoA融合蛋白的合成完全受pho-24等位基因的阻遏。两个座位的融合蛋白活性完全被阻遏，而其他座位仅显示部分受阻遏。在phoPc菌株中pag的表达比在细菌被巨噬细胞吞噬之后观察到的表达低5-10倍，这暗示着当在酸性巨噬细胞吞噬体内pag被最大程度地激活时，某些prg座位受阻遏程度更大。
与phoP-菌株(表7)相比在带有野生型phoP座位的菌株(表7B)中prgB-phoA融合体的值更低，表示phoP存在时有某些程度的阻遏。
表6等位基因PhoP-phopc受阻遏倍数prgA1∷TnphoA29 74prgB1∷TnphoA 137275prgB2∷TnphoA77194prgC1∷TnphoA14 1 14prgE1∷TnphoA21 54prgE2∷TnphoA34 66prgE3∷TnphoA25 64prgH1∷TnphoA92 2 46在表6中，将phoP座位突变对prg-pho融合蛋白活性的影响进行比较。phoP-表示被检测的菌株含有phoP12等位基因(CS030)并且phopc表明所分析菌株含有pho-24等位基因(CS031)。该值是从静止期培养物计算。这些数值表示的是在三个不同情况下进行试验的代表值并且代表如上文所定义的AP活性单位。
表7A菌株等位基因 饥饿培养基 丰富培养基IB010 prgB1∷TnphoA21 26IB040 prgB1∷TnpnoA 7 181CS119 pagC1∷TnpnoA 1263102表7B菌株等位基因 好氧微好氧 厌氧IB010 prgB1∷TnphoA 33 777 1521IB040 prgH1∷TnphoA 14285 41CS119 pagC1∷TnphoA 431 17381表7C菌株等位基因 pH4.5 pH7.0IB010 prgB1∷TnphoA332 26IB040 prgH1∷TnphoA 8 18CS119 pagC1∷TnphoA145 27
表7显示环境条件对prg座位体外调节的影响。表7A显示饥饿对prg和pag表达的影响。饥饿培养基(N-C-P-)(17)含有0.04％葡萄糖，10mM NH4Cl，以及1mM NaH2PO4·H2O。在生长48小时之后测出饥饿培养的融合蛋白活性(OD600)＝0.5)而丰富培养基(LB)上培养的融合蛋白活性是在对数生长后期测出的(OD600＝1.0)*。所有培养物都是在好氧状态生长的。
表7B显示氧压对受phoP激活以及受phoP阻遏的基因表达的影响。在生长24小时之后，将在好氧条件丰富培养基上培养的静止期时的表达(OD600＞1.4)、微嗜氧条件(OD600＝0.8)以及含有80％N2，10％O2，以及10％CO2的严格厌氧条件下的表达进行比较。
表7C显示pH值对prg和pag座位的融合蛋白活性表达的影响。对在用柠檬酸钠缓冲至不同pH值的LB培养基上生长至对照生长期(OD600＝0.5)的培养物检测其表达情况。所有数值代表上文定义的AP活性单位。
prg∷TnphoA座位的染色体定位对prg∷TnphoA与具有随机间隔开的Tn10Δ16Δ17插入的菌株的连锁性进行分析以便测定其染色体定位并且测定prg∷TnphoA等位基因是否不连锁的座位。prg∷TnphoA插入物位于5个不同连锁群中。三个等位基因，prgE1-3∷TnphoA，与AK3091的Tn10Δ16Δ17插入物具有相同的连锁性(26％)，并且其他两个等位基因，prgB1-2∷TnphoA，与AK3190(94％)，AK3249(89％)以及AK3186(50％)的Tn10Δ16Δ17插入物的连锁相似。发现另一个等位基因prgH1∷TnphoA与AK3304菌株的Tn10Δ16Δ17插入物具有37％连锁。另外两个Prg等位基因与所测试菌株没有连锁性。利用TnphoA的一部分作为探针，采用Southern杂交分析法对这两个菌株的染色体DNA进行分析，并测定出与TnphoA插入物邻近的位点的大略的物理图谱。这些等位基因，prgA和prgC，在TnphoA插入物周围有不同的限制性核酸内切酶位点。另外，在具有pho-24突变的菌株中prgA和prgC融合蛋白活性受阻遏程度也不相同；prgC完全被阻遏，而prgA仅部分被阻遏，表明这些座位是不同的。因此，鉴别出了在phoPc表现型中受阻遏的编码包膜蛋白的五个不连锁位点。
尽管鉴别出了与转座子插入物相连锁的三个prg座位，Tn10Δ16Δ17插入物中没有一个具有已知的图谱位置。用XbaI限制性核酸内切酶消化以及脉冲凝胶电泳(PFGE)对这些转座子插入物中的两个，AK3249和AK3304，的物理图谱位置进行分析。由于Tn10Δ16Δ17含有单-XbaI位点，可将这些Tn10Δ16Δ17插入物分配到已知图谱位置的特定XbaI片段中(Liu等人，1992，J.Bacteriol.17416622)。AK3249被分配到28-32染色体小片处，而AK3304被分配到58-78染色体小片片段的任一末端。对那些区域内的已知标物进行进一步的P22转导。发现AK3249菌株的Tn10Δ16Δ17插入物以及prgB1∷Tn-phoA不与TN3061菌株的Tn10插入物相连锁(与dcp的连锁为10％)，该TN3061菌株在28染色体小片处具有转座子插入物，或者不与SH7782菌株在32染色体小片处的ompD∷Tn5插入物连锁。发现prgH1∷TnphoA与TT520菌株59染色体小片处的sr1202∷Tn10插入物连锁十分微弱(＜0.1％)。这些资料表明，在沙门氏菌染色体上prg不连锁，这与phoP/phoQ具有全体调节子的功能相一致。
用具Tn10Δ16Δ17插入物的菌株库(Kukral等人，1987，J.Ba-cteriol.1691787，引入本文作为参考)进行连锁分析测定在受phoP-阻遏的基因中TnphoA插入物(prg∷TnphoA)的染色体定位。将带有TnphoA插入物的细胞涂布于含有10μg/ml四环素和40μg/ml XP的LB琼脂平板上。然后将于具有Tn10Δ16Δ17插入物的菌株中生长的P22裂解液用多头接种器点印到平板上。在接种过夜之后，寻找蓝白色混合菌落以讨论该平板的连锁性。通过在含有Tn10Δ16Δ17菌株与含有TnphoA插入物菌株之间进行单一转导杂交而证实连锁存在并对其定量。在对Tn10Δ16Δ17编码的四环素抗性进行选择之后，对菌株蓝色的损失以及TnhoA编码的卡那霉素抗性进行分等级。发现某些TnphoA菌株与具有未知图谱定位的Tn10Δ16Δ17菌株相连锁。利用XbaI限制性核酸内切酶消化后进行PFGE分析而作出两种Tn10Δ16Δ17插入物的物理图谱。基于该物理图谱，如果需要，可采用P22噬菌株转导测出其他转座子插入物的连锁性。
按照Mekalanos，1983，Cell 35253(引入本文作参考)，利用蛋白酶K替代链霉蛋白酶制备染色体DNA。采用标准方法纯化质粒DNA。根据制造商推荐方法(New England Biolabs)完成限制性核酸内切酶消化。采用本领域内已知的Southern方法将在琼脂糖凝胶上进行了电泳的DNA转移到Genescreen Plus膜上(New England Nucl-ear/Dupont，Boston，MA)用于印迹杂交。采用冰冻-压榨(freeze-squeeze)方法(Tautz等人，1983，Anal.Biochem.13214)从琼脂糖凝胶上纯化DNA探针并采用随机引物方法(Feinberg等人，1983，Anal.Biochem.1326)用[32P]dCTP对其进行放射性标记。
从TnphoA融合体克隆基因利用下文中描述的方法将编码prgH的基因进行克隆。含有prgH基因的pIB01质粒已于1993年7月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，并且收到了ATCC保藏号为ATCC 75496。图5显示了prgH的部分DNA序列(SEQ ID No3)。图9显示整个prgH基因的定位和序列。
可用本领域内已知方法(Beattie等人，1990，J.Bacteriol.1726997)将本文中描述的已由TnphoA插入物识别的基因进行克隆。用限制性酶例如BamH1对含有prg∷TnphoA基因融合体的各个菌株的染色体DNA进行消化，BamHI在TnphoA的单一位点处切割，保持融合连接、phoA序列和neo基因。同样，用相同酶对质粒pUC19进行消化。在15℃将经消化的染色体和质粒DNA过夜连接。并转化到感受态大肠杆菌中。将转化体置于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上，以便选择pUC19的bla基因以及TnphoA的neo基因。然后利用上文中描述的标准方法，例如SEQUENASER(Unitid States Biochemical)试剂盒对含有prg∷TnphoA基因融合体的染色体DNA进行测序。将对应于质粒DNA序列的通用引物(United States Biochemical)或者对应于TnphoA的71-86位碱基的TnphoA引物(5′-AATATCGCCCTGAGCA-3′)(SEQ ID No4)用作引物。
为了克隆该野生型基因，可使用TnphoA序列两侧的染色体DNA片段，以及上文描述的方法，筛查野生型沙门氏菌菌株ATCC10428的粘粒基因库，用于进行野生型pagC的克隆。
prq座位的环境调节由于phoP/phoQ是对环境应答的调节子，检测不同生长条件对prg∷TnphoA表达的影响。在所有条件下具有prg∷TnphoA插入物的菌株的生长速率相当于野生型细菌。当细菌在丰富(LB)培养基上生长时所有prg座位的表达在对数生长晚期为最大。这样的一个例子是在表7A(丰富培养基和静止生长)和表7C(pH7.0对数期)中对prgH∷TnphoA表达进行的比较。由于在饥饿状态(仅达到一次最大值OD600＝0.5)和静止生长期时pag座位的表达是最大值，这与pag表达和prg表达之间的相互关系相一致。对饥饿状态下prg座位的表达进一步分析证实了这种相互关系(表7A)。在饥饿状态下prgH的表达受阻遏(表7A)，其他prg受到最低程度的影响，这种情况与细菌在饥饿状态中能诱导pag表达正好相反(表7A)。
由于其具有介导细菌内吞(BME)的作用，氧压在丰富培养基上对pag和prg表达的影响也被检测(表7B)。在不同氧压生长时发现pag和prg座位的调节是不同的但不是相互调节。尽管在不同氧压下生长时pagA和pagB座位受到的影响最小，但当细菌在无氧条件下生长与有氧条件下生长时相比，pagC毒力座位的表达约被阻遏5倍(表7B)。还注意到prg座位在应答无氧生长条件时表达发生的变化。在无氧生长时prgH座位被阻遏3倍，而在无氧条件下另一座位prgB被诱导将近50倍(表7B)。在生长培养基上不同的氧压使其他prg座位在融合蛋白表达中的变化最小。
低pH条件对prg表达也有不同影响(表7C)。在如前面已知的，酸性条件下诱导出pagC融合蛋白活性的表达。当细菌生长至对数生长中期时，在低pH值的培养基中，没有观察到显著地诱导出对prgH表达的相对阻遏(表7C)，而当细菌暴露于低pH条件时，prgB的表达被诱导出。因此，在不同环境条件下最大程度表达的位点都可以被phoPc表现型阻遏。
根据Foster等人，1990，J.Bacteriol.172771(引入本文作为参考)的方法检测酸性敏感性。将细菌于37℃，E培养基和0.4％葡萄糖中有氧生长至OD600为0.5。通过加入1M盐酸而将细菌培养物的pH值降至将近3.3。立即取一份样品(t0)，将其余的培养物在37℃进一步培养，并在40分钟(t40)和80分钟(t80)时间点进行后来的取样。培养物的pH值保持在近3.3。用冷PBS将样品稀释1∶10，用普通盐水洗涤并悬于其中，然后制作系列稀释液进行平板培养观察菌落形成单位。
prgH是鼠伤寒沙门氏菌的毒力座位由于phoPc表现型导致毒力减低并且抑制了将近20种蛋白质的合成，因而对prg座位的单个突变的菌株的毒力进行检测(表8)。通过将约150个细菌腹膜注射到BALB/c小鼠中而筛查prg∷TnphoA插入物菌株的毒力的损失。还用野生型细菌作为对照。与野生型细菌相比，用prg突变菌株观察到临床疾病进展的时间过程明显延长。用含有prgH1∷TnphoA插入物的菌株腹膜注射的小鼠在约10-14天时，产生了伤寒的临床症状，例如“颈背”表现型(发烧和立毛)以及肝脾肿大，而野生型细菌约为24小时。尽管疾病演变时间过程延长，最后所有鼠死亡。用含有prg∷TnphoA插入物的其他菌株注射的小鼠的疾病的演变显示与野生型细菌相似的疾病发展过程。
表8腹膜注射 LD5014028s 野生型 ＜10IB040 prg81 5.6×101CS015 phoP-102 6.7×105IB041 prgH pnoP-102 1.2×101口服接种14028s 野生型 6.5×104IB040 prgBI 6.5×105
表8显示prgH1∷TnphoA突变对沙门氏菌鼠毒力的影响。菌株是等基因的并且通过腹膜注射和口服接种将菌株施用给35天龄的BALB/c小鼠。在括号中列出了对于每个等位基因接近LD50的细菌稀释液时使用的动物数。在三个不同情况下重复测定LD50。
进一步检测含有prgH突变的菌株的LD50值。测出prgH突变体具有的LD50约为60个细菌，而野生型菌株的值＜10。由于在小剂量时对小鼠准确施用细菌有困难，因而构建在prgH和phoP都发生突变的菌株。与一种等基因的pho-菌株CS015相比，prgH-phoP-菌株的LD50增加了10倍以上(表8)。两种突变的组合效果进一步证实了prgH1∷TnphoA突变减低了鼠伤寒沙门氏菌的毒力，并表明，对受phoP/phoQ调节的基因表达的两个阶段有影响的突变对毒力的影响是相加的。当以口服途径施用时，也对具有prgH1∷TnphoA插入物的菌株的毒力进行检测。观察到毒力降低了10倍(LD50增加)(表8)。
用野生型细菌进行竞争性试验，对具有prgH1∷TnphoA插入物的菌株在穿越粘膜障碍层时的效率作进一步分析。在用突变细菌进行口服接种开始的72小时期间，与相应的对照试验相比，从小鼠的血液中没有回收到prgH1∷TnphoA突变体，在所述对照试验中，从用野生型细菌接种的小鼠的血液中象通常一样分离到了细菌。还对通过口服途径施用的具有prg突变的菌株的毒力缺失进行了检测，但没有观察到毒力有显著变化。
按如下所述对鼠毒力进行研究。将细菌在有氧条件下，37℃生长至静止期，用LB进行洗涤，并稀释于普通盐水中。从CharlesRiver Breeding Laboratories，Inc.(Wilmington，MA)购买35天龄的雌性BALB/c小鼠(16-18克)。以0.1-0.15ml的接种量将盐水中稀释的细菌样品腹膜内注射。用一个2英寸长的，18口径不锈钢动物口服饲喂注射针(Harvard Apparatus，Inc.，South Natick，MA)将细菌以0.5ml团丸形式口服施用给已禁食2小时并用2-溴-2-氯-1，1，1-三氟乙烷(Halothane)温和麻醉的小鼠。通过置于LB琼脂平板上计算cfu/ml数而定量测出施用的细菌数。采用标准方法(Reed和Muench，1938，Amer.J.Hygiene 27493)测出小鼠的50％致死量(LD50)值。重复测LD50值三次。按如上所述将细菌口服施用给小鼠之后进行竞争性检测。在1-4天时从尾巴取血或心脏内穿刺的50μl血液立即平板培养并在LB液体培养基37℃过夜生长之后估测菌血症。在1-6天取出脾脏和肠，并将这些器官在3ml的0.9％NaCl中匀浆化。将样品进行系列稀释并平板培养。根据在Hektoen-enteric琼脂上(Difco Laboratories)进行的特征性生长(黑色菌落)以及用沙门氏菌兔血清B组(抗原4，5，12)(Fisher Scientific)进行肉眼目视的玻片凝集试验而对鼠伤寒沙门氏菌进行验证。
在氧诱导的基因中发生突变不影响鼠毒力已证明prgH和pagC座位是受无氧生长阻遏的并且是足够毒力所需要的，因此暗示着从无氧到有氧条件的变动具有作为诱导毒力基因的总信号的作用。构建在氧诱导性座位发生突变的菌株(Aliaba-di等人，1986，J.Bacteriol.165780)。制备了具有oxiA、oxiC、和oxiE突变的ATCC14028s衍生物(分别被称为CS032、CS033、CS034)。这些菌株的毒力与野生型细菌相同。尽管这些融合基因仍有含有毒力基因的操纵子的特征，这些数据暗示这些位点对于完整毒力并不是必需的，并且氧诱导作用并不总是与毒力功能相关联的。
prgH突变体在巨噬细胞内具有正常生存力由于phoPc表现型导致巨噬细胞内细菌存活性欠缺，对该突变对prgH编码的蛋白质合成的影响进行检测。对具有prgH1∷TnphoA插入物的菌株在由BALB/c小鼠骨髓得到的巨噬细胞内以及一种巨噬细胞衍生的细胞系J774.2细胞内生存能力进行测定。没有观察到胞内生存力的缺失。还对具有prgB1∷TnphoA插入物的菌株进行检测并且没有发现在巨噬细胞内存活性受损。
按照Buchmeier al.，1989，Infect.Immun.571(引入本文作参考)的描述，对细菌在巨噬细胞内存活性进行检测。在普通鼠血清中将生长至静止期的细菌进行调理30分钟，然后置于从BALB/c小鼠收集到的骨髓细胞衍生的巨噬细胞培养物中。感染一小时之后，加入庆大霉素10μg/ml以便杀细胞外细菌。在所有时间点(1、4和24小时)都检测三次，并重复进行三次实验。
从Charles River Breeding Laboratories购买的BALB/c小鼠收集骨髓巨噬细胞培养物。将J774.2巨噬细胞培养于添加了10％胎牛血清的Dulbecco′s基本必需培养基(DMEM/10％FBS)中。
prg∷TnphoA插入物没有抑制phoP突变体的表现型在加入prg∷TnphoA突变以后对phoP突变体的几种表现型，包括防卫素以及酸敏感性以及鼠毒力减弱的抑制进行测定。为了检测phoP突变对抑制prg产物合成的能力，构建除prg∷TnphoA突变外为等基因的phoP突变菌株，并检测对鼠毒力，而这种抑制包括毒力减弱，或对酸和防卫素敏感性降低。prg∷TnphoA插入物对phoP-细菌毒性表现型没有影响。这些结果表明，所检测的prg∷TnphoA突变对作为单一突变的phoP无效表现型没有抑制作用。
prgH和phoPc突变体缺失了细菌介导的培养的上皮细胞的内吞作用对prg∷TnphoA和phoPc鼠伤寒沙门氏菌菌株的BME进行检测。下列结果(本文描述)暗示prg基因可能参与由细菌介导的真核细胞的摄取证明prgH1∷TnphoA定位于细菌染色体的59′处，在该位点处群集了侵入所必需的其他基因；在口服之后开始的72小时，prgH突变没有与野生型细菌就到达小鼠血液中进行竞争的能力；并且在无氧生长条件下，一个Prg位点，prgB的表达被强烈地诱导。具有prgH和pho-24突变的菌株与野生型细菌相比，其诱导被Madin-Darby犬牙肾(MDCK)极化的上皮细胞的摄取的能力显著降低(p-值＜0.01)。具有TnphoA插入物的其他prg菌株没有显示在上皮细胞的BME方面具有统计学意义的显著的缺损(表9)。根据施用庆大霉素以前与细胞相关的cfu/ml(表9)并采用显微镜观察的测定，缺失BME的菌株的吸附性不受prgH∷TnphoA插入物的影响。
为了分析细菌的粘附性以及上皮细胞对细菌的摄取作用，将细菌菌株在37℃，没有振荡(微有氧)条件下生长至终浓度为约2×108个菌落形成单位(cfu/ml)。以105MDCK细胞/孔的量培养于24-多孔组织培养平板上进行分析。在没有抗菌素的DMEM/10％FBS；5％CO2/95％空气环境下，37C将细胞培养过夜，直至＞80％融合。根据Lee和Falkow的方案(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 874304，引入本文作为参考)对粘附性吸入侵性进行检测。
表9菌株基因型 粘附性 侵入14028s 野生型 4.2％ 3.8％SM7Strrsmb ---0.6％*CS119 pagC1∷TnphoA ---1.9％IB005 prgA1∷TnphoA ---7.6％IB010 prgB1∷TnphoA ---2.9％IB020 prgC1∷TnphoA ---1.5％IB025 prgE1∷TnphoA ---1.9％IB040 prgH1∷TnphoA 5.7％ 0.1％*CS022 pho-24 1.9％ 0.06％*IB043 pWKSH5 in IB040---17.5％*IB044 pWKSH5 in CS022---0.09％*表9显示了prg∷TnphoA插入物对沙门氏菌介导的MDCK上皮细胞的内吞作用的影响。评估微氧生长的细菌菌株其粘附性和侵入性的变化。测出的粘附性是离心之后并且在4℃保温30分钟后粘附在细胞上的细菌数/加入到每个孔中细菌总数的百分数。测出的入侵性为用庆大霉素培养2小时之后侵入的细菌/加入到每个孔中细菌总数的百分数。就吸附性和侵入频率而言，野生型鼠伤寒沙门氏菌和野生型肠炎沙门氏菌CDC5菌株没有差异。星号(*)代表对三个重复获得的侵入性数据与野生型相比进行方差分析时，从统计学上说有显著性(p-值＜0.01)。
用PBS对汇合的MDCK单层洗涤三次，然后将0.9ml的冷DMEM/10％FBS加到各个孔中。在LB中洗涤细菌并重悬于等体积的DMEM/10％FBS中。每孔中约加入5×107个细菌。在4℃以500rpm将平板旋转10分钟，然后在4℃培养30分钟。通过用磷酸盐缓冲(PBS)将平板洗涤三次，将上皮细胞在0.5ml的1％Triton-X-100/PBS中裂解并置于LB琼脂平板上培养计算cfu/ml而回收到粘附细菌。将在盖玻片上生长过夜的被细菌感染的上皮细胞单层用1μg/ml 4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色7分钟也对吸附性的形态学进行评估。使用Leitz Laborlux 12显微镜对这些DAPI染色的盖玻片进行荧光和相差显微镜术检查。
如上文描述，在细菌吸附以后对侵入或细菌介导的内吞作用(BME)进行评估。将含有细菌和上皮细胞的平板于37℃，5％CO2/95％空气环境中培养2小时。用PBS将每个孔洗三次以除去没有与细胞结合的细菌。然后加入补充了10μg/ml庆大霉素的DMEM/10％FBS，以杀死胞外细菌。在培养90分钟之后，用PBS洗涤细胞单层三次并加入0.5ml 1％TritonX-100/PBS并强烈地吹吸使存活的胞内细菌释放。以缺乏侵入性的肠炎沙门氏菌突变体和肠炎沙门氏菌的侵入性临床野生型分离株用作为BME的对照。通过置于LB琼脂平板上培养计算cfu/ml而对存活细菌进行定量检测。所有检测设置三个重复并至少重复三次。
将传代了40-58次之间的MDCK上皮细胞用于使细菌吸附性和入侵性达到最大值。将上皮细胞系于DMEM/10％FBS和1％青霉素/链霉素溶液，37℃，5％CO2气体中培养。
为了分析细菌防卫素敏感性，根据本领域已知方法(Selsted等人，1985，J.Biol.Chem.2604579；Selsted等人，1984，Infect.Immun.45655)从兔腹膜嗜中性粒细胞中纯化NP-1防卫素。通常，溶于100μl体积的0.5％胰蛋白胨中的105个细菌于37℃与50-100μg防卫素/ml接触2小时。将反应在0.9％NaCl中稀释而将反应终止。将合适的稀释液进行平板培养，以便测出存活细菌的cfu/ml。对于每个菌株至少分析两次，每次设置二个重复。用敏感性(phoP-)和抗性(野生型)菌株进行检测作为对照。
prqH图谱分析利用连锁性分析对prgH相对于59染色体小片处的其它入侵座位的位置进行测定。P22转导连锁分析表明，AK3304菌株的Tn10Δ16Δ17与invA(40％)和prgH(37％)具有相似的连锁性；但是invA与山梨糖醇不相连。发现prgH1∷TnphoA插入物与EE517的转座子插入物(99.6％)连锁，EE517菌株具有与hil的Tn5B50-378插入物相邻接的8.5Kb片段缺失。
制作IB037菌株的TnphoA插入物周围的限制性核酸内切酶位点的物理图谱(图4)，结果显示，与已知的invA-E区域的限制性核酸内切酶图谱没有相似性。然后以含有克隆的inv和hil DNA的质粒用作探针，对野生型ATCC10428s和含有prgH1∷TnphoA插入物的IB040细菌的染色体DNA进行Southern杂交分析。当以含有与invA-E高度连锁的其他入侵座位(invH、invF和部分invG)的质粒用作探针时，发现野生型细菌和IB040菌株之间的杂交类型没有差异，表明prgH不定位于inv区域。但是，当以hil的含有Tn5B50-380插入物下游的5 Kb区域的质粒作为探针时，证明prgH1∷TnphoA插入物定位于该区域。通过采用Hil座位的已知限制性图谱(Lee等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891847)以及TnphoA的已知限制性核酸内切酶位点，进一步限定该区域的物理图谱和该区域内prgH1∷TnphoA的相互关系(图4)。prgH1∷TnphoA插入物的定位方向使phoA融合蛋白的转录方向与Tn5B50插入物的方向相反，Tn5B50插入物提供hil表现型，并且含有组成型新霉素启动子，该启动子是从转座子外转录的(图4)。虽然发现prgH定位于hil座位内，该基因是独特的，以相反方向转录并且与该hil座位内识别出的任何其他基因不相同，prgH是受phoP调节子调节的。
由于表达可被Tn5B50-380插入物改变的一种蛋白质可能改变prgH的表达，构建含有两种插入物的菌株并且在不同环境条件下比较prgH-phoA融合蛋白活性。当细菌处于饥饿状态或者无氧生长时，观察到融合蛋白活性被脱阻遏。表11显示Tn5B50-380插入物对prgH融合蛋白活性表达的影响。
表11菌株 等位基因饥饿 LB(有氧) LB(无氧)IB040 prgH1∷TnphoA 5 14241IB042 Tn5B50-380 46 248227prgH1∷TnphoA这些资料证实，即使prgH转录与Tn5B50-380编码的新霉素启动子方向相反，Tn5B50-380插入物提高了prgH表达。饥饿状态(prg的阻遏条件)表示在含有0.04％葡萄糖，10mM NH4Cl和1mMNaH3PO4·H2O的饥饿培养基(N-C-P-)上细菌有氧生长48小时。LB(有氧)表示细菌在Luria-Bertani液体培养基(丰富培养基)上生长至对数生长晚期(非阻遏条件)(OD600＞1.0)。LB(无氧)表示细菌在严格无氧条件下生长24小时(OD600＝0.6)。所有数值代表如上所述的AP活性单位。
为了排除这样的可能性，即prgH突变体的BME缺损是所产生的phoA融合蛋白造成的假象，用含有包含hil和prgH座位的5.1KbHindIII片段的质粒(pWKSH5)进行互补性分析。该质粒与prgH(IB040)和phoPc(CS022)突变细菌相杂交，分别产生了IB043和IB044菌株。prgH突变体的BME表现型与具有同样质粒插入物的野生型相类似。该质粒不能互补phoPc突变体的BME表现型。这些结果表明，由于prgH∷TnphoA插入物导致在合成中发生改变的一种基因产物对BME是必要的。
利用具有能组成型地刺激pag的环境活化的phoP/phoQ座位突变的菌株(表现型phoPc)，限定了五个编码包膜蛋白的独特的受phoP阻遏的位点。发现受phoP阻遏的基因(prg)在染色体上被远远地分开，并且在饥饿条件下prg座位的表达被阻遏，这时pag座位被诱导(表10)。
表10环境pagprg培养基 饥饿培养基 丰富培养基O2有氧-pagC 有氧-prgH无氧-prgBpH 3.3-5.5 3.3-5.5-prgB＞6.0-prgH哺乳动物细胞 巨噬细胞上皮细胞证明prgH位于提供hil表现型的两个Tn5B50插入物之间。由于已证实该区域的缺失突变也具有缺损的BME，并且prgH突变体的BME缺损可用含有该座位的质粒互补，因而可能没有由于prgH1∷Tn-phoA插入而导致合成的一种蛋白质促进了BME(图4)。
与微氧条件下对hil表现型所必需的基因将被诱导(与prgB相似)的预期相反，在有氧生长期间prgH表达达到最大值并且导致hil表现型的Tn5B50-380插入物使prgH表达脱阻遏。另外，由prgH1∷TnphoA插入物预示的转录方向与Tn5B50-380编码的新霉素启动子(与hil表现型相关)的转录方向相反，这意味着由Tn5B50-380插入物阻断的或由此转录的一种调节蛋白影响了prgH的表达。
基于下面这一现象，即含有prgH(hil)的一种质粒pWKSH5不弥补phoPc细菌的BME，因而可能其它入侵基因也可受phoP/phoQ调节。如果prgH是从pWKSH5表达的，尽管存在有pho-24突变，这意味着作为phoPc表现型一部分的被阻遏的其他基因对BME是必需的。
对prgH进行的鉴定和定性表明，phop/phoQ以相反方向调节细菌进入或生存于哺乳动物细胞中所必需的因子，还表明基因调节对细菌毒力的重要性。对prg座位的鉴别可用于研究在感染哺乳动物细胞之后细菌基因的调节作用。对毒力基因的调节作用的理解，例如prgH，也可用于减低病原细菌的毒力，用于研制新的伤寒活疫苗。
prg基因对毒力的作用当以口服和腹腔途径施用鼠伤寒沙门氏菌时，发现该prg座位，prgH，对鼠毒力起作用。进一步发现prgH以及phoPc突变缺失了细菌介导的被上皮细胞的摄取的能力，这意味着缺乏穿越上皮细胞障碍层的能力可对所观察到的毒力的降低有作用。对口服摄入细菌之后的小鼠进行竞争性研究进一步支持了prgH突变体缺乏穿过肠上皮细胞障碍层的转胞吞作用。因此，定义了对细菌毒力所必需的至少两个受phoP/phoQ调节的蛋白质的表达阶段。在一个阶段中，prg的表达促进了细菌介导的上皮细胞的内吞作用(表10)，而另一阶段中，pag表达促进了在巨噬细胞内的存活力。
全身性病原菌，例如沙门氏菌，遇到的环境比粘膜病原菌所遇到的更复杂和更具变化性。pag和prg表达达到中间状态对感染周期某一阶段的毒力是必需的。与该概念相一致的是在不同氧压和pH条件下生长时观察到的pag和prg表达没有均一性。这些资料也表明不是所有pag和prg的调节直接受phoP和phoQ介导的。如果phoP具有作为转录调节子的功能，prg座位的阻遏可能出现在转录水平中。
采用对受pho-24突变阻遏的基因限定的方法，发现了至少一个毒力座位，prgH，该座位被诱变降低了用于制作菌苗的细菌的毒力。
两种成分调节系统的组成型表达使细菌毒力减弱通过诱导一种突变，该突变导致基因在双成分调节系统控制下进行组成型表达，或者通过诱导一种突变，该突变使处于双成分调节系统控制下的基因失活，可以减低细菌毒力。在处于双成分系统控制的基因表达之间，例如pag和prg基因表达之间，以及在受双成分系统调节的基因和其他基因之间达到平衡对完全的毒力是必需的。打破这种平衡的突变，例如，引起处于双成分系统控制之下的基因进行组成型表达的突变，或者使处于双成分系统控制之下的基因，例如pag基因失活的突变，降低了毒力。
通过使用含有一个报道基因与受双成分系统调节的基因的融合体的菌株可以鉴别双成分调节子中的组成型突变。这样的基因融合体最典型的情况包括编码lacZ基因或与受双成分系统控制的一种基因融合的AP的DNA。根据酶的生色底物产生的颜色增加可检测到含有一种融合体的菌株，该融合体以不受调节的方式即组成型地高度表达(与野生型或亲本菌株相比)。为了检测组成型突变，对克隆的毒力调节子进行诱变，例如可通过在缺乏DNA修复能力的大肠杆菌菌株中传代一次或者采用化学诱变法。然后将突变DNA调节子转移到含有该融合基因和根据融合基因的高表达效果而鉴定的组成型突变(对于在含有X-gal培养基上生长的lacz融合为蓝色)的菌株中。在对其他组成型突变进行测序并鉴别出造成组成型表现型的一种特定氨基酸改变之后，也可以采用体外诱导方法制备双成分调节系统中一个成分的组成型突变。安排几种都产生phoP组成型表现型的氨基酸变化可使通过自发碱基突变的回复突变频率降低。通过含有磷接收区域的磷接受调节子的氨基末端一部分缺失，例如在phoP基因中为氨基末端至119位氨基酸编码的序列缺失，或者在其它双成分调节系统中的基因中类似的磷接受序列缺失，也可以构建组成型突变。这可能会导致类似于磷酸化作用诱导的构象变化，并导致DNA结合和转录活化提高。
毒力减低在phoP/phoQ调节子发生缺失如上所讨论的，phoP调节子对沙门氏菌完整毒力是必要的。该调节子是由定位于操纵子中的两个基因phoP和phoQ，以及被它们正和负调节(分别为pag和prg)的40多个基因组成的。
在伤寒BALB/c小鼠模型中研究，证实了phoP无效鼠伤寒沙门氏菌突变体的毒力被显著降低并且它们也是有效的菌苗菌株。这种表现型可能是多个被phoP活化的毒力基因产生的，因为已经分别证明在多个不同的受phoP激活的基因中转座子的插入可降低鼠伤寒沙门氏菌毒力。在鼠模型中，缺失了对芳香族氨基酸所必需的基因的鼠伤寒沙门氏菌突变体(aroA无效或者aroC/aroD无效突变体)的毒力也被明显降低。但是，在人体中检测aroC/aroD突变体显示，虽然这些菌株有免疫原性，将低至105-107细菌的剂量作为单次口服量施用时仍发现了菌血症和副作用，例如发烧，(J.Clin.Invest.90412-420)。
现在已经发现沙门氏菌毒力的全能调节子，例如phoP/phoQ操纵子，发生大的缺失可显著降低细菌的毒力。在鼠伤寒沙门氏菌中首先制备phoP/phoQ座位内1Kb的DNA缺失的突变，随后通过同源重组转移至伤寒沙门氏菌中。为了在构建这种菌苗时使其具有更大安全性，在对芳香族氨基酸必需的基因发生了缺失并且携带组氨酸G46突变的菌株中制造一种突变，该组氨酸G46突变使细菌成为组氨酸缺陷型细菌。得到的菌株伤寒沙门氏菌TyLH445，比现存的菌苗候选物有几种优点，最显著的是，没有瞬时菌血症的免疫原性。
使用本发明的沙门氏菌细胞可用作在动物例如哺乳动物例如人中，抵抗疾病例如伤寒和相关疾病的免疫源，尤其是作为能够在接种动物的肠中繁殖并激发强免疫反应的活细胞菌苗的来源。这样一种活的减毒的疫苗的合适施用剂量和条件是本领域内已知的，例如Hol-em等人的描述，Acute Enteric Infections in Children，NewProspeets for Treatment and Prevention(1981)Elsevier/Nor-th-Hlland biomedical Press，Ch.26，PP.443 et seq.(Levine等人)，引入本文作参考，并在下面实施例进一步描述。
优点本发明的一个优点是由于发生了直接影响毒力代谢途径的突变，即phoP/phoQ操纵子，细菌细胞毒力被降低。另一优点是细菌细胞在两个完全不同的减毒基因，即芳香族氨基酸合成途径(Aro)以及在对沙门氏菌毒力重要的操纵子(phoP/Q)中发生了突变。结果，细菌毒力被大大地减低了；高至1×109cfu的剂量仍十分安全。在研制中的其他菌苗，例如CVD908，在低至1×107cfu剂量时引起许多全身性症状，例如发烧或菌血症。
除了phoP/phoQ缺失以及AroA突变以外，本发明的细菌还含有进一步改变其毒力的组氨酸突变，虽然没有组氨酸突变可提高免疫原性。本发明的细菌细胞是到目前为止最有前途的候选菌苗，因为他们免疫性强并且安全，即毒力大大降低。
实施例1菌苗菌株的构建本发明的细菌细胞是通过在phoP/phoQ调节子中缺失约1Kb DNA而制备的。
利用本领域内已知方法构建phoP/phoQ缺失的自杀载体。利用野生型鼠伤寒沙门氏菌染色体DNA作为模板，通过PCR获得含有phoP/phoQ座位的DNA片段。对位于phoP/phoQ座位两侧的PCR引物进行遗传工程处理，使之含有末端限制性酶识别位点，例如EcoRI的识别位点，以便利后面的克隆。在进行扩增之后，用EcoRI对PCR产物进行消化，并克隆到高拷贝载体多接头的EcoRI位点中。将含有phoP/phoQDNA片段的质粒命名为pLH356。
对phoP/phoQ座位进行序列分析和限制性图谱分析，结果显示在该座位内有4个HpaI位点；在该载体中未发现HpaI位点。为了在phoP/phoQ座位中制造内部缺失，用HpaI将pLH356 DNA完全切割，并重新连接，产生的产物从376-1322位核苷酸发生内部缺失(pLH418)。通过将该质粒进行限制性消化可证实这一缺失。
利用位于该载体的多接头区内的SacI/SphI限制性位点从pLH418中切除含有内部缺失phoP/phoQ座位的DNA片段。将该片段克隆到质粒CVD442中的相应位点，该质粒携带sacB基因以便对等基因交换进行阳性选择。得到的自杀载体被称为pLH423。
将pLH423转化到大肠杆菌λpir SY327，并且随后转化到大肠杆菌λpir SM10(LH425菌株)。将大肠杆菌LH425菌株与鼠伤寒沙门氏菌CS019菌株进行交配。通过置于含有氨苄青霉素和氯霉素的琼脂上平板培养而选择到携带整合到鼠伤寒沙门氏菌染色体中的质粒序列的单个重组件(LH428菌株)。确证这些菌株是具氨苄青霉素抗性并且对蔗糖敏感，即在不含有NaCl的20％蔗糖平板上于30℃培养时死亡率为20％，这些数据证实了质粒序列整合到了沙门氏菌的染色体上。
从菌株LH428制备P22噬菌体裂解液；通过高速离心而将噬菌体颗粒浓缩20倍，并转导到伤寒沙门氏菌522Ty2菌株(在aroA基因中带有缺失，以及带有使细菌成为组氨酸缺陷型的G646突变的菌株)。通过置于补充了芳香族氨基酸，胱氨酸，组氨酸和氨芳青霉素的LB平板上培养而选择出单个重组伤寒沙门氏菌菌株(LH435菌株)。
将LH453菌株在芳香族氨基酸，胱氨酸，和组氨酸存在(但没有氨苄青霉素)下生长至对数生长中期。将系列稀释液置于没有NaCl而有20％蔗糖的LB平板以及没有NaCl的LB平板上培养。在没有蔗糖的平板上生长的细菌数比在补充了蔗糖的平板上生长的数目大三个对数值。这些资料意味着许多菌落丧失了含有sacB基因的质粒序列。
从蔗糖选择平板上挑取多个菌落，并且证明其是对氨苄青霉素敏感的并且对蔗糖具抗性。从大约10个菌落中纯化出染色体DNA，并且利用野生型phoP/phoQ的2.3Kb片段作为探针进行Southern印迹分析。
Southern印迹分析结果显示，在几个菌株中缺失了已知位于phoP/phoQ的1Kb缺失片段内的两个HpaI位点和一个XmnI位点。这些菌株之一被命名为TyLH445。
实施例2TyLH445的体外评估在体外，利用标准的临床微生物学检测方法对TyLH445进行充分定性。对TyLH445的营养需要进行评估。TyLH445在M-9平板上不能生长，除非添补芳香族氨基酸混合物，胱氨酸(有胱氨酸时伤寒沙门氏菌生长更好)以及组氨酸。这些资料证实TyLH445是AroA-，His-。
发现TyLH445与抗沙门氏菌的多克隆血清以及抗伤寒沙门氏菌Vi抗原的多克隆血清发生凝集反应。发现D组凝集反应是变化不定的，可能是由于Vi抗原过量。还发现TyLH445是吲哚阴性(如所有的沙门氏菌)，并且产生很低的硫化氢(正如许多伤寒沙门氏菌)。利用VI-TEK系统以及BBL Crystal Enteric细菌鉴别系统进行生化检测。这些资料表明，TyLH445菌株是伤寒沙门氏菌。
还对TyLH445的生长特性进行评估。发现TyLH445的生长速度与其亲代522Ty2(phop/phoQ座位完整)一样快。体外生长的检测是在37℃于添补了芳香族氨基酸/组氨酸/胱氨酸的Luia液体培养基中进行的。发现亲本和菌苗菌株的生长曲线实质上是相同的(参见图10)。
利用标准的临床检测方法测定抗生素敏感性。发现TyLH445和亲代菌株522Ty2对氨苄青霉素，三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑，环丙氟哌酸，氨基葡萄糖苷，以及第三代头胞霉素是敏感的。在亲代菌株和菌苗菌株之间检测到的抑菌圈大小(zone size)没有差异，暗示着其他抗菌素抗性机制，例如抗菌素运输系统的修饰，或者细菌细胞壁的修饰没有受伤寒沙门氏菌中导入突变phoP/phoQ座位的影响。
检测phoP/pnoQ HpaI缺失突变体对防卫素敏感性，这是一种phoP无效突变体表现型。防卫素敏感性检测按如下方法进行。
将待检测菌株的液体培养物生长过夜。然后将培养物进行1∶200稀释，并生长至光密值(OD600)约为0.2，此后，将细胞稀释到每0.05ml约为1×105个细菌的浓度。
对于每个菌株进行两个反应(1)仅有载体(溶于无菌水中的0.01％乙酸)以及(2)防卫素NP-1溶液(溶于0.01％乙酸中的70μg/ml)。加入等体积的悬于胰蛋白胨中的细菌并将检测试管于摇床中37℃培养2小时。每个反应管最终体积是0.1ml，使防卫素的最终浓度达到35μg/ml。
在细菌生长培养基，例如LB液体培养基，中存在的高盐和高蛋白浓度可使防卫素失活。因此，通过向每个管中加入900μl的Lur-ia液体培养基可终止防卫素活性。将每个试管中的系列稀释液进行平板培养，并测出对照管和每个处理菌株的管中的cfu/ml。结果以相对于每个菌株杀死的细菌的log值表示。通常，1.0-1.5log的野生型细菌被杀死。phoP无效突变一般显示有2-4.log被杀死。由于具有较慢生长速率的菌株显示对防卫素致死作用不太敏感，检测在防卫素敏感性分析中使用的每个菌株的生长速率。将具有类似生长速率的菌株进行防卫素敏感性比较。
在鼠伤寒沙门氏菌背景和伤寒沙门氏菌背景中评估HpaI的缺失。在两种背景中，缺失突变导致对35μg/ml浓度的兔防卫素NP-1具敏感性。参见图11和图13。在伤寒沙门氏菌中在phoP+和HpaI缺失的phoP无效突变体之间的差异不太明显。这一效果反映了与缺乏其它营养缺陷性的鼠伤寒沙门氏菌相比的耐性稍差的伤寒沙门氏菌较慢的生长速率。
利用与phoP活化的B基因(pagB)相融合的LacZ记录基因(record-er gene)，对具有HpaI phoP/phoQ缺失的细菌的phoP活化状态进行检测。由于用P22在伤寒沙门氏菌中的转导效率是低的，因而这些研究是在鼠伤寒沙门氏菌而不是伤寒沙门氏菌中进行的。发现在完整phoP/phoQ座位存在下，phoP激活作用是40-60 Miller单位(Mi-ller等人，1972，Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，PP.352-355)，并且在具有HpaI缺失的菌株中几乎检测不到(3cfu，参见图12)。
实施例3HpaI缺失的鼠伤寒沙门氏菌的体内评估由于伤寒沙门氏菌不是小鼠的病原菌，因而在野生型和aroA-鼠伤寒沙门氏菌中对HpaI phoP/phoQ缺失突变进行评估。用鼠伤寒门氏菌LH430，一种携带HpaI缺失的野生型鼠伤寒沙门氏菌，的各种稀释液腹膜注射到雌性BALB/c小鼠中。测出该菌株的LD50是8.2×105和8.2×106之间。(所有接收了8.2×105cfu的小鼠都存活，所有接收8.2×106cfu的小鼠都死亡)。这些数据与用在phoP/phoQ座位中携带了转座子插入物的菌株获得的LD50值相一致。
在一种相当于人菌苗菌株的鼠伤寒沙门氏菌aroA∷tet(LH481)中对HpaI phoP/phoQ缺失的免疫原性进行评估。用LH481的2.3×105和2.3×106cfu从腹膜接种小鼠(每个菌苗剂量4个小鼠)，并在30天之后用30倍的野生型细菌LD50进行攻击。除一只小鼠外，所有小鼠都存活。死掉的小鼠是在接受了较低菌苗剂量的组中。接受较高菌苗剂量的动物没有发病。
实施例4用人体进行的第I阶段研究将单口服剂量为1×105至1×1010cfu的剂量将菌苗菌株施用给人志愿者。两个志愿者各接受一种剂量；3个志愿者接受的剂量为1×108cfu/ml。在施用菌苗后不同时间点对志原者进行评估。
安全性为了检测在患者血中是否存在菌苗细菌，在服用菌苗之后4，6，8，10，12天进行细菌检查血液培养，设置一个重复。在任一志愿者中都没有检测到菌血症。
十三个成年人志愿者接受了口服单剂量逐步增加的这种新的减毒的伤寒菌苗。没有一个志愿者产生了任何种类的副反应。特别是，没有发烧，没有肠胃症状，没有全身性症状。在接受了口服疫苗之后按照预定的时间表，给志愿者施行系列血液培养，在接收菌苗之后的4天，6天，8天，10天和12天进行两组细菌检查血液培养，结果没有观察到结果为阳性的血液培养。在接收菌苗之后2个月对志愿者进行回访视诊，没有报告有后期症状。
移生(colonization)利用本领域内已知方法检测粪便样品中是否存在菌苗菌株TyLH455。在培养平板上检测初级粪便中存在的菌苗菌株。在某些情况下，通过在补充了Aro/His/胱氨酸的BBL Selenite F液体培养基中过夜培养粪便而将粪便样品中的菌苗菌株富集是必要的，以便检测到细菌。该培养基对大肠杆菌有抑制作用但能促进沙门氏菌生长。
在接收了菌苗之后，移生于志愿者中的时间在1-6天的不同时间期间。对于最高剂量(109或1010)，在接种之后开始的1-3天内志愿者有阳性初次平板培养物，而在低剂量时，仅在亚硒酸盐丰富液体培养基培养物(抑制其他肠杆菌的用于选择沙门氏菌的选择性培养基)中菌苗细菌呈阳性。所研究的志愿者中在2个月回访时没有人仍携带菌苗细菌。
表17剂量数量移生(Colonization)1052 没有1062 1-2天内2/21072 3天内1/21083 6天内1/31092 4-6天时2/2移生，两者都在1天时具有阳性的初次平板培养1010**2 3-6天时2/2移生，两者都在第1天和第2天时具有阳性的初次平板培养*通过完整细胞和LPS ELISA以及相对于Hflagellar抗原的Widal检测进行测定。在所有检测中以1∶40以及更高稀释倍数对血清进行分析。
**这些志愿者之一接受了1010个细菌剂量的加强剂量，是在初始接种后1个月时施用的(未进行血清学检定)。
免疫原性采用标准的ELISA分析法检测对菌苗菌株的免疫应答的诱导。在接受了单剂量的口服菌苗后第0，7，14，21和28天，从志愿者收集血清。用完整的细菌TyLH445和伤寒沙门氏菌LPS(SIGMA，St.Louis，MO)作为抗原完成ELISA检测。用来自每个志愿者的第0天时的血清作为内部阴性对照。以曾经感染了野生型伤寒沙门氏菌的患者的恢复期的血清(大多数来自于墨西哥)用作为阳性对照。
采用ELISA方法对抗完整菌苗细菌或抗伤寒沙门氏菌LPS的IgG抗体进行检测，结果发现几个志愿者在接收菌苗之后21天发生了血清转变。对接种菌苗以前的患者的血清(疫免前血清)进行检测，并用这些数据建立一个底线(base line)。如果在接种之后不同时间点获取的患者血清的检测结果比免疫前血清大0.2 ELISA OD单位，则可认为是阳性。
其他实施方案其他实施方案，例如在phoP/phoQ调节座位中仅含有一个突变而减低毒力的沙门氏菌菌株，以及除含有phoP相关的突变或遗传变化外，还在另一个基因，例如cya基因(腺苷酸环化酶)或crp基因(腺苷酸环化酶受体)，中含有减毒突变的菌株，都在本权利要求范围内。
序列表(1)综合资料(i)申请人Miller，SamuelI.
Mekalanos，John J.
(ii)发明名称沙门氏菌菌苗(iii)序列数目15(iv)通信地址(A)收件人Fish & Richardson(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)国家U.S.A.
(F)ZIP02110-2804(V)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容性(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#0.1，Version#1.25 and WordPerfect(Version 5.1)(Vi)目前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类号(Vii)以前的申请资料
(A)申请号08/090,526(B)申请日1993年7月9日(Viii)律师/代理人资料(A)姓名Clark，Paul T.
(B)登记号30，162(C)参考/案号00786/220001(ix)电信资料(A)电话(617)542-5070(B)传真(617)542-8906(C)电传200154(2)序列识别编号1的资料(i)序列特征(A)长度2320(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO1GTTAACCACT CTTAATAATA ATGGGTTTTA TAGCGAAATA CACTTTTTTA TCGCGTGTTC 60AATATTTGCG TTAGTTATTA TTTTTTTGGA ATGTAAATTc TCTCTAAACA CAGGTGATAT120TTATGTTGGA ATTGTGGTGT TGATTCTATT CTTATAATAT AACAAGAAAT GTTGTAACTG180ATAGATATAT TAAAAGATTA AATCGGAGGG GGAATAAAGC GTGCTAAGCA TCATCGTGAA240TATGATTACA GCGCCTGCGA TGGCATATAA CCGTATTGCG GATGGAGCGT CACGTGAGGA300CTGTGAAGCA CAATGCGATA TGTTCTGATT ATATGGCGAG TTTGCTTAAT GACATGTTTT360TAGCCGAACG GTGTCAAGTT TCTTAATGTG GTTGTGAGAT TTTCTCTTTA AATATCAAAA420TGTTGCATGG GTGATTTGTT GTTCTATAGT GGCTAAAGAC TTTATGGTTT CTGTTAAATA480TATATGCGTG AGAAAAATTA GCATTCAAAT CTATAAAAGT TAGATGACAT TGTAGAACCG540GTTACCTAAA TGAGCGATAG AGTGCTTCGG TAGTAAAAAT ATCTTTCAGG AAGTAAACAC600ATCAGGAGCG ATAGCGGTGA ATTATTCGTG GTTTTGTCGA TTCGGCATAG TGGCGATAAC660TGAATGCCGG ATCGGTACTG CAGGTGTTTA AACACACCGT AAATAATAAG TAGTATTAAG720GAGTTGTT 728ATG AAA AAT ATT ATT TTA TCC ACT TTA GTT ATT ACT ACA AGC GTT TTG 776Met Lys Asn Ile Ile Leu Ser Thr Leu Val Ile Thr Thr Ser Val Leu5 10 15GTT GTA AAT GTT GCA CAG GCC GAT ACT AAC GCC TTT TCC GTG GGG TAT 824Val Val Asn Val Ala Gln Ala Asp Thr Asn Ala Phe Ser Val Gly Tyr20 25 30GCA CGG TAT GCA CAA AGT AAA GTT CAG GAT TTC AAA AAT ATC CGA GGG 872Ala Arg Tyr Ala Gln Ser Lys Val Gln Asp Phe Lys Asn Ile Arg Gly35 40 45GTA AAT GTG AAA TAC CGT TAT GAG GAT GAC TCT CCG GTA AGT TTT ATT 920Val Asn Val Lys Tyr Arg Tyr Glu Asp Asp Ser Pro Val Ser Phe Ile50 55 60TCC TCG CTA AGT TAC TTA TAT GGA GAC AGA CAG GCT TCC GGG TCT GTT 968Ser Ser Leu Ser Tyr Leu Tyr Gly Asp Arg Gln Ala Ser Gly Ser Val65 70 75 80GAG CCT GAA GGT ATT CAT TAC CAT GAC AAG TTT GAG GTG AAG TAC GGT 1016Glu Pro Glu Gly Ile His Tyr Hie Asp Lys Phe Glu Val Lys Try Gly85 90 95TCT TTA ATG GTT GGG CCA GCC TAT CGA TTG TCT GAC AAT TTT TCG TTA 1064Ser Leu Met Val Gly Pro Ala Tyr Arg Leu Ser Asp Asn Phe Ser Leu100 105 110TAC GCG CTG GCG GGT GTC GGC ACG GTA AAG GCG ACA TTT AAA GAA CAT 1112Tyr Ala Leu Ala Gly Val Gly Thr Val Lys Ala Thr Phe Lys Glu His115 120 125TCC ACT CAG GAT GGC GAT TCT TTT TCT AAC AAA ATT TCC TCA AGG AAA 1160Ser Thr Gln Asp Gly Asp Ser Phe Ser Asn Lys Ile Ser Ser Arg Lys130 135 140ACG GGA TTT GCC TGG GGC GCG GGT GTA CAG ATG AAT CCG CTG GAG AAT 1208Thr Gly Phe Ala Trp Gly Ala Gly Val Gln Met Asn Pro Leu Glu Asn145 150 155 160ATC GTC GTC GAT GTT GGG TAT GAA GGA AGC AAC ATC TCC TCT ACA AAA 1256Ile Val Val Asp Val Gly Tyr Glu Gly Ser Asn Ile Ser Ser Thr Lys165 170 175ATA AAC GGC TTC AAC GTC GGG GTT GGA TAC CGT TTC TGA AAAGC 1300Ile Asn Gly Phe Asn Val Gly Val Gly Tyr Arg Phe180 185ATAAGCTATG CGGAAGGTTC GCCTTCCGCA CCGCCAGTCA ATAAAACAGG GCTTCTTTAC 1360CAGTGACACG TACCTGCCTG TCTTTTCTCT CTTCGTCATA CTCTCTTCGT CATAGTGACG 1420CTGTACATAA CATCTCACTA GCATAAGCAC AGATAAAGGA TTGTGGTAAG CAATCAAGGT 1480TGCTCAGGTA GGTGATAAGC AGGAAGGAAA ATCTGGTGTA AATAACGCCA GATCTCACAA 1540GATTCACTCT GAAAAATTTT CCTGGAATTA ATCACAATGT CATCAAGATT TTGTGACCGC 1600CTTCGCATAT TGTACCTGCC GCTGAACGAC TACTGAAAAG TAGCAAGGTA TGTATTTTAT 1660CCAGGAGAGC ACCTTTTTTG CGCCTGGCAG AAGTCCCCAG CCGCCACTAG CTCAGCTGGA 1720TAGAGCATCA ACCTCCTAAG TTGATGGTGC GAGGTTCGAG GCCTCGGTGG CGGTCCAATG 1780TGGTTATCGT ATAATGTTAT TACCTCAGTG TCAGGCTGAT GATGTGGGTT CGACTCCCAC 1840TGACCACTTC AGTTTTGAAT AAGTATTGTC TCGCAACCCT GTTACAGAAT AATTTCATTT 1900ATTACGTGAC AAGATAGTCA TTTATAAAAA ATGCACAAAA ATGTTATTGT CTTTTATTAC 1960TTGTGAGTTG TAGATTTTTC TTATGCGGTG AATCCCCCTT TGCGGCGGGG CGTCCAGTCA 2020AATAGTTAAT GTTCCTCGCG AACCATATTG ACTGTGGTAT GGTTCACCGG GAGGCACCCG 2080GCACCGCAAT TTTTTATAAA ATGAAATTCA CACCCTATGG TTCAGAGCGG TGTCTTTTTA 2140CATCAGGTGG GCAAGCATAA TGCAGGTTAA CTTGAAAGAT ACGATCAATA GCAGAAACCA 2200GTGATTTCGT TTATGGCCTG GGGATTTAAC CGCGCCAGAG CGTATGCAAG ACCCTGGCGC 2260GGTTGGCCGG TGATCGTTCA ATAGTGCGAA TATGAATGGT TACCAGCCGC CTGCGAATTC 2320(2)序列识别编号2的资料(i)序列特征(A)长度53(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2CATTTCTCAT TGATAATGAG AATCATTATT GACATAATTG TTATTATTTT ACG53(2)序列识别号3的资料(i)序列特征(A)长度688(B)类型核酸
(C)链型双链(D)拓朴结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGCGCATTA TCAGATAAAT TGATTTATTT CTCACTTTCA TTCTATTTTC ATCAGGAATC 60CCTGTGTCCT GTGCGGTAAT CTGCTGCTAT CGAGAACGAC AGACATCGCT AACAGTATAT 120ATGGAAACAT CAAAAGACAA GACGATAACA AGCCCAGGGC CATACATAGT TCGATTACTT 180AACAGCTCAC TGAACGGCTG TGAGTTTCCA TTGCTGACAG GCCGAACACT CTTTGTGGTA 240GGTCAGAGTG ATGCGCTCAC TGCTTCAGGT CAACTCCCTG ATATACCTGC CGATAGCTTT 300TTTATCCCGC TGGACCATGG CGGAGTAAAT TTTGAAATCC AGGTGGATAC GGATGCGACC 360GAAATTATAC TCCATGAGCT GAAAGAAGGA AATTCTGAAT CTCGTTCGGT GCAATTAAAT 420ACGCCAATAC AGGTCGGTGA ATTGCTTATC CTGATTCGCC CGGAAAGCGA GCCGTGGGTG 480CCCGAGCAGC CTGAGAAGTT AGAAACGTCT GCAAAAAAGA ACGAGCCGCG TTTTAAAAAC 540GGAATTGTAG CAGCACTGGC CGGGTTTTTT ATATTGGGAA TTGGGACTGT GGGGACGTTA 600TGGATACTTA ACTCGCCGCA GCGGCAGGCC CGAGAGCTCG ATTCGTTATT GGGGCAGGAG 660AAGGAGCGTT TTCAGGTGTT GCCAGGCC 688(2)序列识别号4的资料(i)序列特征(A)长度16(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO4AATATCGCCC TGAGCA 16(2)序列识别号5的资料(i)序列特征
(A)长度4044(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO5GGTTAACTCT TCGTTGAATA AAAAATGTCA ATGACGTTCC ATAATTCAGG AGATGAACTT60CACAAGTCAT TATATATAAC AGGAGGTGCT ATGAAACATC ATGCTTTTAT GCTTTGGTCA 120TTACTTATTT TTTCATTCCA TGTTTTGGCC AGTTCAGGCC ATTGTTCTGG TTTACAACAG 180GCATCATGGG ATATTTTTAT CTACGATTTT GGTAGTAAAA CCCCGCAACC ACCTACAAAT 240ACTGATAAAA AGCAAGCCAG GCAGATTAGT TCACCGTCCT GCCCGACGAC AAAACCCATG 300ATGTCCGCAC CAGTCAATGA CGCCAGGAAA GGGAATACTT TCTCCAGAAC ATAATGTTAT 360TTATCTACAA TGGTGCCGAC GACTACTTTT AGCCACCCGG AAATCTTGAT TGCCATCAAA 420TATAGCTGGC ATTATTTTTC CTGACGTGTA TAGTGCGCCT CGTTATCCCC ATTAAGGAAT 480TTGTTTGTCT CGTAAAATGA CAGGAATTGT CAAAACCTTT GATTGTAAGA GCGGTAAAGG 540TCTCATCACC CCCTCCGATG ACGCAAAGAT GTTCAGGTCC ACATTTCAGC ATGTCGCCAA 600CACGAAACAG AAGCGCTTAT CCCCGGTATA CGCGTTGAGT TTTATCGTAT TAATGGCCTC 660CGCGGACCTA CCGCCGCCAA CGTTTATCTT TCATAATTCG TCACCCGGCA TTTTTCAGAA 720AAATTTAGCG AGTACGTCTA CCTCCGCAGC CTGCTATGAG GCTTTGCCTG AAAGGCTGCA 780GAATGTTTTC AGTGGCGAAA ATCTAAAAGA 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(2)序列识别号7的资料(i)序列特征(A)长度178个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Thr Leu Leu Ser Gly Lys Thr Thr Leu Val Leu Cys Leu Ser Ser1 5 10 15Ile Leu Cys Gly Cys Thr Thr Asn Gly Leu Pro Thr Pro Tyr Ser Ile20 25 30Asn Leu Ser Phe Pro Val Ile Thr Gln Asn Gln Ile Asn Ser Gly Gly35 40 45Tyr Tyr Ile Asn Asp Ala Glu Gln Ile Arg Thr Thr Asp Gly Leu Cys50 55 60Leu Asp Ala Gly Pro Asp Gln Gln Asn Arg Leu Thr Leu Arg Glu Cys65 70 75 80Lys His Val Gln Ser Gln Leu Phe Ser Phe His Arg Asp Arg Ile Thr85 90 95Gln Gly Glu Lys Cys Leu Asp Ala Ala Asp Lys Val Gln Lys Lys Ala100 105 110His Gln Ser Phe Phe Ile His Ala Arg Val Mer Ile Thr Ser Ala Gly115 120 125Ser Leu Ile Ile Thr Lys Leu Arg Gly Aen Arg Ala Glu Asn Ala Trp130 135 140Ala Gln Ile Ala Leu Leu Ser Glu Lys Ala Thr Leu Leu Cys Trp Pro145 150 155 160Ile Ala Ile Leu Val Ala Pro Trp Asn Leu Pro Ser Gly Ser Arg Thr165 170 175Pro Leu(2)序列识别号8的资料(i)序列特征
(A)长度79个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Phe Val Glu Leu Val Tyr Asp Lys Arg Asn Val Glu Gly Leu Pro1 5 10 15Gly Ala Arg Glu Ile Ile Leu Asn Glu Leu Thr Lys Arg Val His Gln20 25 30Leu Phe Pro Asp Ala Gln Val Lys Val Lys Pro Met Gln Ala Asn Ala35 40 45Leu Asn Ser Asp Cys Thr Lys Thr Glu Lys Glu Arg Leu His Arg Met50 55 60Leu Glu Glu Met Phe Glu Glu Ala Asp Met Trp Leu Val Ala Glu65 70 75(2)序列识别号9的资料(i)序列特征(A)长度246个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Asn Lys Ile His Val Thr Tyr Lys Asn Leu Leu Leu Pro Ile Thr1 5 10 15Phe Ile Ala Ala Thr Leu Ile Ser Ala Cys Asp Asn Asp Lys Asp Ala20 25 30Met Ala Glu Ala Glu Lys Asn Gln Glu Lye Tyr Met Gln Lys Ile Gln35 40 45Gln Lys Glu His Gln Gln Ser Met Phe Phe Tyr Asp Lys Ala Glu Met50 55 60Gln Lys Ala Ile Ala Asn Ile Asn Ala Lys Gly Gly Ala Asn Leu Ala65 70 75 80Ile Ile Glu Val Arg Phe Phe Lys Gly Gly Tyr Ser Phe Ile Arg Gln85 90 95Ser Val Asn Thr Pro Ala Lys Val Glu Val Phe Lys Phe Asn Asn Gly100 105 110Tyr Trp Gly Gly Pro Ser Pro Val Asn Leu Thr Ile Phe Gly Thr Ile115 120 125Thr Glu Glu Gln Lys Gln Glu Ala Leu Lys Glu Ala Leu Phe Lys Phe130 135 140Asp Ser Ile Asn Phe Ser Ile Ile Pro Glu Arg Ile Gln Glu Thr Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Ala Ser Gly Ile Ile Ser Val Thr Glu Asp Ser Asp165 170 175Ile Val Val Arg Ala Glu Ile Ala His Asn Gly Glu Phe Val Tyr Asp180 185 190Ile Thr Ile Thr Ala Lye Asn Thr Ala Arg Ala Val Met Thr Leu Asn195 200 205Lys Asp Gly Ser Ile Ala Gly Tyr Glu Ile Lys Glu Pro Phe Ala Pro210 215 220Lys Lys Glu Ala Glu Lys Ala Gln Gln Leu VaL Glu Gln Ser Arg Lys225 230 235 240Asp Ile Glu Ser Pro Ala245(2)序列识别号10的资料(i)序列特征(A)长度3700(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO10TTTTGGTTTG CTGCCGTTTG GGATAACTGC ATAGAGAGCG GCCAAGTCGC TTGCGGTCGG 60TATCTCGAGT ATATCGAAAT CCATGTGGCC ATTGACCTCT TCAAGCGCTC ACGTTAACTA 120CCTGCTCTTT TTTGAGCACC AACATCCCAG GTTCGTCACA GTAAATCGTA TCGTGATTAT 180TGCTAATCGT CAGTTTACCG CTCCGAAAGC AAACTAAAGT GAAACTGCTT ACATAAAGAT 240TTTTGATGGT AACCTGCTGA GTCTGACTTT TAATTTGCTG CCGGGTATTT GTCAAAAGTG 300ATTTTAATTT CTGTAAGTTA TCTGCGGCAG GACGCTGATG ACTATTACTT ACAAAGGTTA 360CATTTTCCAT ATTATCCCTT TGTTGAACTT ATTTTAATGT TCCTTACTGG TATCCTACTG 420AAAAAATCTC AGTTGTAAAT GCTCTTTATT AGCGTGTGTT GGCAATGGTC TGATTGTTAC 480ACCAAAAGAA CCCAAATTTG GGTAATTTAT CTACAGTAGT TTAAGCCCCA ATGGGGATGA 540TGGTTCTTTT AATATGTGTT GAGACGCATT ATACAGAATA AATTGATTTT ATTTCTCACT 600TTTCATTCTA TTTTCATCAG GAATCCCTGT GTCCTGTGCG GTAATCTGCT GCTATCGAGG 660AACGACAGAC ATCGCTAACA GTATATATGG AAACATCAAA AGAGAAGACG ATAACAAGCT 720TTCCAGGGCC ATACATAGTT CGATTACTTA ACAGCTCACT GAACGGCTGT GAGTTTCCAT 780TGGGCCTGAC AGGCCGAACA CTCTTTGTGG TAGGTCAGAG TGATGCGCTC ACTGCTTCAG 840GTCAATGTGA TAGCTCCCTG ATATACCTGC CGATAGCTTT TTTATCCCGC TGGACCATGG 900CGGAGTAAAT TTTAGGGAAA TCCAGGTGGA TACGGATGCG ACCGAAATTA TACTCCATGA 960GCTGAAAGAA GGAAATTATG TCTGAATCTC GTTCGGTGCA ATTAAATACG CCAATACAGG1020TCGGTGAATT GCTTATCCTG TGATTCGCCC GGAAAGCGAG CCGTGGGTGC CCGAGCAGCC1080TGAGAAGTTA GAAACGTCTG CATAAAAAAG AACGAGCCGC GTTTTAAAAA CGGAATTGTA1140GCAGCACTGG CCGGGTTTTT TATAGAAAGT TGGGAATTGG GACTGTGGGG ACGTTATGGA1200TACTTAACTC GCCGCAGCGG CAGGCCGCAG GTGTAAGAGC TCGATTCGTT ATTGGGGCAG1260GAGAAGGAGC GTTTTCAGGT GTTGCCAGGC CGGGACGGAA AATGCTCTAT GTCGCTGCGC1320AAAATGAAAG AGATACGTTG TGGGCTCGTC AGGTTTTAAA TAGCGAGGGG CGATTATGAT1380AAAAATGCGC GAGTGATTAA CGAAAACGAA GAAAATAAGC GTAGAATCTC TATCTGGCTG1440GATACCTATT ATCCGCAGCT GGCTTATTAT CGGATTCATT TCGATTAGAG CCGCGTAAAC1500CCGTTTTCTG GCTAAGCCGC CAGCGAAACA CGATGAGCAA GAAAGAGTCT CGAGGTGTTA1560AGTCAAAAGC TGAGAGCGCT AATGCCTTAC GCGGATTCGG TTAACATCAA ACGTTGATGG1620ACGATGTTAC CGCAGCAGGC CAGGCGGAAG CGGGGCTAAA ACAGCAGGCG TTAAGAAGAT1680TACCTTATTC CCGCAGGAAT CATAAGGGGG GCGTAACGTT TGTTATTCAG GGGGCGCTCG1740GTGAGATGAT GTAGAAATAC TCAGAGCCCG TCAATTTGTC GATAGCTATT ACCGCACATG1800GGGAATGGGA CGCTATGTGC AGTTTGCGAT CGAATTAAAA GATGACTGGC TCAAGGGGCG 1860CTCATTTGAG CAGTACGGGG CGGAAGGTTA TATCAAAATG AGCCCAGGCC ATTGGTATTT 1920CCCAAGCCCA GAGGGCTTTA ATTTAACGTA AATAAGGAAG TCATTATGGC AACACCTTGG 1980TCAGGCTATC TGGATATGGA CGTCTCAGCA AAATTTGATA CGGGCGTTGA TAATCTACAA 2040ACGCAGGTAA CAGAGGCGAT GTTACTGGAT AAATTAGCAG CAAAACCCTC CGATCCGGCG 2100CTACTGGCGG CGTATCAGAG TAAGAAAAAC TCTCGGAATA TAACTTGTAC CGTAACGCGC 2160AATCGAACAC GGTAAAAGTC TTTAAGGATA TGATTGATGC TGCCATTATT CAGAACTTCC 2220GTTAATCAGT TATAAGGTGG ATTATGTCGA TTAAGCAACT ATTGTCCCTG AGAATGCCGT 2280TATAGGGCAG GCGGTCAATA TCAGGTCTAT GGAAATAGAA CGGACATTGT CTCGCTGGAT 2340GACCGGCTAC TCCAGGCTTT TTCTGGTTCG GCGATTGCCT AGAAACGGCT GTGGATAAAC 2400AGACGATTAG CAACAGGATT GAGGACCCTA ATCTGGTGAC GGATTATTTC CTAAAGAGCT 2460GGCTATTTCG CAAGAGATGA TTTCAGATTA TAACCTGTAT GTTTCTATGA GGTCAGTAGC 2520CTTACTCGTA AAGGAGTCGG GGCTGTTGAA ACGCTATTAC GCTCATGATT CTTGGATGTC 2580GATATCTATA TACTTTTCTG CTGGTAATGA CCCTTGCCGG CTGTAAGGAT AAGGATCTTA 2640GCTTTTAAAA GGACTGGACC AGGAACAGGC TAATGAGGTC ATTGCCGTTC TGCAAATGCA 2700CAGAAATATA GAGGCGAATA AAATTGATAG CGGAAAATTG GGCTATAGCA TTACCGTTGC 2760TGAGCAGGTA CTGATTTTAC CGCTGCGGTG TACTGGATTA AAACTTATCA GCTTCCTCCC 2820CGGCCACGGG TAATTGGAAA TAGCGCAGAT GTTCCCGGCG GATTCGCTGG TATCGTCTCC 2880GCGAGCTGAA AAGGAAAACC AGGTTATATT CGGCTATTGA ACAGCGACTG GAACAGTCAT 2940TACAGACGAT GGAGGGCGAT GTGCTCTCCG CCAGGGTCCA TATTAGTTAT GATATTGATG 3000CTGGTGAAAA TGGCCGCCCG CAAGGCAAAA CCTGTTCATC TGTCGGCATT AGCCGTATAT 3060GAACGAGGTT CGCCGCTTGC GCATCAAGAA GATCAGCGAT ATCAAGCGTT TCTTAAAGAA 3120TAGTTTTGCC GATGTGGATT ATGACAACAA TTTCTGTTGT GTTGTCAGAA CGTTCTGATG 3180CCCAATTACA GGCTCCCGGC ACACCAGTAA AAGTAACGTA ATTCTTTTGC AACCAGTTGG 3240ATTGTTTTGA TTATTTTGTT ATCCGTGATG TCAGATACAG GCTTTGGCGT CTGGTATTAC 3300AAAAACCATT ATGCCCGCAA TAAGAAAGGC ATAACGGGGA GTACTGATGA TAAGGCGAAA 3360TCGTCAAATG AATAGGCAGC CATTACCCAT TATCTGGCAA AGAATCATTT TTGATCCGTT 3420ATCGTATATC CATCCTCAGC GGTTGCAGAT AGCGCCGGAA ATGATTGTCA GACCGCGCCA 3480CGCGAAATGA GTTAATACTG GCGGCATGGC GGCGGCTTAA GAACGGAGAA AAGGAGTGTA 3540TTCAAAACTC ACTGACGCAG CTGTGGCTGC TCAGTGGCGC CGACTGCCGC AAGTAGCGTA 3600TTTACTAAAC TGAGAGCCGA TCTGGCAAGG CAGGGAGCCT TGCTTGGCCT AGCCGGATTG 3660GGCGAAATGA GTTAATACTG GCGGCATGGC GGCTTGCCAT3700
(2)序列识别号11的资料(i)序列特征(A)长度392氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Met Glu Thr Ser Lys Glu Lys Thr Ile Thr Ser Pro Gly Pro Tyr Ile1 5 10 15Val Arg Leu Leu Asn Ser Ser Leu Asn Gly Cys Glu Phe Pro Leu Leu20 25 30Thr Gly Arg Thr Leu Phe Val Val Gly Gln Ser Asp Ala Leu Thr Ala35 40 45Ser Gly Gln Leu Pro Asp Ile Pro Ala Asp Ser Phe Phe Ile Pro Leu50 55 60Asp His Gly Gly Val Asn Phe Glu Ile Gln Val Asp Thr Asp Ala Thr65 70 75 80Glu Ile Ile Leu His Glu Leu Lys Glu Gly Asn Ser Glu Ser Arg Ser85 90 95Val Gln Leu Asn Thr Pro Ile Gln Val Gly Glu Leu Leu Ile Leu Ile100 105 110Arg Pro Glu Ser Glu Pro Trp Val Pro Glu Gln Pro Glu Lys Leu Glu115 120 125Thr Ser Ala Lys Lys Asn Glu Pro Arg Phe Lye Asn Gly Ile Val Ala130 135 140Ala Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Gly Thr Leu145 150 155 160Trp Ile Leu Asn Ser Pro Gln Arg Gln Ala Ala Glu Leu Asp Ser Leu165 170 175Leu Gly Gln Glu Lys Glu Arg Phe Gln Val Leu Pro Gly Arg Asp Lys180 185 190Met Leu Tyr Va1 Ala Ala Gln Asn Glu Arg Asp Thr Leu Trp Ala Arg195 200 205Gln Val Leu Als Arg Gly Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Arg Val Ile Asn210 215 220Glu Asn Glu Glu Asn Lys Arg Ile Ser Ile Trp Leu Asp Thr Tyr Tyr225 230 235 240Pro Gln Leu Ala Tyr Tyr Arg Ile His Phe Asp Glu Pro Arg Lys Pro245 250 255Val Phe Trp Leu Ser Arg Gln Arg Asn Thr Met Ser Lys Lys Glu Leu260 265 270Glu Val Leu Ser Gln Lys Leu Arg Ala Leu Met Pro Tyr Ala Asp Ser275 280 285Val Asn Ile Thr Leu Met Asp Asp Va1 Thr Ala Ala Gly Gln Ala Glu290 295 300Ala Gly Leu Lys Gln Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Arg Arg Asn His Lys305 310 315 320Gly Gly Val Thr Phe Val Ile Gln Gly Ala Leu Asp Asp Val Glu Ile325 330 335Leu Arg Ala Arg Gln Phe Val Asp Ser Tyr Tyr Arg Thr Trp Gly Gly340 345 350Arg Tyr Val Gln Phe Ala Ile Glu Leu Lys Asp Asp Trp Leu Lys Gly355 360 365Arg Ser Phe Gln Tyr Gly Ala Glu Gly Tyr Ile Lys Met Ser Pro Gly370 375 380His Trp Tyr Phe Pro Ser Pro Leu385 390(2)序列识别号12的资料(i)序列特征(A)长度80氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Ala Thr Pro Trp Ser Gly Tyr Leu Asp Asp Val Ser Ala Lys Phe1 5 10 15Asp Thr Gly Val Asp Asn Leu Gln Thr Gln Val Thr Glu Ala Leu Asp20 25 30Lys Leu Ala Ala Lys Pro Ser Asp Pro Ala Leu Leu Ala Ala Tyr Gln35 40 45Ser Lys Leu Ser Glu Tyr Asn Leu Tyr Arg Asn Ala Gln Ser Asn Thr50 55 60Val Lys Val Phe Lys Asp Ile Asp Ala Ala Ile Ile Gln Asn Phe Arg65 70 75 80(2)序列识别号13的资料(i)序列特征(A)长度101个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Ser Ile Ala Thr Ile Val Pro Glu Asn Ala Val Ile Gly Gln Ala1 5 10 15Val Asn Ile Arg Ser Met Glu Thr Asp Ile Val Ser Leu Asp Asp Arg20 25 30Leu Leu Gln Ala Phe Ser Gly Ser Ala Ile Ala Thr Ala Val Asp Lys35 40 45Gln Thr Ile Thr Asn Arg Ile Glu Asp Pro Asn Leu Val Thr Asp Pro50 55 60Lys Glu Leu Ala Ile Ser Gln Glu Met Ile Ser Asp Tyr Asn Leu Tyr65 70 75 80Val Ser Mer Val Ser Thr Leu Thr Arg Lys Gly Val Gly Ala Val Glu85 90 95Thr Leu Leu Arg Ser100(2)序列识别号14的资料(i)序列特征(A)长度252氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽
(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Ile Arg Arg Tyr Leu Tyr Thr Phe Leu Leu Val Met Thr Leu Ala1 5 10 15Gly Cys Lys Asp Lys Asp Leu Leu Lys Gly Leu Asp Gln Glu Gln Ala20 25 30Asn Glu Val Ile Ala Val Leu Gln Met His Asn Ile Glu Ala Asn Lys35 40 45Ile Asp Ser Gly Lys Leu Gly Tyr Ser Ile Thr Val Ala Glu Pro Asp50 55 60Phe Thr Ala Ala Val Tyr Trp Ile Lys Thr Tyr Gln Leu Pro Pro Arg65 70 75 80Pro Arg Val Glu Ile Ala Gln Met Phe Pro Ala Asp Ser Leu Val Ser85 90 95Ser Pro Arg Ala Glu Lys Ala Arg Leu Tyr Ser Ala Ile Glu Gln Arg100 105 110Leu Glu Gln Ser Leu Gln Thr Met Glu Gly Val Leu Ser Ala Arg Val115 120 125His Ile Ser Tyr Asp Ile Asp Ala Gly Glu Asn Gly Arg Pro Pro Lys130 135 140Pro Val His Leu Ser Ala Leu Ala Val Tyr Glu Arg Gly Ser Pro Leu145 150 155 160Ala His Gln Ile Ser Asp Ile Lys Arg Phe Leu Lys Asn Ser Phe Ala165 170 175Asp Val Asp Tyr Asp Asn Ile Ser Val Val Leu Ser Glu Arg Ser Asp180 185 190Ala Gln Leu Gln Ala Pro Gly Thr Pro Val Lys Arg Asn Ser Phe Ala195 200 205Thr Ser Trp Ile Val Leu Ile Ile Leu Leu Ser Val Met Ser Ala Gly210 215 220Phe Gly Val Trp Tyr Tyr Lys Asn His Tyr Ala Arg Asn Lys Lys Gly225 230 235 240Ile Thr Ala Asp Asp Lys Ala Lys Ser Ser Asn Glu245 250(2)序列识别号15的资料(i)序列特征(A)长度818(B)类型核酸(C)链型双链
(D)拓朴结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO15CATAACAACT CCTTAATACT ACTTATTATT TACGGTGTGT TTAAACACCT GCAGTACCGA 60TCCGGCATTC AGTTATCGCC ACTATGCCGA ATCGACAAAA CCACGAATAA TTCACCGCTA120TCGCTCCTGA TGTGTTTACT TCCTGAAAGA TATTTTTACT ACCGAAGCAC TCTATCGCTC180ATTTAGGTAA CCGGTTCTAC AATGTCATCT AACTTTTATA GATTTGAATG CTAATTTTTC240TCACGCATAT ATATTTAACA GAAACCATAA AGTGTTTAGC CACTATAGAA CAACAAATCA300CCCATGCAAC ATTTTGATAT TTAAAGAGAA AATCTCACAA CCACATTAAG AAACTTGACA360CCGTTCGGCT AAAAAACATG TCATTAAGCA AACTCGCCAT ATAATCAGAA CATATCGCAT420TGTGCTTCAC AGTCCTCACG TGACGCTCCA TCCGCAATAC GGTTATATGC CATCGCAGGC480GCTGTAATCA TATTCACGAT GATGCTTAGC ACGCTTTATT CCCGCTCCGA TTTAATCTTT540TAATATATCT ATCAGTTACA ACATTTCTTG TTATATTATA AGAATAGAAT CAACACCACA600ATTCCAACAT AAATATCACC TGTGTTTAGA GAGAATTTAC ATTCCAAAAA AATAATAACT660AACGCAAATA TTGAACACGC GATAAAAAAG TCTATTTCGC TATAAAACCC ATTATTATTA720AGAGTGGTTA ACTCTTCGTT GAATAAAAAA TGTCAATGAC GTTCCATAAT TCAGGAGATG780AACTTCACAA GTCATTATAT ATAACAGGAG GTGCTATG818
表12细菌菌株菌株 基因型 参考文献鼠伤寒伤沙氏菌14082s 野生型 ATCCCS019 phoN2 zxx∷6251Tn10d-Cm 25CS015 phoP102∷Tn10d-Cm 25AD154 phoP12 puB1744∷Tn10 3TT13208phoP105∷Tn10d26CS585 pagD1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究C5586 pagD1∷TnphoA phoP105∷To10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS619 pagE1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS620 pagE1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS1599 pagF1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS1600 pagF1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS334 pagG1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS335 pagG1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究C51488 pagH1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS1489 pagH1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS2054 pagI1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS2055 pagI1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS1074 pagJ1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS1075 pagJ1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS767 pagK1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10dCm本研究CS768 pagK1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS993 pagL1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS994 pagL1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS1845 pagM1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS1846 pagM1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS728 pagN1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS729 pagN1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS1194 pagO1∷TnphoA PhoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS1195 pagO1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究CS1247 pagP1∷TnphoA phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm 本研究CS1248 pagP1∷TnphoA phoP105∷Tn10d phoN2 xxx∷6215Tn10d-Cm本研究AK3011-3314 被随机间隔的Tn10Δ16Δ17插入物的集合 18大肠杆菌 -SM10(pRT291) 含有pRT291(TnphoA)质粒，它通过选择 37pRK290的Tetr和Kmr而得到MM294(pPH1JI)含有Gmr质粒pPH1JI，它与pRK290不相容373 Behlau et al.，1993，J.Bacteriol.，1754475-8418 Lehrer et al.，1991，Cell，64229-3025 Miller et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865054-5826 Miller et al.，1990，J.Bacteriol.，1722485-9037 Taylor et al.，1989，J.Bacteriol.，1711870-78
表13对野生型菌株和具有无效phoP-座位的菌株的pag∷phoA活性进行比较活性(AP单位)a等位基因 对数生长期 静止生长期PhoP+PhoP-PhoP+PhoP-降低倍数bpagD1∷TnphoA 32 2 799 16pagE1∷TnphoA 96 21083 48pagF1∷TnphoA 89 4276 10 22pagG1∷TnphoA 35 1 656 35pagH1∷TnphoA 35 5 386 7pagI1∷TnphoA 12 2 248 6pagJ1∷TnphoA 123 8944 88 15pagK1∷TnphoA 30 3123 26 10pagL1∷TnphoA7 1 354 7pagM1∷TnphoA 9211439 130 8pagN1∷TnphoA 23 1 582 23pagO1∷TnphoA 31 2 54 12 16pagP1∷TnphoA 38 1 273 38aAP活性值是按照Miller对β-半乳糖苷酶定义的单位来表示的(24)。该数值代表三次重复进行的实验(每次设二个重复)的结果。phoP*表示在含有野生型phoP座位的CS019菌株中的pag∷TnphoA插入。phoP-表示携带PhoP105∷Tn10等位基因的等基因菌株。
b酶活性降低的倍数值表示获得无效phoP105等位基因时AP活性的降低。这些数值是从对数生长期的培养物中计算得到的并且四舍五入至最近的整数。
表14pag∷phoA基因融合对沙门氏菌鼠毒力的影响菌株 基因型 LD50aMSIb参考文献14028s 野生型＜20 6.13 25CS015 phoP102∷Tn10-Cam 7.0×1050.4025CS585 pagD1∷TnphoA 4.0×1050.0115CS1074 pagJ1∷TnphoA 4.0×1030.56 本研究CS767 pagK1∷TnphoA 9.0×1040.04 本研究CS1845 pagM1∷TnphoA 3.0×1040.09 本研究a50％致死剂量的测定是利用Reed和Muench的方法(31)，将每种稀释液腹膜内注射10只小鼠而进行的。
b巨噬细胞存活指数(MSI)的测定是将加入庆大霉素后24小时的巨噬细胞培养物(设置三个重复)得到的沙门氏菌平均CFU除于庆大霉素加入后1小时的巨噬细胞培养物中得到的沙门氏菌平均CFU而进行的。16 Kier et al.，1979，J.Bacteriol.，138155-6125 Miller et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865054-58
表15质粒，菌株和相关特性鼠伤寒沙门氏菌菌株 相关基因型/资料 MSIa 参考文献bATCC14028野生型 3.90 ATCCCS019phoN2 zxx∷6251Tn10d-Cm (31)CS585CS019.pagD∷TnphoA 0.002(4)CS586CS585phoP105∷Tn10d-Tet(4)JSG205 ATCC14028.msgA∷MudJ0.01本研究JSG225 JSG205.phoP105∷Tn10d-Tet 本研究CS811CS019.envE∷TnphoA 本研究CS812CS811.phoP105∷Tn10d-Tet本研究CS100ATCC14028.phoP105∷Tn10d-Tet0.01 TT1320的衍生物JSG232 JSG205.envF∷pGPP2 本研究JSG234 CS019.envF∷pGPP2 本研究JSG235 JSG234.phoP105∷Tn10d-Tet 本研究JSG244 JSG205.phoP105∷Tn10d-Tet 本研究CS099ATCC14028zxx3024∷Tn10Δ16Δ17pol-2(Whitfield其他沙门氏菌 polA琥珀) 本研究Ty2 Vi阳性FDA甲型副伤寒沙门氏菌 ATCC9150 ATCC丙型副伤寒沙门氏菌 ATCC13428ATCC肠炎沙门氏菌 临床分离株 VR1大肠杆菌菌株SM10λpir thi-l thr-l leuB6 supE44 tonA21 lacYlrecA∷RP4-2-Tc∷MuDH5c F-φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169endAlrecAlhsdR17deoRthi-lsupE44λ-gyrA96relA1其他肠杆菌科小肠结肠炎耶尔森氏菌临床分离株MGH细菌学实验室霍乱弧菌临床分离株Peruvian 流行病医院胎儿弯曲杆菌临床分离株MGH细菌学实验室弗劳地氏柠檬杆菌临床分离株MGH细菌学实验室肺炎克氏杆菌临床分离株MGH细菌学实验室弗氏志贺氏菌临床分离株MGH细菌学实验室宋内氏志贺氏菌 临床分离株MGH细菌学实验室摩根氏摩根氏菌 临床分离株MGH细菌学实验室司徒氏普罗威登斯菌 临床分离株MGH细菌学实验室质粒pWPL17 含有来自于pWP061的2.8Kb HpaI片段的pBR322本研究pCAA9 含有envF中的TnphoA插入物的pWPL17本研究pGP704 pir依赖性自杀载体(34)pGPP2 含有克隆的envF∷phoA基因融合的pGP704本研究pWP061 含有pagC区的粘粒克隆 (36)aMSI(噬菌体存活指数)是通过将感染后2小时时存活的细菌数目除以感染30分钟之后存在的与细胞相关的细菌的数而计算出的。
bMGH，马萨诸塞州总医院，ATCC，美国典型培养物保藏中心，FDA，食品和药物管理局，VRI，病毒研究所4 Belden et al.，1989，Infect.Immun.，571-731 Miller et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865054-5834 Miller et al.，1988，J.Bacteriol.，1702575-8336 pulkkinen et al.，1991，J.Bacteriol.，17386-93表16碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶基因融合活性菌株相关基因型 基因融合活性aJSG205 msgAMudJ461(B)JSG244 phoP105∷Tn10d-Tet415(B)msgAMudJJSG226 envE∷TnphoA 50(A)JSG229 phoP105∷Tn10d-Tet60(A)envE∷TnphoAJSG204 pagD∷TnphoA 76(A)JSG225 phoP105∷Tn10d-Tet 9(A)pagD∷TnphoAJSG234 envF∷pGPP2 16(A)JSG235 phoP105∷Tn10d-Tet19(A)envF∷pGPP2JSG232 msgA∷MudJ10(A)envF∷pGPP2a(A)AP(碱性磷酸酶)or(B)β-gal(β-半乳糖苷酶)
权利要求
1.一种菌苗，它含有一种细菌，该细菌由于处于双成分调节系统控制下的一个基因进行组成型表达而使其毒力减低。
2.根据权利要求1所述菌苗，其中所述的组成型表达是在所述双成分调节系统中一个成分发生突变的结果。
3.根据权利要求1所述菌苗，其中所述细菌细胞含有减低毒力的第二个突变。
4.根据权利要求1所述菌苗，其中所述细菌细胞是沙门氏菌细胞，所述双成分调节系统是phoP调节区域，并且所述基因是受phoP调节区域调节的基因。
5.根据权利要求4所述菌苗，其中所述组成型表达是突变的结果。
6.根据权利要求5所述菌苗，其中所述突变是位于phoP调节区域内。
7.根据权利要求6所述菌苗，其中所述突变是位于phoP基因内。
8.根据权利要求6所述菌苗，其中所述突变是位于phoQ基因内。
9.根据权利要求6所述菌苗，其中所述突变是phoPc突变。
10.根据权利要求6所述菌苗，其中所述突变是不可回复性突变。
11.根据权利要求4所述菌苗，其中所述组成型表达是在所述被调节基因的启动子中发生变化的结果。
12.根据权利要求4所述菌苗，其中所述基因是prg基因。
13.一种菌苗，它含有沙门氏菌细胞，所述沙门氏菌细胞由于受phoP调节区调节的毒力基因的表达降低而降低了毒力。
14.根据权利要求13所述菌苗，其中所述表达降低是突变的结果。
15.根据权利要求14所述菌苗，其中所述突变是位于prgH基因内。
16.根据权利要求14所述菌苗，其中所述突变是位于prgA、prgB、prgC或prgE基因内。
17.根据权利要求4所述菌苗，其中所述基因是pag基因。
18.根据权利要求17所述菌苗，其中所述pag座位是pagC座位。
19.根据权利要求4所述菌苗，其进一步特征在于所述沙门氏菌细胞包括减低毒力的第一个突变以及减低毒力的第二个突变。
20.根据权利要求19所述菌苗，其中所述第一突变是在phoP调节区基因内。
21.根据权利要求20所述菌苗，其中所述第一突变是在phoP基因内。
22.根据权利要求20所述菌苗，其中所述第一突变是在phoQ基因内。
23.根据权利要求20所述菌苗，其中所述第一突变是一种phoPc突变。
24.根据权利要求19所述菌苗，其中所述第一突变是在受phoP调节区调节的基因内。
25.根据权利要求19所述菌苗，其中所述第二突变是在芳香族氨基酸合成基因中的一个突变。
26.根据权利要求25所述菌苗，其中所述第二突变是一个aro突变。
27.根据权利要求19所述菌苗，其中所述第二突变是位于受phoP调节区域调节的基因内。
28.根据权利要求23所述菌苗，其中所述第二突变是在prg座位内。
29.根据权利要求13所述菌苗，进一步的特征在于所述沙门氏菌细胞含有两个突变基因，减低毒力的第一突变基因以及减低毒力的第二突变基因。
30.根据权利要求29所述菌苗，其中所述第二基因是在prg座位内。
31.根据权利要求30所述菌苗，其中所述基因是prgH。
32.根据权利要求30所述菌苗，其中所述基因是prgA、prgB、prgC或prgE。
33.根据权利要求27所述菌苗，其中所述第二突变是在pag座位内。
34.根据权利要求27所述菌苗，其中所述第二突变是pagC突变。
35.根据权利要求4所述菌苗，其中所述沙门氏菌是伤寒沙门氏菌的种。
36.根据权利要求4所述菌苗，其中所述沙门氏菌是一种肠炎沙门氏菌并且是鼠伤寒沙门氏菌菌株。
37.根据权利要求4所述菌苗，其中所述沙门氏菌是猪霍乱沙门氏菌。
38.根据权利要求4所述菌苗，其中所述菌苗是活菌苗。
39.一种菌苗，它含有细菌细胞，该细胞的处于双成分调节系统控制下的一个基因发生突变而使其毒力减低。
40.根据权利要求39所述菌苗，其特征还在于所述细菌细胞在第二个基因含有减低毒力的一个突变。
41.根据权利要求39所述菌苗，其中所述细菌细胞是沙门氏菌细胞并且所述双成分调节系统是phoP调节区。
42.根据权利要求41所述菌苗，其中所述基因是prg基因。
43.根据权利要求41所述菌苗，其中所述基因是prgH。
44.根据权利要求41所述菌苗，其中所述基因是prgA、prgB、prgC或prgE。
45.根据权利要求41所述菌苗，其中所述基因是pag基因。
46.根据权利要求45所述菌苗，其中所述基因是pagC。
47.根据权利要求41所述菌苗，其中所述细菌细胞还含有在第二个基因中的一种突变，所述突变使所述细菌细胞的毒力减低。
48.根据权利要求47所述菌苗，其中所述第二基因是一种芳香族氨基酸生物合成基因。
49.根据权利要求48所述菌苗，其中所述第二基因是一种aro基因。
50.一种含有沙门氏菌细胞的菌苗，所述细胞在一个芳香族氨基酸生物合成基因中有减低毒力的第一突变以及在phoP调节区基因中有减低毒力的第二突变。
51.根据权利要求50所述菌苗，其中所述第一个突变是在aro基因中。
52.根据权利要求51所述菌苗，其中所述第二突变是一种phoP突变。
53.一种细菌细胞，它组成型地表达一种处于双成分调节系统控制下的基因，并且含有一个减低毒力的突变，这种突变不会导致处于所说双成分调节系统控制下的基因进行组成型表达。
54.根据权利要求53所述细菌细胞，进一步包括在所述双成分调节系统中的一种成分发生突变。
55.根据权利要求53所述细菌细胞，其中所述细胞是沙门氏菌细胞，该细胞组成型地表达受phoP调节区调节的基因，并且包含有一个减低毒力的突变，这个突变不会导致处于phoP调节区控制下的基因进行组成型表达。
56.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述组成型表达是由phoP调节区发生突变引起的。
57.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述组成型表达是由phoP基因中的突变引起的。
58.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述组成型表达是由phoQ基因中发生突变引起的。
59.根据权利要求56所述细菌细胞，其中所述突变是phoPc突变。
60.根据权利要求56所述细菌细胞，其中所述突变是一种缺失。
61.根据权利要求55所述细菌细胞，进一步的特征在于所述减低毒力突变是在芳香族氨基酸合成基因中。
62.根据权利要求61所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是一种aro突变。
63.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述减低毒力的突变是在phoP调节区基因内。
64.根据权利要求63所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是phoP基因。
65.根据权利要求63所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是在phoQ基因中。
66.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是在prg座位中。
67.根据权利要求66所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是在prgH基因中。
68.根据权利要求66所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是在prgA、prgB、prgC或prgE基因中。
69.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是在pag座位中。
70.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述减低毒力突变是一种pagC突变。
71.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述细胞是一种伤寒沙门氏菌。
72.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述细胞是一种肠炎沙门氏菌并且是鼠伤寒沙门氏菌菌株。
73.根据权利要求55所述细菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是猪霍乱沙门氏菌。
74.一种细菌细胞，它在受phoP调节区调节的基因中有减低毒力的突变。
75.根据权利要求74所述细菌细胞，其中所述细菌细胞是沙门氏菌细胞，并且所述减低毒力的突变是在受phoP调节区调节的基因中。
76.根据权利要求75所述细菌细胞，其中所述基因是prg基因。
77.根据权利要求76所述细菌细胞，其中所述基因是prgH基因。
78.根据权利要求76所述细菌细胞，其中所述基因是prgA、prgB、prgC、或prgE基因。
79.根据权利要求75所述细菌细胞，其中所述基因是pag基因。
80.根据权利要求29所述细菌细胞，其中所述基因是pagC。
81.根据权利要求74所述细菌细胞，进一步包含第二个突变，这个突变减低毒力但并不导致受phoP调节区调节的基因进行组成型表达。
82.根据权利要求81所述细菌细胞，其中所述第二突变是在芳香族氨基酸合成基因中。
83.根据权利要求82所述细菌细胞，其中所述第二突变是一种aro突变。
84.根据权利要求81所述细菌细胞，其中所述第二突变是在phoP调节区基因内。
85.根据权利要求84所述细菌细胞，其中所述第二突变是在phoP座位中。
86.根据权利要求84所述细菌细胞，其中所述第二突变是在phoQ座位中。
87.根据权利要求81所述细菌细胞，其中所述第二突变是在受phoP调节区调节的基因中。
88.根据权利要求87所述细菌细胞，其中所述第二突变是在pag座位中。
89.根据权利要求75所述细菌细胞，其中所述细胞是一种伤寒沙门氏菌。
90.根据权利要求75所述细菌细胞，其中所述细胞是一种肠炎沙门氏菌并且是鼠伤寒沙门氏菌菌株。
91.根据权利要求75所述细菌细胞，其中所述细胞是一种猪霍乱沙门氏菌。
92.一种活的沙门氏菌细胞，其中在一种毒力基因中插入了一个编码导源蛋白质的基因，或者所述异源蛋白基因的调节成分。
93.根据权利要求92所述沙门氏菌活细胞，其中所述毒力基因是在phoP调节区。
94.根据权利要求94所述沙门氏菌活细胞，其中所述毒力基因是一种受phoP调节区调节的基因。
95.根据权利要求94所述沙门氏菌活细胞，其中所述毒力基因是prgH基因。
96.根据权利要求95所述沙门氏菌活细胞，其中所述毒力基因是prgH基因。
97.根据权利要求95所述沙门氏菌活细胞，其中所述毒力基因是prgA、prgB、prgC或prgE基因。
98.根据权利要求94所述沙门氏菌活细胞，其中所述毒力基因是pag基因。
99.根据权利要求98所述沙门氏菌活细胞，其中所述pag基因是pagC。
100.根据权利要求92所述沙门氏菌活细胞，其中所述沙门氏菌细胞携带减低毒力的第二突变。
101.根据权利要求100所述沙门氏菌活细胞，其中所述第二突变是一种aro突变。
102.根据权利要求92所述沙门氏菌活细胞，其中所述编码异源蛋白的DNA处于受环境调节的启动子控制下。
103.根据权利要求92所述沙门氏菌活细胞，其中所述沙门氏菌是一种伤寒沙门氏菌。
104.根据权利要求92所述沙门氏菌活细胞，进一步含有为T7聚合酶编码的处于受环境调节的启动子控制之下的DNA序列，以及一种T7转录敏感性启动子，所述T7转录敏感性启动子控制所述异源抗原的表达。
105.一种能够整合到沙门氏菌染色体中的载体，包括编码异源蛋白的第一DNA序列，编码一种标记物的第二DNA序列，以及编码保持毒力所必需的受phoP调节区调节的基因产物的第三种DNA序列，所述第三种DNA序列因发生突变而失活。
106.根据权利要求105所述载体，其中所述受phoP调节区调节的基因是一种prg座位。
107.根据权利要求106所述载体，其中所述基因是prgH。
108.根据权利要求106所述载体，其中所述基因是prgA、prgB、prgC或prgE。
109.根据权利要求105所述载体，其中所述受phoP调节区调节的基因是pag座位。
110.根据权利要求109所述载体，其中所述pag座位是pagC。
111.根据权利要求105所述载体，其中所述第一DNA序列在所述载体上的定位可使所述第三DNA序列发生突变失活。
112.根据权利要求105所述载体，其中所述载体不能在野生型沙门氏菌菌株中复制。
113.根据权利要求105所述载体，其中所述编码异源蛋白的第一DNA序列处于受环境调节的启动子控制之下。
114.根据权利要求105所述载体，进一步包括处于受环境调节的启动子控制之下的编码T7聚合酶的一种DNA序列以及一种对T7转录敏感的启动子，所述T7转录敏感性启动子控制所述编码异源蛋白的第一DNA序列的表达。
115.给一种动物免疫接种使之具有抵抗由细菌引起的疾病的方法，该方法包括施用权利要求1所述菌苗。
116.根据权利要求115所述方法，其中所述细菌是沙门氏菌，所述菌苗是权利要求4所述菌苗。
117.给一种动物接种使之抵抗由细菌引起的疾病的方法，所述方法包括施用权利要求39所述菌苗。
118.根据权利要求115所述方法，其中所述细菌是沙门氏菌并且所述菌苗是权利要求41所述菌苗。
119.给一种动物接种使之抵抗由沙门氏菌引起的疾病的方法，该方法包括施用权利要求50的菌苗。
120.一种载体，含有编码pagC基因产物的DNA。
121.含有权利要求120所述载体的细胞。
122.生产pagC基因产物的方法，包括培养权利要求121所述细胞并且从所述细胞或培养基中纯化出pagC基因产物。
123.pagC基因产物的一种纯化制剂。
124.在一种样品中检测沙门氏菌存在的方法，包括将所述样品与编码pagC DNA相接触，并且检测所述编码pagC的DNA与所述样品中核酸进行的杂交反应。
125.一种含有编码prgH基因产物的DNA的载体。
126.含有权利要求125所述载体的细胞。
127.制备prgH基因产物的方法，包括培养权利要求126所述细胞并且从所述细胞或培养基中纯化出prgH基因产物。
128.一种prgH基因产物的纯化制剂。
129.检测样品中存在沙门氏菌的方法，该方法包括将所述样品与编码prgH的DNA相接触，并且检测所述编码prgH的DNA与所述样品中核酸的杂交反应。
130.一种使细菌减毒的方法，所述细菌含有一种双成分调节系统，该方法包括使处于所述双成分系统控制之下的基因进行组成型表达。
131.根据权利要求124所述方法，其中所述细菌是沙门氏菌，并且所述双成分系统是phoP调节区。
132.一种细菌细胞，该细菌的phoP调节子中发生了第一突变，在芳香族氨基酸合成基因中发生了第二突变而使细菌减毒。
133.根据权利要求132所述细菌细胞，其中所述细菌细胞是沙门氏菌细胞。
134.根据权利要求133所述沙门氏菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是鼠伤寒沙门氏菌细胞。
135.根据权利要求133所述沙门氏菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是肠炎沙门氏菌。
136.根据权利要求135所述沙门氏菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是Salmonella pylorum细胞。
137.根据权利要求135所述沙门氏菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是甲型副伤寒沙门氏菌细胞。
138.根据权利要求135所述沙门氏菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是乙型副伤寒沙门氏菌细胞。
139.根据权利要求133所述沙门氏菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是猪霍乱沙门氏菌细胞。
140.根据权利要求133所述沙门氏菌细胞，其中所述沙门氏菌细胞是伤寒沙门氏菌细胞。
141.根据权利要求133所述细菌细胞，其中所述第一突变含有位于phoP/phoQ座位中的不可回复性无效突变。
142.根据权利要求141所述细菌细胞，其中所述突变包括至少缺失了100个核苷酸。
143.根据权利要求142所述细菌细胞，其中所述突变包括至少缺失了500个核苷酸。
144.根据权利要求143所述细菌细胞，其中所述突变包括至少缺失了750个核苷酸。
145.根据权利要求144所述细菌细胞，其中所述突变包括在所述phoP/phoQ座位中缺失了第376-1322位核苷酸。
146.根据权利要求141所述细菌细胞，其中所述第二突变包括在AroA座位中的一个不可回复性无效突变。
147.根据权利要求141所述细菌细胞，其中所述第二突变包括在AroC/AroD座位中的一个不可回复性无效突变。
148.根据权利要求146所述细菌细胞，进一步包括在非芳香族氨基酸合成基因中的一个突变，其中所述突变给所述细胞提供了对所述非芳香族氨基酸的营养缺陷型。
149.根据权利要求148所述细菌细胞，其中所述氨基酸是组氨酸。
150.根据权利要求149所述细菌细胞，其中所述伤寒沙门氏菌具有基因型AroA-，His-，phoP/phoQ-。
151.根据权利要求150所述细菌细胞，其中所述伤寒沙门氏菌是TyH445。
152.根据权利要求134所述细菌细胞，其中所述第一突变包括在phoP/phoQ座位中的一个不可回复型无效突变。
153.根据权利要求152所述细菌细胞，其中所述突变包括所述phoP/phoQ座位的第376-1322位核苷酸的缺失。
154.根据权利要求152所述细菌细胞，其中所述第二突变包括位于AroA座位中的不可回复性无效突变。
155.根据权利要求154的细菌细胞，进一步包括在非芳香族氨基酸合成基因中的一个突变，其中所述突变给所述细胞提供了对所述非芳香族氨基酸的营养缺陷型。
156.一种含有权利要求132所述细菌细胞的菌苗。
157.一种基本上纯化的DNA，它含有编码pagD的序列。
158.根据权利要求157所述DNA，其中所述序列包括SEQ ID NO5的第91-354位核苷酸。
159.根据权利要求158所述DNA，进一步包括SEQ ID NO15的第4-814位核苷酸。
160.一种基本上纯化的DNA，它包括SEQ ID NO15的第4-814位核苷酸。
161.根据权利要求160所述DNA，其中所述DNA序列包括SEQ IDNO15的第562-814位核苷酸。
162.根据权利要求160所述DNA，其中所述DNA序列包括SEQ IDNO15的第4-776位核苷酸。
163.根据权利要求158所述DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上含有在SEQ ID NO6中给出的氨基酸序列。
164.一种基本上纯化的DNA，包含有编码envE的序列。
165.根据权利要求164所述DNA，其中所述序列含有SEQ ID NO5的第1114-1650位核苷酸。
166.权利要求165所述DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上具有SEQ ID NO7中给出的氨基酸序列。
167.一种基本上纯化的DNA，该DNA含有编码msgA的序列。
168.根据权利要求167所述DNA，其中所述序列含有SEQ ID NO5的第1825-2064位核苷酸。
169.根据权利要求168所述DNA，进一步含有SEQ ID NO5的第1510-1824位核苷酸。
170.一种基本上纯化的DNA，包括SEQ ID NO5的第1510-1760位核苷酸。
171.权利要求168所述DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上含有SEQ ID NO8中给出的氨基酸序列。
172.一种基本上纯化的DNA，它包括编码envF的序列。
173.根据权利要求172所述DNA，其中所述序列含有SEQ ID NO5的第2554-3294位核苷酸。
174.根据权利要求173所述DNA，进一步包括SEQ ID NO5的第2304-2553位核苷酸。
175.权利要求173所述DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上含有SEQ ID NO9中给出的氨基酸序列。
176.一种基本上纯化的DNA，它含有SEQ ID NO5中给出的序列或其片段。
177.一种基本上纯化的DNA，它含有SEQ ID NO10中给出的序列或其片段。
178.一种基本上纯化的DNA，它含有编码prgH的序列。
179.根据权利要求178所述DNA，其中所述序列含有SEQ ID NO10中的第688-1866位核苷酸。
180.根据权利要求179所述DNA，进一步含有SEQ ID NO10的第1-689位核苷酸。
181.权利要求179所述DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上含有SEQ ID NO11中给出的氨基酸序列。
182.一种基本上纯化的DNA，它含有编码prgI的序列。
183.根据权利要求182所述DNA，其中所述序列包括SEQ ID NO10的第1891-2133位核苷酸。
184.根据权利要求183所述DNA，还含有SEQ ID NO10的第1-689位核苷酸。
185.权利要求183所述DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上含有SEQ ID NO12的氨基酸序列。
186.一种基本上纯化的DNA，它含有编码prgJ的序列。
187.根据权利要求186所述DNA，其中所述序列包含SEQ ID NO10的第2152-2457位核苷酸。
188.根据权利要求187所述DNA，进一步含有SEQ ID NO10的第1-689位核苷酸。
189.权利要求187的DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上含有SEQ ID NO13中给出的氨基酸序列。
190.一种基本上纯化的DNA，它含有编码prgK的序列。
191.根据权利要求190所述DNA，其中所述序列含有SEQ ID NO10的第2456-3212位核苷酸。
192.根据权利要求191所述DNA，进一步包括SEQ ID NO10的第1-689位核苷酸。
193.权利要求191的DNA及其简并变异体，其中所述序列编码一种产物，该产物基本上含有SEQ ID NO14中给出的氨基酸序列。
194.一种细菌细胞，在选自于pagD、pagE、pagF、pagG、pagH、pagI、pagJ、pagK、pagL、pagM、pagN、pagP、envE和envF的一个或多个基因中发生了突变而使该细菌减毒。
195.一种细菌细胞，在选自于pagC、pagD、pagJ、pagK、pagM和msgA的一个或多个基因发生了突变而使细菌毒力减低。
196.一种细菌细胞，在选自于prgH、prgI、prgJ和prgK的一个或多个基因中发生了突变而使细菌毒力减低。
全文摘要
一种细菌细胞，由于在phop调节子中发生第一突变以及在芳香族氨基酸合成基因有第二突变而使细菌毒力减低，以及在一个或多个受phop激活的基因或一个或多个受phop阻遏的基因中发生了突变而毒力被降低的细菌细胞。
文档编号A61P31/04GK1130923SQ94193330
公开日1996年9月11日 申请日期1994年7月7日 优先权日1993年7月9日
发明者塞缪尔·I·米勒Iii, 约翰·J·梅卡兰诺斯 申请人:杰纳勒尔医疗公司