与抗生素有关的腹泻的治疗的制作方法

专利名称：与抗生素有关的腹泻的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及与抗生素相关的腹泻包括与艰难梭菌(Clostridiumdifficile)相关的腹泻(CDAD)和假膜性结肠炎(PMC)的治疗。更具体地说，本发明是关于与CDAD相关的艰难梭菌毒素A的中和。
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如同这里具体地和单独地包括了上述各个刊物、专利或专利申请的文字内容一样，这里在同等程度上将上述刊物、专利或专利申请的公开内容作为整体进行了参考。
背景技术：
在医院或长期护理机构的大部分老年患者中，厌氧生物艰难梭菌是与抗生素相关的细菌性腹泻和假膜性结肠炎(PMC)的主要致病因素[1，2]。在成年人结肠中，该生物体不能与正常菌群成功地竞争，但当正常肠道菌群被改变(例如通过抗生素治疗)时，艰难梭菌就能大量聚集肠道。抗生素治疗占所有与艰难梭菌相关的腹泻(CDAD)病例的98％。但是，任何改变正常菌群的诱发疾病，包括任何需要广泛免疫抑制治疗的疾病，也可导致CDAD的发生。例如，最近的证据表明艾滋病患者也是患CDAD的高危险者。
艰难梭菌产生两种外毒素，毒素A(肠毒素)和毒素B(细胞毒素)，它们对引起CDAD起重要作用。毒素A对这种疾病起重要作用。其作用是与肠道上皮细胞结合，导致这些细胞的破裂并引起向肠道分泌液体由。毒素A引起的这些保护性上皮细胞的破裂是导致腹泻产生的关键一步。一旦上皮细胞出现损害，有效的细胞毒素B便可进入下层敏感组织并带来其它临床症状。
已发现毒素A表现出外源凝集素样活性，使其与上皮细胞上的寡糖受体结合。已鉴别出作为毒素A潜在受体的几种寡糖序列，包括下列结构[5-7]αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAcβGal(1-4)βGlcNAc(人血型抗原X)(1-3)αFucβGal(1-4)βGlcNAc(人血型抗原Y)(1-2) (1-3)αFuc αFucβGal(1-4)βGlcNAc(人血型抗原I)(1-6)βGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc另外，用具有末端αGal(1-3)βGal(1-4)βG1cNAc寡糖序列的牛甲状腺球蛋白亲合柱已获得了高度纯化的毒素A制剂[8.9]。
现在对患CDAD或PMC的患者的治疗是除去上述有害物质并开始口服抗生素甲硝哒唑或万古霉素，同时进行流体替代[3，14]。万古霉素仅在患者对甲硝哒唑治疗不能忍受或不敏感的某些情况下使用。另外，由于万古霉素价格昂贵，故不能常规性使用。这种治疗方式对患CDAD或PMC患者的有效率约80％。约20％的病人在停止抗生素治疗后又出现腹泻[15]。在这些个体中，还会间断地出现腹泻，直至重新建立起正常肠道菌群并降低艰难梭菌的数量。这是一个缓慢过程，因为每当发生腹泻时服用抗生素，如甲硝唑破坏了正常肠道菌群的平衡。
唯一的另外一种去除肠道毒素活性治疗CDAD和PMC的方法包括使用数克数量的阴离子交换树脂，如与抗生素结合口服给予消胆胺和降脂2号树脂。这种方法已用于治疗患轻度至中度疾病的患者，以及多次腹泻发作的病人[16，17]。这种治疗形式在这种疾病的治疗中仅获得少许进步[18]。除了离子交换树脂效力差的缺点外，还有一些与使用树脂有关的其它缺点。离子交换树脂不与毒素A特异性结合。因此，它们可与抗生素本身结合，导致肠道内抗生素水平不能达到最佳。另外，如果患者接受了其它与离子交换树脂结合的药物，则会降低药效。离子交换树脂的另一个缺点是由口服这些化合物引起的令人讨厌的味觉和余味。
就样品中毒素A的存在的诊断方法来说，一种测定样品中艰难梭菌的方法是培养该样品。该方法的缺点包括所需时间长以及非致病艰难梭菌即非—毒素产生菌菌株的干扰。其它方法包括使用特异的抗血清或单克隆抗体。美国专利号4,863,852和5,098,826描述了通过使用含毒素A和生物学受体的试剂来检测艰难梭菌毒素A的方法，其中受体包括与载体结合的αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc、X和Y抗原寡糖序列。
从上面的叙述可见，需要一种可治疗与抗生素相关的腹泻的化合物。优选的化合物应是非侵害性给药，如口服。
木发明概述本发明提供了治疗由艰难梭菌引起的与抗生素相关的腹泻的组合物和方法。
一方面，本发明提供了从怀疑含所述毒素A的样品中结合并除去毒素A的方法，该方法包括在使其中所述毒素A被吸附到载体上的条件下将所述样品与寡糖序列相接触，寡糖序列通过非肽基相容性连接臂与固态惰性载体共价连接，其中所述寡糖序列与毒素A相连；以及从样品中分离含被吸附的毒素A的载体。
另一方面，本发明提供了一种治疗由毒素A介导的腹泻的方法，该方法包括给予需要这种治疗的受治疗者有效量的组合物，组合物中含有通过非肽基相容性连接臂与药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列，其中所述寡糖序列与毒素A相连，并且其中所述组合物能从胃肠道被排除。
另一方面，本发明提供了一种可用于治疗由毒素A引起的CDAD及相关疾病的药用组合物，该组合物包括通过非肽基相容性连接臂与药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列，其中所述寡糖序列与毒素A相连；以及药学上可接受的载体，其中所述组合物能从胃肠道被排除。
附图的简要说明

图1表明用含各种寡糖序列的SYNSORB板中和纯化的毒素A的血细胞凝集活性的结果。发现几种SYNSORBS有效地中和了毒素A的活性。
图2显示了用SYNSORB52和90中和毒素A的活性的浓度依懒性。在浓度为20mg/ml时两种SYNSORB均可有效地中和约75％以上的毒素A的活性。
图3表明在浓度为20mg/ml时用SYNSORB52和90中和毒素A活性的时间依懒性。
图4显示了几种SYNSORB与毒素A的结合亲合性。发现不同的SYNSORB具有不同的与毒素的结合亲合性。
对本发明的详细描述A.定义此处所用的下列术语具有下面的含义术语“与抗生素相关的细菌性腹泻”是指因抗生素疗法破坏了肠道微生物菌群的平衡，使致病生物体如艰难梭菌大量繁殖的疾病。这些生物体引起了腹泻。与抗菌素相关的细菌性腹泻包括如与艰难梭菌相关的腹泻(CDAD)和假膜性结肠炎(PMC)等。
术语“生物相容”是指对人体组织或体液的化学惰性。
术语“相容性连接臂”是指将寡糖结构与生物相容性固态载体隔开并且具有生物功能的部分，其中一个官能团能与载体的相应官能团相连，而另一个官能团能与寡糖结构的相应官能团相连。本发明中优选的相容性连接臂是非肽基间隔臂。
术语“假膜性结肠炎”(PMC)也被称作假膜性小肠结肠炎或肠炎，是指小肠和大肠的粘膜感染，并伴随着假膜性物质(包括纤维蛋白、粘液、坏死的上皮细胞和白细胞)的形成和进入大便。
术语“固态载体”是指寡糖序列可通过相容性连接臂与之相连接的惰性、固态物质。当体内使用时，固态载体应是生物相容性的。
术语“SYNSORB”是指合成的8-甲氧羰基辛基寡糖结构，其与衍生的硅胶颗粒红色硅藻土色谱载体pTM(Manville Corp.，Denver，colorado)(12)共价偶联。
术语“毒素A”是指引起CDAD及相关症状的艰难梭菌肠毒素。该毒素有植物凝集素样活性。
为本发明的目的，所有糖均用通常的三字母命名法来表示，除果糖为L—型外，所有糖除非另外指明均认为是D—型。并且所有糖均为吡喃糖形式。
B.合成可用本领域已知的方法完成寡糖结构的化学法合成。通常是用被适宜保护的单个的单糖装配这些物质。
所用的具体方法通常是根据所要合成的各个结构进行变动和优化。通常，寡糖糖苷的全部或部分的化学合成首先包括还原糖或单糖的异构碳原子上配糖键的形成。具体地说，在还原单位的异构中心选择性修饰天然存在或化学修饰的糖结构(糖基给体)的适宜保护形式，从而引入包括卤化物、三氯乙酰亚氨基化物、乙酰基、硫代糖苷等的离去基团。然后在本领域已知的催化条件下将给体与糖苷配基或碳水化合物受体的适宜形式反应，糖苷配基或碳水化合物受体中在其将建立配糖键的位置上具有一个自由羟基。本领域中已知许多种糖苷配基部分，它们可以适当构型与还原单位异构中心相连。
适当使用碳水化合物合成本领域中已知的相容性保护基团，会使合成的结构得以选择性修饰或者使其它糖单位与受体结构进一步相连。
配糖键形成后，可用糖苷进行其它糖单位的偶联或在选择的位置上进行化学修饰或者，在常规的脱保护之后，用于酶法合成。通常，将天然存在或化学修饰的糖单位化学偶联成糖苷是通过使用文献中大量记载的化学方法[21-37]来完成的。
本发明寡糖结构与之相连的固态载体可以是片状或颗粒状的形式。本领域中已知许多种生物相容性的固态载体物质。其实例是硅胶、合成硅酸盐如多孔玻璃，生物硅酸盐如硅藻土、含硅酸盐的矿物质如高岭土，以及合成多聚物如聚苯乙烯、聚丙烯和多糖。优选用于体内的固态载体粒度为从约10至500微米。特别优选的粒度为100至200微米。
寡糖结构是被共价连接或非共价(被动地)吸附在固态载体上。共价连接可以是通过载体上和寡糖结构的相容性连接臂上官能团之间的反应完成的。意外地发现通过相容性连接臂使寡糖结构与生物相容性固态载体相连得到了一种产物，它在固态载体存在的情况下仍能有效地去除毒素。用于间接成键的连接部分优选是有机的、有适当长度的(至少一个碳原子)生物官能化的分子，它仅仅是为了将寡糖结构从固态载体表面分开。
本发明的组合物优选用下式表示(寡糖-Y-R)n-固态载体。其中寡糖表示至少2个糖单位的寡糖基团，其基团与毒素A相连，Y是氧、硫或氮，R是至少一个碳原子的糖苷配基连接臂，固态载体如上面所定义的，n为大于或等于1的整数。可使用含约2至10个糖单位的寡糖序列。优选含约3至5个糖单位的序列。
本领域中已知许多糖苷配基连接臂。例如，已经公开了含对-硝基苯基基团(即-OC6H4pNO2)的连接臂[38]。在合成的适当时间，将硝基还原成氨基，该氨基可以被保护成N-三氟乙酰氨基。在与载体偶联之前除去三氟乙酰氨基，从而暴露氨基。
已公开了含硫的连接臂[39]。具体地说，该连接臂是从2-溴乙基基团衍生的，在与硫代亲核基团的取代反应中，其形成了具有各种末端官能团如-OCH2CH2SCH2CO2CH3和-OCH2CH2SC6H4-pNH2的连接臂。这些末端官能团可以与固态载体上的互补官能团反应，从而与固态载体形成共价键。该反应是本领域已知的。
已经公开了6-三氟乙酰氨基-己基连接臂(-O-(CH2)6-NHCOCF3)[40]，其中三氟乙酰氨基保护基可被除去，暴露用于偶联的伯氨基。
其它已知的连接臂的例子包括7-甲氧羰基-3，6二噁庚基连接臂[41](-OCH2-CH2)2OCH2CO2CH3)；2-(4-甲氧羰基丁烷羧酰氨基)乙基[42](-OCH2CH2NHC(O)(CH2)4CO2CH3)；烯丙基连接臂[43](-OCH2CH＝CH2)，其与适宜单体进行游离基共聚反应，生成共聚体；其它已知的烯丙基连接臂[44]是[-O(CH2CH2O)2CH2CH＝CH2]。另外，可以在2-氨基乙硫醇的存在下衍生烯丙基连接臂[45]，形成连接臂-OCH2CH2CH2SCH2CH2NH2。还公开了其它适宜的连接臂[21-23，25，26]。
用于将寡糖基团与固态载体共价相连的具体连接方法并不是关键。
优选地，糖苷配基连接臂是疏水性基团，最优选地，糖苷配基连接臂是选自下面的组中的疏水性基团，该组包括 ，-(CH2)5OCH2CH2CH2和-(CH2)8CH2O-。
我们发现与生物相容性固态载体如红色硅藻土色谱载体PTM共价连接的合成寡糖序列(SYNSORB)可用于连接毒素A。这些组合物适用于治疗CDAD和PMC。这些组合物中特别优选SYN-SORB，因为它无毒性，并且耐机械和化学沉淀。在使用大鼠的研究中(临床前研究广泛接受的模型，因为它们预示了人的反应)，发现SYNSORBs不受影响地从大鼠胃肠道通过。发现它们在口服后被完全、迅速地排除(在72小时中排除了99％)。
另外，SYNSORB上高密度的寡糖部分特别适用于连接毒素A，因为据信该毒素具有多个寡糖连接位点。
优选用非肽基连接臂作为本发明的相容性连接臂。使用糖肽并不理想，因为糖肽通常含有与同一蛋白质相连的多个不同的寡糖。寡肽还很难大量获得，并且需要昂贵和冗长的纯化。同样，使用BSA或HSA偶联物也不理想，因为当口服给药时其在胃肠道中的稳定性不好。
含毒素A连接单位的寡糖基团通过非肽基间隔臂与惰性固态载体的共价连接可以有效地从用于分析毒素A的存在的样品中结合并除去毒素A，或者从患CDAD的病人的肠道中结合并除去毒素A。当合成与该相容性连接臂相连的寡糖时(以非衍生形式)，可以获得高度纯化的组合物。其可与多种固态载体相连。
C.药物组合物通过使用包括一种或多种的与连接于固态载体的毒素A相连的寡糖结构的药物组合物，从而获得了本发明的方法。
当使用优选的口服给药方式时，可将这些组合物配制成各种形式。优选是液体或半固体形式。含有液体药用惰性载体如水的组合物可用于口服给药。也可使用其它药学上相容的液体或半固体。这些液体或半固体的使用是本领域技术人员已知的。
也优选能与半固体食品如苹果酱、冰激淋或布丁相混合的组合物。优选不具有令人不愉快的口味或余味的制剂，如SYNSORBs。也可用鼻胃管将组合物直接送入胃。
还可使用固态组合物，其可选择性地和便利地用于含药用惰性载体的剂型，这类载体包括常用的固态载体如乳糖、淀粉、糊精或硬脂酸镁，它们常常出现在片剂或胶囊形式中。SYNSORB本身还可不添加惰性药用载体来使用，特别适用于胶囊形式。
选择药物剂量，从而中和并消除被感染的患者肠道中发现的毒素A。有效剂量是从约0.25至1.25微摩尔寡糖/kg体重/每天，优选约0.5至1.0微摩尔寡糖/kg体重/每天。对于SYNSORB组合物，意味着约0.5至1.0gSYNSORB/kg体重/每天，它导致肠道中SYNSORB的浓度约20mg/ml。每天应给药3或4次，连续一周或直至解除临床症状。给药剂量水平和时间表可以根据所用的特定多糖构型以及受治疗者的年龄和病情来改变。发现完全去除毒素A活性的最适时间是在37℃约1小时，所用SYNSORB浓度为1ml试样中20mg。
在多至7天的时间内给予本发明的含寡糖组合物将有效地治疗CDAD和PMC。
如前面所讨论的，优选口服给药，但也可考虑其它给药方式如通过直肠给药。这些剂型的使用决定于所用的特定组合物以及接受治疗的特定患者。这些剂型可含有液态载体，其可以是油状的、水状的或被乳化的或含有适合于给药方式的某些溶剂。
可将组合物配制成单位剂量的形状，或者是多次或亚单位剂量的形式。对于先前已确定的期待剂量，口服液体组合物应优选含约1微摩尔寡糖/ml。
D.方法学我们发现艰难梭菌毒素A可以被与毒素结合的某些寡糖序列中和。特别是已发现通过非肽基相容性连接臂与固态载体共价相连的合成寡糖能有效地中和毒素A。这样的组合物的例子是结合并中和毒素A活性的某些SYNSORBs。
我们测试了几种通过8-甲氧基羰基辛基(MCO)间隔臂与红色硅藻土色谱载体P相连的寡糖序列中和毒素A的性能。所测试的结构物(也称作SYNSORBs)示于表1。如图1至4中所示，所测试的SYNSORBs中和至少约50％毒素A活性的能力是不同的。
本发明中用于与固态载体相连的寡糖序列是那些连接毒素A的寡糖序列。通过一个简单的体外试验可以快速测定寡糖与毒素A的连接亲合力，例如下面的实施例4中所描述的。为了本发明的目的，连接毒素A的与固态载体相连的寡糖序列是指那些能使血细胞凝集试验终点滴度至少降低50％的组合物。
然后用按上面所述的所测试的某些SYNSORBs研究这些寡糖组合物中和人粪试样中的毒素A的能力。
已经研究了志贺样毒素(SLTs)与化学合成的寡糖序列的连接[10]。
SLTs是一组细胞毒素，其由两部分组成A亚单位和B寡聚体。B寡聚体是毒素的连接部位，使之同宿主细胞受体连接。SLT毒素连接到含αGal(1-4)βGal决定基的糖脂受体上。A亚单位具有使哺乳动物细胞中的28s核糖体RNA脱嘌呤的酶活性(N-糖苷酶)。该酶活性破坏了被毒素感染的细胞进行蛋白质合成的能力。
SLT作用的位点是肾和肠系膜脉管系统中的内皮细胞，SLTs可引起能导致肾衰和尿中血红蛋白的损害。SLTs是溶血性尿毒症的致病因素。SLTs还部分地导致出血性结肠炎(出血性腹泻)。
另一方面，毒素A是一种肠毒素，其可导致液体分泌、粘膜损伤以及肠道感染。它是作为人中性白细胞的化学吸引剂。毒素A是一种单体蛋白。它引起单细胞中细胞素的活化并导致释放。这些炎性作用对引起假膜性结肠炎中所见的结肠感染起重要作用。
毒素A好象是与糖蛋白受体连接，糖蛋白受体的结构还有待于确定。还未完全了解作用机理，但认为毒素A是通过受体介导的内吞作用进入细胞并改变细胞肌动蛋白细胞骨架。毒素A受体被认为是与鸟嘌呤调节蛋白连接。毒素A是产生CDAD和PMC的第一步。
定义寡糖毒素A连接特异性的在先研究已经鉴别了几种毒素连接的结构要求[5-7]。终止于与2型核心(βGal(1-4)βGlcNAC)相连的α-Gal(1-3)βGal序列的寡糖已显示出对连接的重要性。另外，毒素A还识别带有与2型核心。半乳糖的2羟基或N-乙酰基葡糖胺的3-羟基相连的果糖的寡糖的。所选择的用于毒素中和研究的SYNSORBs包括具有这些结构特征的碳水化合物以及其它具有6型(βGal(1-4)βGlc)和1型(βGal(1-3)βGlcNAc)核心结构的寡糖。其它所选择的用于连接研究的SYNSORBs含有先前已显示出与毒素A相连的寡糖序列。
通过分析上层液相对于不添加任何SYNSORB的对照品对血细胞凝集实验中终点滴度的降低来测定毒素A吸附到SYNSORB上的量。结果示于图1。发现那些具有X、Y和αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc寡糖序列的SYNSORBs(SYNSORBs51、52和115)分别能有效地去除75、88和88％的毒素A活性。另外，含有先前未显示出与毒素A相连的寡糖序列的两种其它SYNSORBs(SYNSORBs9和90)也同样对中和毒素A活性有效。SYNSORBs2、5、104、105和l 34中和毒素A活性的约50％。仅含有MCO间隔臂的对照品SYNSORB(ASA)仅能轻微地中和毒素A的活性。
从而，我们发现中和毒素A的能力直接与同惰性载体相连的寡糖序列相关。图1的结果显示了αGal(1-3)βGal键对高亲合性毒素连接的重要性。另外，我们发现具有丰乳糖与N-乙酰葡糖胺(2型中心)或葡萄糖(6型)之间的β(1-4)键的寡糖序列显示出高亲合性毒素连接。我们进一步发现毒素A连接具有仅与半乳糖的2羟基相连的果糖的寡糖序列。
图1和图4中的结果显示了血细胞凝集实验中终点滴度的降低。在使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的组织培养分析中获得了类似的结果。这些研究表明当将SYNSORB加入纯化的毒素A制剂中时CHO细胞显示出相对于对照品的终点稀释度的降低。
已发现通过相容性连接臂与固态载体相连的几种不同的寡糖序列具有中和毒素A活性的能力。这些以及其它连接毒素A的序列可用于治疗CDAD和PMC。发现完全去除毒素A活性的最适时间为在37℃约1小时，所用SYNSORB浓度为1ml样品中20mg。因为每克SYNSORB约含0.25至1.0微摩尔寡糖，每日剂量中给予寡糖的总量将在7.5至30微摩尔的范围，所用肠道体积为4升。
还通过SYNSORB组合物中和人粪样中毒素A的能力表明了通过相容性连接臂与固态载体相连的寡糖序列治疗CDAD和PMC的用途。这些人体样品的实验可以预测体内结果，因为这一分析的体外条件与体内条件之间基本上没有组合物的或化学的变化。另外，分析条件接近于在人体肠道中所发现的实际条件，该实验已经被本领域技术人员接受为与人体使用大体相关。
表2中的结果表明SYNSORB52能有效地中和人粪样中毒素A的活性。通常，水样粪中毒素的量越大中和越有效。仅含低水平毒素的固态粪样中的毒素不太被有效中和。
通过口服含经相容性连接臂与固态载体共价相连的寡糖序列的组合物(例如SYNSORBs)可以治疗CDAD或PMC。例如，已发现SYNSORB完整地通过大鼠的胃。然后其与肠道中的毒素A结合。完整的SYNSORB同与之相连的毒素A随后排除，故而从患者中排除毒素A。
通过相容性连接臂与固态载体共价连接的寡糖序列，例如SYNSORB可用于治疗患多发性腹泻的病人。在腹泻开始复发时，让患者用SYNSORB治疗，从肠道中除去毒素A。毒素A的去除防止了对肠道内表面最初的组织损伤，从而防止或减少了腹泻。不需要进一步给予抗生素治疗。在肠道中使正常肠道菌群重新建立。这一治疗的优点是它不影响正常菌群在肠道中的重新繁殖。治疗到腹泻停止，使完全恢复。
除了对患反复性腹泻病人的用途外，用通过相容性连接臂与固态载体共价相连的寡糖序列如SYNSORBs进行治疗还可用于治疗患有或易于发展成CDAD或PMC的所有病人。与抗生素治疗结合使用SYNSORB将能够更有效地减少腹泻，使患者更快地恢复。
本发明的一个主要方面是出现在生物样品中的生理浓度的毒素A快速有效连接，从而能够分析这些样品中毒素A的存在和/或毒素A的量。典型地，生物样品是粪样。可用标准萃取技术提取并制备样品。然后在样品中的任何毒素A被吸附的条件下将样品或提取物同通过相容性连接臂与固态载体共价相连的毒素——结合寡糖序列相接触。
可以用任何适宜的检测体系在含寡糖的载体的表面直接测定毒素A。例如，放射活性的、生物素化的或荧光标记的对毒素A特异的单克隆或多克隆抗体可用于测定与载体连接的毒素A的量。本领域中已知许多与标准免疫技术类似的测定特异性结合配合物生成的方法。
E.实施例用下列方法进行后面的实施例的研究。
1.毒素A的纯化用略微改变的Sullivan等人的方法[13]从艰难梭菌的毒素产生菌株(ATCC43255，VPI菌株10463)分离毒素A。
在无氧罐中使艰难梭菌在2、3升脑心脏浸液肉汤中于37℃生长72小时。将粗培养物于5,000xg离心20分钏沉淀细菌。小心分出所得培养物上层液并加入固体硫酸铵(897g)达到60％的饱和度。将培养物上层液于4℃搅拌过夜，然后在10,000xg离心30分钟。将所得沉淀溶解于少量缓冲液A(50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5)中，对2-4升变化的缓冲液A透析。异用YMl00(截留100,000分子量)膜超滤浓缩。
将浓缩后的含毒素溶液加到用缓冲液A平衡的DEAE-Sephadex A-25柱上。用缓冲液A洗涤离子交换树脂除去未吸附的蛋白后，用含增长量的NaCl(从0.1至0.4M变化)的缓冲液A冲洗使柱子分段盐梯度展开。用含0.25M NaCl的缓冲液A从柱子中洗脱出毒素A活性，而用0.4M NaCl缓冲液A除去毒素B活性。
通过测定蛋白质浓度以及使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞毒素终点来检测每部分毒素的整体纯度和量。还通过测量使用兔红细胞的血细胞凝集活性来测定毒素A活性的量。含毒素B的部分不能对兔红细胞的血细胞凝集起作用，这决定了毒素B部分缺乏毒素A活性。
2.使用兔红细胞的血细胞凝集实验将新鲜的兔红细胞在磷酸缓冲的生理盐水(PBS)中洗涤一次并悬浮在浓度为4％(V/V)的冷PBS中。在U型微量滴定池中在冷PBS中制备含毒素A溶液的连续2-倍稀释液(50μl)。然后向每个池中加入等体积(50μl)兔红细胞，轻轻混匀微量滴定板。将滴定板于4℃保温4小时后，目测血细胞凝集滴度。
3.使用中国仓鼠卵巢细胞测定毒素活性。
用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞测定毒素A的细胞毒活性。将CHO细胞在5％CO2空气中于37℃保存在补充有10％胎牛血清的HamsFl2介质中。
将待测毒素A样品以l∶10稀释在Hams介质中并通过0.22微米注射滤器除菌过滤。将待测样品连续5-倍稀释于介质中，将各稀释液100μl加到用CHO细胞连成单层的滴定池中，然后在5％CO2空气中于37℃保温24小时。每份样品分析2次。
通过与未含毒素A的对照池比较，保温24小时后可以轻易看到细胞毒作用。24小时后用95％甲醇固定细胞并用Giemsa染色剂染色。通过比较含有和不含有SYNSORB样品的终点稀释度测定了中和研究中的中和百分度。
用下列实施例说明本发明，但并不意味着可理解为限制了本发明的范围。
实施例1筛选含寡糖的固态载体中和毒素A活性的能力将按上面所述制得的含纯化的毒素A的溶液(0.5ml)加到各种SYNSORBs上，各种SYNSORBs含有通过MCO相容性连接臂与固态载体共价相连的不同的寡糖序列。所用SYNSORB量的范围是从10.1至17.5mg。在1.5ml微量离心管中制备样品，将微量离心管在立式圆筒离心机上于室温保温2小时。
保温后，使SYNSORB置于管底部并小心分出上层液，制备上层液的连续二倍稀释液并按上面所述测定血细胞凝集终点。
通过比较样品终点与不加SYNSORB的对照品终点来测定SYNSORB存在下的终点降低程度。所用的另外对照品是仅含MCO(疏水8碳)间隔臂的SYNSORB(ASA)。
结果示于图1，并表明发现几种寡糖结构有效地中和了毒素A的活性。
实施例2用SYNSORBs52和90测定最佳结合条件在1.5ml微量离心管中向预先称重的每种SYNSORB加入1ml纯化的毒素A溶液，从而测定最大地中和毒素A所需的SYN-SORBs52和90的量。用12.8、21.6和43.3mg量的SYNSORB52测定SYNSORB52样品；用12.9、19.2和42.3mg量的SYNSORB90测定SYNSORB90样品。将样品在立式圆筒离心机上于37℃保温2小时。还测定了仅含毒素A溶液的对照样品。
通过比较含有或不含有SYNSORB样品的血细胞凝集实验的终点滴度测定了每份样品的中和的量。结果示于图2，结果表明约20mg的每种所测定的SYNSORB能中和至少75％的1ml毒素A溶液中的毒素A。
通过保温含1ml纯化的毒素A溶液和20mgSYNSORB52或SYNSORB90的微量离心管测定了最佳中和所需的保温时间长度。将样品在立式圆筒离心机上于37℃保温10、20、40.80或160分钟。
如上所述测定每个保温期间的中和程度。结果示于图3，结果表明保温约1小时(40和80分钟之间)能有效中和毒素A。
实施例3中和毒素阳性人粪样品中毒素A的活性从Alberta医院大学微生物实验室获得了毒素A阳性的人粪样品。将1ml每种粪样置于1.5ml微量离心管中，加入20mgSYNSORB52(预先用50μl PBS润湿)，将试管于37℃在立式圆筒离心机上保温4小时。还同时测定了没有SYNSORB的对照粪样品。保温后，将粪样在Eppendorf微量离心机中于14,000rpm离心10分钟。小心地分出所得上层液并置于干净的微量离心试管中。
用PREMIERTM艰难梭菌毒素A检测试剂盒(Meridian Diag-nostics，Cincinnati，俄亥俄)测定每份样品中毒素A的量。通过测定相对于不加SYNSORB的单独对照样品在450nm吸收度的降低来估算中和百分度。
结果示于表2，结果表明SYNSORB52能中和人生理样品中的毒素A活性。
实施例4连接亲合性的测定如实施例1中所述将各种SYNSORB与毒素A结合来估算各种SYNSORBs与毒素A的结合亲合性，如在先所述测定了用兔红细胞的血细胞凝集实验的终点滴度。能较有效地中和毒素A活性的SYNSORB具有与毒素A更高亲合性结合的寡糖结构。那些降低大于50％滴度的SYNSORB被视为与毒素A结合。
结果示于图4，并且表明按照这种判断标准有些SYNSORB(SYNSORBs52和68)结合毒素A，而其它的(SYNSORB34和89)看来似乎不结合毒素A。
按照本发明前面所述的技术对上述完成本发明的各种实施方案的模式进行改进是本领域技术人员显而易见的。上述实施例仅仅是本发明的示范，而不限制下面的权利要求书中所定义的范围。
表1.用于毒素A中和研究的SYNSORBsSYNSORB号结构号通用名 寡糖结构＊21 B αGal(1-3)βGal(1-2)αFuc52 H2型 βGal(1-4)βGlcNAc(1-2)αFuc93 B2 αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNA(1-2)αFuc34 4 N-乙酰基半乳糖胺βGal(1-4)βGlcNAc(1-2)αFuc51 5 X βGal(1-4)βGlcNAc(1-3)αFuc52 6 Y βGal(1-4)βGlcNAc(1-2)(1-3)αFucαFuo68 7 PK αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc89 8 Sialyl-半乳糖 αNeuAc(2-6)βGal(1-4)βGalc90 9 - αGal(1-3)βGal(1-4)βG1c104 10H6型αGal(1-4)βGlc(1-2)αFuc105 11B6型αGal(1-3)βGal(1-4)βGlc(1-2)αFuc115 12- αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc134 13- αGal(1-3)βGal(1-3)βGlcNAc＊所有寡糖通过标准疏水8碳间隔臂与红色硅藻土色谱载体P连接。
表2.用SYNSORB52中和粪样品中的毒素A活性粪样品中的毒素A水平a粪的类型b中和百分度++++SS 96++++SW 80++++SW 77
++++W70++++SS 64+++ SW 63++ W80++ W72++ SW 46+ S50+ S42+ W35+ W0a用PREMIERTM艰难梭菌毒素A检测试剂盒测定粪样中毒素A的水平。表2中的正号表示每种样品中毒素A的相对量，其是用下面所示的450nm处的吸收度所测定的量。还显示了对于粪样中毒素A水平使用SYNSORB52的平均中和百分度。
A450 平均中和百分度++++＞1.5 77±12％(n＝5)+++ 1.1-1.463％(n＝1)++ 0.6-1.066±18％(n＝3)+ 0.1-0.432±22％(n＝3)b所测粪样品的整体稠度。缩写S、SS、SW和W分别指固体、半固体、半水样和水样的。对于粪便稠度用SYNSORB52对毒素A活性的平均中和百分度如下S(31±27％，n＝3)，SS(80±23％，n＝2)，SW(67±16％，N＝4)和W(62±19％，n＝4)。
权利要求书按照条约第19条的修改11、根据权利要求7的方法，其中通过非肽基相容性连接臂与药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列是选自包括表1中给出的SYNSORBs号2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一组物质。
12、根据权利要求7的方法，其中所述连接臂是-(CH2)8C(O)-。
13、一种用于治疗由毒素A引起的CDAD和相关疾病的药学组合物，该组合物包括a)通过非肽基相容性连接臂与药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列，其中所述寡糖序列与毒素A连接；以及b)药学上可接受的载体，其中所述组合物能被从胃肠道排除。
14、根据权利要求13的组合物，其中所述寡糖序列有2至10个糖单位。
15、根据权利要求13的组合物，其中所述寡糖序列有3至5个糖单位。
16、根据权利要求13的组合物，其中所述寡糖序列是选自包括表1中给出的寡糖结构号1-3、5-7和9-13的一组物质。
17、根据权利要求13的组合物，其中所述通过非肽基相容性连接臂与所述药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列是选自包括表1中给出的SYNSORBs2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一组物质。
18、根据权利要求13的组合物，其中所述连接臂是-(CH2)8C(O)-。
权利要求
1.从怀疑含有毒素A的样品中结合并除去所述毒素A的方法，该方法包括a)在使其中所述毒素A被吸附到载体上的条件下将所述样品与寡糖序列相接触，寡糖序列通过非肽基相容性连接臂与固态惰性载体共价连接，其中所述寡糖序列与毒素A相连；并且b)从样品中分离含被吸附的毒素A的载体。
2.根据权利要求1的方法，其中所述寡糖序列有2至10个糖单位。
3.根据权利要求1的方法，其中所述寡糖序列有3至5个糖单位。
4.根据权利要求1的方法，其中所述寡糖序列是选自包括表1中给出的寡糖结构号1-3、5-7和9-13的一组物质。
5.根据权利要求1的方法，其中通过非肽基相容性连接臂与固态惰性载体共价连接的所述寡糖是选自包括表1中给出的SYN-SORBs号2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一组物质。
6.根据权利要求1的方法，其中所述连接臂是-(CH2)8C(O)-。
7.一种治疗受治疗者由毒素A介导的腹泻的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者有效量的含有通过非肽基相容性连接臂与药学上可接受的固态惰性载体相连的寡糖序列的组合物，其中所述寡糖序列与毒素A连接，并且其中所述组合物能从胃肠道排除。
8.根据权利要求7的方法，其中所述寡糖序列有2至10个糖单位。
9.根据权利要求7的方法，其中所述寡糖序列有3至5个糖单位。
10.根据权利要求7的方法，其中所述寡糖序列是选自包括表1中给出的SYNSORBs号1-3、5-7和9-13的一组物质。
11.根据权利要求7的方法，其中通过非肽基相容性连接臂与药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列是选自包括表1中给出的SYNSORBs号2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一组物质。
12.根据权利要求7的方法，其中所述连接臂是-(CH2)8C(O)-。
13.一种用于治疗由毒素A引起的CDAD和相关疾病的药学组合物，该组合物包括a)通过非肽基相容性连接臂与药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列，其中所述寡糖序列与毒素A连接；以及b)药学上可接受的载体，其中所述组合物能被从胃肠道排除。
14.根据权利要求13的方法，其中所述寡糖序列有2至10个糖单位。
15.根据权利要求13的方法，其中所述寡糖序列有3至5个糖单位。
16.根据权利要求13的组合物，其中所述寡糖序列是选自包括表1中给出的寡糖结构号1-3、5-7和9-13的一组物质。
17.根据权利要求13的组合物，其中所述通过非肽基相容性连接臂与所述药学上可接受的固态惰性载体共价连接的寡糖序列是选自包括表1中给出的SYNSORBs2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一组物质。
18.根据权利要求13的组合物，其中所述连接臂是-(CH2)8C(O)-。
全文摘要
本发明涉及用连接艰难梭菌毒素A的寡糖组合物治疗与抗生素有关的腹泻，包括与艰难梭菌有关的腹泻(CDAD)和假膜性结肠炎(PMC)的方法。更具体地说，本发明是关于与CDAD相关的艰难梭菌毒素A的中和。
文档编号A61K47/48GK1140415SQ95191615
公开日1997年1月15日 申请日期1995年2月9日 优先权日1994年2月14日
发明者L·D·赫尔兹, G·D·阿姆斯特朗格 申请人:辛索尔布生物技术有限公司