专利名称：2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物作为结肠癌化学预防剂和化学治疗剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及结肠癌的化学预防和化学治疗。
背景技术：
目前，在美国，因结肠癌导致的死亡每年占恶性肿瘤死亡人数的11％。每10万人中即有62人患此疾病，最流行时每10万人将有300人患此疾病。该疾病是美国男性死亡的第三大病因，是女性死亡的第四大病因。因晚期诊断的结肠癌患者只有50％的非常可怜的5年存活率。外科手术和化学治疗是目前较好的治疗方法，它们不能提高存活率。需要对已知有发展为结肠癌的较大的危险的患者群体进行早期安全、有效的预防性治疗的方法。
类花生酸和胃肠细胞的分化功能类花生酸(eicosanoids)是肠胃上皮细胞生长、分化及其功能的重要的调节因子。目前，已知前列腺素系列的类花生酸产物可诱导粘液的分泌(Bechel and Kauffman(1981)Gastroenterology80770-776)和电解质及体液的分泌(Miller(1983)Am.J.Physiol.245G601-G623)。类花生酸也可以诱导主动运输(Bukhave and Rask-Madsen(1980)Gastroenterology7832-37)及增加上皮的复制能力(Konturek et al.(1981)Gastroenterology801196-1201)。这些反应将导致一种分化的、保护屏障系统的修复，该屏障系统与上皮细胞紧密相连，上皮细胞的顶端表面由一层致密的、结合有糖原的化学缓冲物所覆盖。在胃部和上部十二指肠中，这种屏障可保护其不受有利于消化的酸性和蛋白质水解环境的影响，而在结肠中，它可以保护结肠使其不受细菌和毒素的侵染。因此，不足为奇的是外源的、合成的前列腺素是主动细胞保护性的(White and Vane(1987).InJohn-son Ced.)Physiology of the Gastroenterology Tract，Voll，2nd ed.，New YorkRaven Press，pp 143-180)，并且找到作为辅助抗 疡治疗剂的治疗用途。胃肠(“GI”)系统因此演化为主动产生并依赖于存在于局部环境中的类花生酸产物的特定的分化的补体。由于所有类花生酸来源于一种共有的前体花生四烯酸(其前身由磷脂释放而来)，GI分泌粘液的细胞具有由磷脂酶A2(PLA2)激发的花生四烯酸相对较高的基础水平。
胃肠系统对其环境中的细菌、抗原和毒素具有一种基本的防卫机制，因此也具有引起侵入性的和快速的炎症反应的能力。这种反应也依赖于前列腺素系列(PG)和趋化性白细胞三烯系列(LTs)的类花生酸产物，并且在激活因子的刺激下，导致血液携带的嗜中性白细胞、巨噬细胞和免疫细胞的流入。每种侵染细胞有一种代谢其自身的磷脂及粘液和鲁米巴磷脂的能力，通过释放炎症的(分泌的)PLA，来扩增其花生四烯酸的释放，该酸再代谢为PGs和LTs。
虽然炎症细胞的渗入限制和摧毁了入侵的刺激物，但由炎症细胞的释放产物引起损伤的程度是明显的。嗜中性白细胞和巨噬细胞释放过氧化物(O2-)(Kitahora et al.(1988)Dig.Dis.Sci.33951-955)和过氧化氢(H2O2)(Tauber and Babior(1985)Free Radic.Biol.Med.1265-307)及蛋白酶(Ohlson et al，(1977)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem358361-366)。当广泛形成渗入时，发生上皮层的明显脱落，接着屏障功能遭到破坏。炎症反应消退之后需要重新获得最终最适的上皮保护屏障覆盖区。
慢性胃肠炎症和胃肠癌症诱变文献已充分记载，慢性胃肠炎症疾病，如溃疡性结肠炎(Lennard-Johnes et al.(1977)Gastroenterology731280-1285)，Crohn′s疾病(Farmer et al.(1971)Cancer28289-295)，及慢性萎缩性胃炎(Sipponen et al.(1983)Cancer521062-1067)都与发生继发性胃肠癌症的较大的危险性有关。尽管目前尚未证实其机制，但在多种急性炎症发作中发生可导致继发性转化、增大的增生和恶性肿瘤形成的三个重要的交叉途径。下面将讨论的是(1)增加的结肠自由基与致癌物负荷，(2)营养性的类花生酸的改变的调节，(3)介导细胞浸染的基因产物的诱导。
因炎症发作引起的改变的致癌物负荷结肠独特的暴露于由日常饮食化合物的代谢和象由结肠细菌分泌的胆汁酸一样的外源分泌物而产生一些基因毒性致癌物和肿瘤启动因的相当高的基础负荷中。高危人群比低危人群的大便中较高的诱变剂的发现支持了粪便致癌物和结肠癌诱导的相互关系(Reddyet al.(1980)Mut.Res.72511-515)。这种相关性也与下面的重复发现相一致，即饮食中纤维摄入量与结肠癌的发生呈负相关(Am-strong and Doll(1975)Int.J.Cancer15617-623)。据推测，纤维的保护效果是通过增加粪便体积而导致粪便中致癌物的稀释和减少传染时间，导致致癌物更迅速的消失。该结果给出了一种可能性，即如果减少粪便中致癌物的负荷量浓度则可能减少癌症的发生率；而增加致癌物的负荷量则可能增加癌症的发生率。在结肠致癌物中，这种负荷量的增加可能源于连续炎症事件的发生。
一个特别相关的例子是，炎症中性白细胞产生致癌物经依赖于L-精氨酸的氮氧化物(如过氧化氢)形成的亚硝酸铵(Grisham(1993)Gastroenterology104A243)。炎症细胞释放的其他氧化物包括过氧化物和过氧化氢，在某些过度金属如铁离子存在时，它们可产生高度反应性的和细胞毒性羟基(OH)(Grisham)(1990)BiochemPharmacol.392060-2063)。除增加的因炎症细胞涌入产生的增加的致癌物和自由基负荷外，已知花生四烯酸级联也能产生诱发代谢物。前列腺素H2(PGH2)的一种代谢物malondiadehyde(MDA)，在体外是一种直接起作用的诱变剂(Mukai and Goldstein(1976)Sci-ence191868-869)和动物的致癌基因(Basu and Marnett(1983)Carcinogenesis4331-333)它可在具有一种活性的环加氧酶途径的细胞中，通过凝血恶烷合成酶大量合成产生。 MDA可以产生类似于人体结肠P53基因相关的移码突变(Marnett，et al.(1985)Muta.Res.12934-46)。PGH合成酶自身是一种强有效的过氧化物酶，并且已表现出可以催化多种环烷的激活，形成诱变剂(Marnett(1981)Life Sci.29531-546)。
这些发现表明，花生四烯酸在胃肠道中的慢性和异常(炎症细胞驱使)是可以增加致癌物负载(在最大DNA合成期具有潜在的DNA突变的诱导作用)的一条途径。在由侵入的炎症细胞诱导的上皮剥脱之后的增加的细胞增殖可以导致对这类致癌物的作用敏感的细胞的数量。此外，增加的增殖可以用于事先由致癌物诱导和扩增突变(经克隆扩增)。
改变的类花生酸调节可驱使因炎症发作引起的细胞增生。另外有一种机制联系着肠胃炎症和肠胃癌症的病变，该机制可以扰乱正常的类花生酸调节。正如上述所讨论的，胃肠粘液上皮的正常分化功能将最终受内源类花生酸影响的多种生物活性相联系在一起。由于这些因子只在局部起作用，并且因活性代谢物的钝化一般只有较短的半衰期，急性炎症期间将急剧地改变类花生酸体内平衡的正常调节。
一旦中性白细胞和巨噬细胞侵入炎症位点，这些正常的动力学将急剧地改变。首先，炎症细胞连同它们自己一起带走大量多余的兴奋剂，如细胞因子、蛋白酶和生长因子(Adams and Hamilton(1984)Ann.Rev.Immunol.2283-318，Ohlsson et al.(1977)Physi-ol.Chem.358361-366，Nathan and Cohn(1980)InReny et al.(eds)，Textbook of Rhneumatology，New YorkW.B.Sanders，pp186-215)，并通过它们自身慢慢地激活细胞cPLA2(cPLA2)，释放花生四烯酸。第二，炎症细胞富含另一类PLA2，称之为分泌型或sPLA2(Seihamer et al.(1989)J.Biol.Chem.2645335-5338)。在胃肠疾病中的活性在最近已有文献记载(Minami et al.(1992)Gut33914-921与cPLA2不一样，sPLA2是由炎症细胞(Wright et al.(1990)J.Biol.Chem.2656675-6681)，血小板(Hayakawa et al.(1988)J.Biochem.104767-772)，软骨细胞(Lyons-Goirdano et al.(1989)Biochem.Biophys.Res.(ommun.164488-495)和平滑肌细胞(Nakano et al.(1990)FEBS Lett.261171-174)通过细胞激动素(Pfeilscifter et al.(1989)Biophys.Res.Commun.159385-394)，尤其是通过内源毒素(Oka and Arita(1991)J.Biol.Chem.2669956-9960)释放的。此外，由于细胞外环境含有最大的钙离子浓度，sPLA2一旦释放即不受调节。通过其释放主动水解存在细胞膜、细菌膜磷脂Sn-2位置上的以及一些饮食和脂蛋白来源的花生四烯酸和其它的脂肪酸。因去除许多这种磷脂上Sn-2脂肪酸而产生的溶血凝脂对周围的细胞具有很强的溶原化作用(Okada and Cyong(1975)Jpn.J.Exp.Med.45533-534)。因此，这种反应也能引起上皮细胞的裂解和非渗入区域的裸露，最终需要细胞增生来维持其屏障功能。
炎症反应和指导细胞侵染的基因激活炎症反应不仅扰乱了正常的类花生酸调节，而且也导致侵染细胞所必需的基因产物的激活。一种该产物，尿激酸胞浆素原活化子受体(UPAR)，一般由肠上皮细胞表达。它在细胞表面的固着可能是通过细胞表面的蛋白水解作用的正常小囊细胞迂移和脱皮的重要决定因素(Kristensen et al.(1991)J.Cell.Biol.1151763-1771)。在炎症细胞内，UPAR基因表达是由蛋白质激酶C的活化因子诱导的，该表达通过肿瘤起动子，如佛波醇酯TPA(Lund et al.(1991)J.Biol.Chem.2665177-5181)和各种细胞因子(Leud et al.(1991)EMBOJ.103399-3401)，所述因子诱导组织渗入所需要的一种侵染性表型(Stoppelli et al.(1985)Natl.Acad.Sci.USA824939-4943)。不足为奇的是，在几个具有转移潜力的肿瘤细胞系，包括来源于结肠癌的细胞(Pyke et al，(1991)Am.J.Patho.J.1381059-1067)中，可检测到高水平的uPAR的表达，尤为有趣的是，共培养实验表明，与其配体腺浆素原活化因子相比，侵袭潜力与uPAR的表达有更高程度的相关性(Ossowski et al.(1991)J.Cell Biol.1151107-1112)。因此，在结肠粘液细胞中，多重炎症反应将有利于uPAR的过量表达，从而使良性肿瘤获得一种侵染性表型。
胃肠粘液细胞对慢性炎症具有独特的敏感性，主要由于下面三条交叉途径引起的(1)上皮细胞处于高度的致癌物负荷的环境中，该负荷在炎症发生过程中将进一步增加；(2)内源和渗入的花生酸级联产物皆为营养因子；(3)它们自身对炎症因子的变异反应，包括为获得侵染性的表型所需要的基因产物的表达。这三条途径一起可能导致一个转化事件的发生和形成肿瘤诱导、发展以及发病，因此可以封阻类花生酸级联某些臂杆的因子在结肠癌的化学预防中是有用的。
作为结肠癌的前兆的息肉和畸变的小囊病灶目前普遍认为，腺瘤息肉是直肠结肠癌(Colorectal Cancer)的前兆，其外观、大小和重复出现将预示着发展为结肠癌的相对危险(参见Lotfi et al.(1986)Maryo Clinic Proc.61337-343)，虽然腺瘤息肉是结肠癌的前兆病灶，但人们也接受这一观点，即某些早期病理性损害异常腺管病灶是腺瘤息肉的前兆病灶。畸变小囊病灶(ACF)在外表正常的人体结肠粘液中易于鉴别，且以较大的数量和大小存在于扩散的结肠癌患者普通家族或患腺瘤息肉病的病人的样品中(Ronucucci et al.(1991)Human Pathol.22(3)287-294；Pretlow etal.(1991)Cancer Res.511564-1567)。
NSAIDS和结肠癌化学预防有证据表明，几个非类固醇抗炎症药剂(NSAIDS)可有效地减少负瘤动物的数量和降低结肠癌变大鼠模式中每只动物的肿瘤发生率(Narisama et al.(1981)Cancer Res.411954-1957；Pollard et al.(1983)Cancer Lett.2157-61；Moorghen et al.(1988)J.Pathol156341-347；Reddy et al.(1993)Gastroenterology104A443)。
当用最大耐受剂量的80％给药时，可使肿瘤发生率减少至高达70％。在对二甲基肼诱导的结肠癌发生的研究中，观察发现，Sulin-dac只在施用致癌物期间存在时才能减少肿瘤的发生，但在施用的致癌物17周后却不能减少肿瘤的发生(Moorghen et al.(1988)J.pathol.156341-347)。
在过去的几例研究中，测定了阿期匹林对结肠癌的化学预防治疗效果，这些研究结果涉及的范围从具有50％的减少结肠癌发病危险性(Kane et al(1988)Cancer Res.484399-4404)到具有50％增加的危险性(Paganimi-Hill et al.(1991)J.Natl.Cancer Inst.831182-1183)。然而，值得注意的是，任何对使用阿斯匹林和其它NSAIDS的人体的研究(尤其是过去的研究)，可能是有缺陷的，这是由于引起的经常性的胃肠出血，它使得可以在服用NSAIDS的人群中，通过潜血筛选法(Occult blood Screening)和乙状结肠镜术进行息肉或肿瘤的早期检测。
虽然过去对阿斯匹林的研究给出了可疑的结果，但最初在某些动物上使用NSAIDS的研究结果(总结于上)在人体试验中得到了重复。在一个随机的、安慰剂对照的双盲交叉研究中，NSAIDSSulin-dac表现出在9个患家族性息肉病的病人在不到4个月中使息肉退隐(Labayle et al.(1991)Gastroenterology101635-639)。此外，一旦撤除Sulindac，息肉则恢复生长。该发现具有重要意义，因为用消炎痛作同样的研究则对息肉的退隐没有影响(Klein et al.(1987)Cancer602863-2868)。虽然这两种NSAIDS都可通过抑制环加氧酶而具有抗炎症活性，但sulindac是一种前药(prodrug)，它可以通过结肠中的细菌转变为活性代谢物，即Sulindac硫化物(Shen and Win-ter(1975)Adv.Drug.Res.1289-245)。相反，消痛药以其活性形式被摄入，其中它主要被上部胃肠道吸收，用于系统释放(Hucker et al.(1966)J.Pharmacol.Exp.Ther.153237-249)。因此，Sudlinc向结肠中释放的活性代谢物的浓度很可能明显地高于消炎痛释放的浓度。该结果表明，观察到的NSAIDS明显的化学预防效果源于在粘液腔界面上药物的局部作用。
虽然NSAID抑制模式动物结肠肿瘤的发生这一事实表明通过肿瘤细胞环加氧酶介导的一种抑制机制，但目前尚缺乏证据证实这种机制。从用NSAID治疗的动物上切除肿瘤组织分泌的PGE2量急剧减少，这一结果与上面的假设相一致(Reddy et al.(1992)Car-cinogenesis131019-1023)。然而，大多数结肠肿瘤在栖居的细胞类型方面都是异质性的，几例报道证实了来源于直肠腺瘤(Colorec-tal adenocarcinomas)的上皮细胞系并不能产生较高水平的PGE2或其它前列腺素(Hubbar et al.(1988)Cancer Res.484770-4775)。然而，有关人体结肠组织上分离的细胞产生的类花生酸的报道表明肿瘤上皮细胞产生的PGE2水平与非肿瘤组织相似，而来源于肿瘤的单核细胞在类花生酸的合成水平上显著地高于正常细胞的合成水平(Maxwell et al.(1990Digestion47160-166)。因此，对NSAID抑制敏感的靶细胞不可能是上皮细胞，可能是某些其他产生较高水平PG的对上皮细胞有反应的栖居细胞(resident)。
优选的化学预防治疗法简述所有的NSAIDS都有明显的负作用。NSAIDS在其抑制环加氧酶产物方面并不具有组织特异性，肾脏和胃肠系统对其特别敏感。NSAIDS可减少由肾脏毒性引起的肾脏灌流(Clive and Stoff(1984)N.Engl.J.Med.310563-572)。由于肾上腺素对胃肠上皮的正常分化功能是必需的，因此，NSAID诱导的胃溃疡是导致与这类药物有关的致病率和死亡率的一个重要因素(Longman(1989)Gasteroenterology1041832-1847)。在下部肠道中，NSAIDS慢性疗法可引起介于直肠炎和全结肠炎(Pancolitis)之间的结肠炎(Tanner andRaghunat(1988)Digestion41116-120)。估计有25％的大肠和小肠穿孔和出血病人(Langman et al.(1985)Br.Med.J.290347-349)。最后，已经处于高度发展为直肠结肠癌危险的患有慢性肠炎的病人，因病情加剧不应采用含NSAIDS的非-5-ASA及阿斯匹林疗法(Rampton and sladen(1981)Prostaglandins21417-425)。因此，对结肠癌较理想的化学治疗药物可以是具有以下方面特性的药物(1)结肠特异性-它应该是一个前药，在上部胃肠道没有活性，但到达结肠后(类似Sulindac)可以转变成其活性形式。
(2)有限的吸收-对其前药及代谢物的吸收量应该减少到最低程度，特别是一旦转变成其活性形式之后。
(3)缺乏系统活性-人体一旦吸收，代谢钝化作用应该把药物转变成一种非活性状态，从而限制对肾脏和肠胃的影响。
(4)抗氧化性质-结肠特异性抗氧化活性进一步有助于降低致癌物负荷。
(5)类似于NSAID的抗炎症机制-活性代谢物应该抑制炎症诱导的类花生酸途径，然而，不损害基本修复途径的类花生酸抑制作用会是优选的。
总之，某些NSAIDS已表现出抑制致癌物的诱导的模式动物结肠肿瘤发生率及抑制人体息肉生长。虽然NSAIDS对肿瘤抑制的机制尚未得到证明，但这些药物可以调节胃肠类花生酸的产生和代谢。不幸的是，NSAIDS对胃肠有严重的副作用，从而妨碍了这些药物的正常使用。因此，寻找一种作为有效的化学预防剂而又没有副作用的NSAIDS将是非常合乎需要的。Chan的美国专利4,412,992描述了2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的制剂及其在治疗溃疡性结肠炎中的用途。
发明描述本发明的一个实施方案，提供了一种治疗结肠癌或有发展为结肠癌危险的患者的方法。该方法包括给病人施用一种有效量的药物组合物，该组合物包含具有以下通式的2-羟基-5-偶氮苯甲酸衍生物 ——其中，X为-SO2-或-CO-基，R为苯基或羧甲苯基或者是-(CH2)n-Y基团，其中Y为羟基、氨基、单烷基-或二烷基-氨基(其烷基部分含有的碳原子数可达6个)或羧基或磺酸基，n是1至6的整数，其中亚烷基上的一个或多个氢原子可以被氨基、单烷基-或二烷基-氨基(其烷基部分包含的碳原子数可达6个)或烷基取代，其中-(CH2)n-Y基团直接或经苯环与氮原子相连，但-R-NH-X-不能是-CO-NH-CH2-COOH基团；或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物；或者为2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物氧化产物的非毒性的药理学上可接受的盐。
在按照本发明的另一实施方案中，该方法的药物组合物基本上由2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物，或者2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或其活性代谢物的盐与固体或液体药物稀释剂或载体组成。
在本发明的另一个实施方案中，2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物为balsalazide。
在本发明的另一个实施方案中所述活性代谢物为5-ASA。
在本发明的另一个实施方案中所述活性代谢物的氧化产物为5-ASA的氧化产物。
在本发明的另一个实施方案中，5-ASA的氧化产物为2，5-二羟基苯甲酸(龙胆酸)或5-硝基水扬酸(Salicylate)。
在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物以每70公斤体重每天1至14克2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物，或者2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物的盐的日剂量对结肠癌或有发展为结肠癌危险的患者口头给药。
在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物以每70公斤体重每天1至14克2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物，或者2-羟基-5-苯基-偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物的盐的日剂量对结肠癌或有发展为结肠癌的患者直肠给药。
附图的简要描述
图1表示2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的化学结构，其未注册的商品名(generic name)为balsalazide。氨基水杨酸部分(5-氨基水杨酸)与载体分子(4-对苯氨基-β-丙氨酸(4-ABA)通过偶氮键相连。
图2表示5-ASA在0，0.1，1，0和10mM的剂量下对腺癌细胞系HT-29增生的作用效果。图中所示的细胞数量为三次重复实验的平均值。
图3表示5-ASA在0，0.1，1.0和10mM的剂量下对腺癌细胞系LS174T增生的作用效果。图中所示的细胞数为三次重复实验的平均值。
图4为在有或无balsalazide存在下用饮用水中的致癌物氧化偶氮基甲烷处理大鼠群体诱导的畸变结肠小囊数量的分析结果。
图5表示在低浓度下balsalazide和5-ASA的相对抑制反应。
图6A和6B分别表示对照动物和用AOM(20mg/kg)注射动物(第二次注射后6周)的整个结肠中畸变小囊病灶的分布情况。示出了含有1，2，3，4，或5或更多的病灶数量分别在每格从下至上的线中。
图7表示在暴露于细胞之前4天以各种浓度溶于介质中的5-ASA(黑色)和在即将暴露于细胞之前以10mM浓度的溶于介质中的5-ASA(白色)产生的对LS174T细胞增生的抑制作用。细胞再生长另外的四天后，进行定量分析。
图8A和8B分别表示由各种浓度的5-ASA的两种氧化产物，龙胆酸和5-硝基-水杨酸产生的结肠癌细胞增生的抑制作用。
实施发明的方式已发现2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物(特别是bal-salazide和其活性代谢物)对结肠癌的化学预防有效。这些2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物具有下列通式 其中X为-SO2-或-CO-基因，R为苯基或羧甲苯基或者为-(CH2)n-Y基团，其中Y为羟基、氨基、单烷基-或二烷基-氨基基团(其烷基部分含有的碳原子数可达6个)或羧基或磺酸基，n是1至6的整数，亚烷基中的一个或多个氢原子可由氨基、单烷基-或二烷基一氨基(其烷基部分含有的碳原子数可达6个)或者烷基取代。其中-(CH2)n-Y基团直接与氮原子相连或者通过苯环与氮原子相连，但R-NH-X-不能为-CO-NH-CH2-COOH基团此外使用的术语“2-羟基-5-苯基-偶氮苯甲酸衍生物”也包括该化合物的酯类或活性代谢物，或者该化合物或其酯或活性代谢物的非毒性的、药理学上可接受的盐。
术语“活性代谢物”指2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物在人体中的代谢产物，如通过结肠细菌的作用，该代谢产物可以抑制结肠癌细胞的增生。例如，下面将讨论的5-ASA即为balsalazide的一种活性代谢物。
术语“氧化产物”指把2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的活性代谢物(如5-ASA)暴露于象次氯酸盐或过氧化氢的氧化条件下产生的产物。
balsalazide钠盐是一种具有结肠特异性、非类固醇类、抗炎症的氨基水杨酸，在活动性溃疡性结肠炎的治疗方面有用。balsalazide和其一种初级代谢物可抑制培养的人结肠癌细胞的生长，balsalazide抑制用致癌物氧化偶氮基甲烷处理的动物中畸变小囊的形成。象其他的NSAIDs一样，balsalazide在人体直肠结肠癌的化学预防方面的效果。然而，balsalazide有三个重要的安全优点(1)药物的释放具有结肠特异性；(2)尚没有观察到可引起胃或十二指肠溃疡的迹象和(3)在迄今治疗的500多例病人中，对某些病人进行长达3年的观察，尚未报道有肾脏毒性。因此，balsalazide在结肠癌的化学预防方面具有既有效又安全的理想的结合。
药物的结肠特异性释放balsalazide为前药，该药物的无活性形式，象Sulindac一样，可通过结肠细菌的作用转变为一种有活性的抗炎症药物。如图1所示，balsalazide通过一个偶氮键把氨基水杨酸盐(5-氨基水杨酸(5-ASA))与一个惰性载体4-氨基苯-β-丙氨酸(4-ABA)相连。细菌的偶氮还原酶可以水解此键，释放5-ASA，产生局部作用。
有限的系统吸收当口服balsalazide时，通过上部胃肠道不能分解并且本质上也难以吸收。在人体血浆和尿中只发现仅吸收前药剂量的0.3％，99％的药物可完整地到达结肠部位。在结肠中，药物经过水解形成5-ASA和4-ABA，再与结肠粘液相互作用，转变成其N-乙酰形式。balsalazide单独给药产生的绝大部分5-ASA在96小时以后可转变为N-乙酰-5-ASA(NacSASA)，并可随尿液排出，而4-ABA及其N-乙酰代谢物则很少被吸收。由于5-ASA的乙酰代谢物为无活性形式，故也可减少释放的5-ASA的系统活性(Chan et al.(1983)Dig.Dis.Sci.28609-615)。
抗氧化性质如前面讨论的，具有有效的抗氧化剂性质的化学预防剂有助于减少结肠中致癌因子负荷和减少侵袭的炎症细胞释放的自由基对人体的伤害。5-ASA可以抑制精氨酸依赖性硝酸氧化物形成亚硝酸钠(Grisham(1993)Gastroenterology104A243)。此外，完整的balsalazide和5-ASA是自由基O2-和OH的有效的清除剂，当balsalazide和5-ASA与溃疡性结肠炎患者的直肠活体解剖物一起培养时，可减少90％以上的直肠粘液反应的氧化代谢物的产生。当在相似的浓度下使用时，这两种因子比抗氧化剂牛磺酸、抗坏血酸和N-乙酰半胱氨酸更为有效(Sinmonds et al.(1992)Gastroen-terology102A696)。
对上部胃肠没有作用的结肠抗炎症活性Balsalazide对几种感染结肠炎的实验动物和几例活动期溃疡性结肠炎病人(Green et al.(1993)Gastroenterology104A709)及静止期溃疡性结肠炎病人(Gariffer et al.(1992)Aliment Pharmacol Ther.6479-485)具有抗炎症活性。更重要的是，该药物表现出极好的胃肠耐受性。
Balsalazide和5-ASA在体外实验中抑制结肠癌细胞的增生。5-ASA和Balsalazide对人体结肠癌细胞表现为明显有效的生长抑制活性。
5-ASA的氧化产物在体外抑制结肠癌细胞的增生与5-ASA相比，5-ASA的氧化产物对人体结肠癌细胞显示出意想不到的生长抑制活性。
结肠癌化学预防和(或)化学治疗的方法本发明的2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物，特别是bal-salazide和其代谢物对结肠癌的化学治疗有用，它们最好以包含2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的药物组合物的形式给结肠癌或有发展为结肠癌危险的患者施用。所述药物组合物也可以包含一种或多种非毒性的、药理学上可接受的载体、赋形剂、和(或)稀释剂。口服是优选的。使用标准的药物配方技术，例如，Remington′s Phar-macentical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，Latest edition上描述的方法。
药物组合物可以片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、锭剂、液体或胶状物形式。供口服的片剂和胶囊可以以适于单位剂量用药的形式，并且可以含常规的赋形剂，这些例子有结合剂如糖浆、阿拉伯树胶、凝胶、山梨醇、黄著胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；填料如乳糖、糖类、玉米粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；片剂润滑剂如硬脂酸镁、二氧化硅、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂如马铃薯淀粉；可接受的润滑剂如月桂基硫酸钠。片剂可按照已知的常规制药实践中的方法进行包衣。口服液体制剂可以是水状或油状悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂，也可制成一种干物质，在使用之前再用水或其他合适的载体重新调制。这些液体制剂可含有常规的添加剂，例如悬浮剂(如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶、经氢化的食用油脂)。乳化剂(如孵磷脂，山梨醇单油酸盐或阿拉伯树胶)，非水相载体(包括食用油)(如杏仁油、精馏的椰子油、油脂如甘油、丙二醇或乙醇)，防腐剂(如甲基或丙基对羟基苯甲酸或山梨酸)，如果需要也可含有常规的风味剂或着色剂。
本发明药物组合物中活性物质的百分比是可变的，因为必须使药物调制成一定合适比例的剂量，以获得理想的疗效。总之，本发明的药物制剂经口头或直肠给药时应按每70公斤体重每天1至14克活性物质施用。以下说明性地而不是限制性地给出一些实施例。
实施例实施例1Balsalazide和5-ASA在体外抑制结肠癌细胞增生在体外用人腺瘤细胞HT-29和LS174T实验证实了Bal-salazide和其代谢物5-ASA对人体结肠癌细胞生长的抑制活性。细胞生长于补有10％的小牛血清的DME(Dulbeccos Modified Ea-gle)培养基中，于含5％CO2的氛围和37℃下培养。为进行生长实验，将细胞接种于24-孔组织培养皿中(2cm2/每孔，每孔中的细胞密度为20,000个)，并使其附着于孔中生长24小时，然后再改变培养基，用含试验药物的新鲜培养基代替。
将试验药物以所需的浓度溶于组织培养基中，并加入每个孔中。为了测定每个孔中的细胞数量，除去培养基，并用磷酸缓冲盐溶液冲洗细胞，然后再用胰蛋白酶-EDTA溶液培养细胞15分钟，直至细胞脱落。再从孔中移出脱落的细胞，用Coulter计数器(ZBI模型)进行细胞计数。如图2和图3所示，两种人体结肠癌细胞系HT-29和LS174T的生长随5-ASA浓度的升高而受到抑制。当5-ASA的使用剂量为10mM时，生长抑制程度分别为82％和85％。
比较研究子balsalazide及其两种代谢物5-ASA和4-ABA，以及乙酰水杨酸(阿司匹林)对癌细胞增生的作用效果。如表1所示，乙酰水杨酸共价(Covalently)抑制环加氧酶，在该试验中对癌细胞增生有强烈的抑制作用。母体药物balsalazide的抑制作用也是如此。然而，balsalazide的载体分子对癌细胞增生却没有作用。表I中所示的细胞数量为三次重复培养孔中的细胞平均数。
表1HT-29 LS174T条件 剂量 第10天的 占对照细胞 第10天的占对照细胞细胞数 的百分率 细胞数 的百分率对照 -1315800 - 709750 -乙酰水杨酸(10mM)146251.11 83002.24Balsalazide (10mM)475003.60 24925 3.515-ASA (10mM)512825 38.97 86751.224-ABA (10mM)1316625 100.06 768700 108.30为了设计来测定balsalazide和5-ASA的使用剂量与癌细胞生长抑制效果的反应相互关系的进一步的研究表明当使用HT-29或LS174T细胞进行实验时，这两种化合物都产生相似的抑制效果。为了进行剂量反应研究，采用一种灵敏的染料结合试验，可对96-孔培养皿中的多种因子和剂量进行同步检测。在加入试验药物之前24小时将细胞平板接种并使其粘附4天之后，对孔中细胞进行固定和用Sulforhadamine染料染色，再测定细胞密度。在495nm波长下，用96-孔的平板读数计测定染色的培养物的光密度(Skehan etal(1990)J.Natl.Cancer Inst.821107-1112)。
如图5所示，较低浓度的balsalazide比5-ASA始终产生更为明显的抑制反应。用HT-29细胞实验时，IC50值分别为5-7mM和11.8mM，而用LS174T细胞实验时，IC50值则分别为5.2mM和11.5mM。在5-ASA的最低试验浓度条件下(对LS174T为0.1-1.0mM，对HT-29则为0.1-4mM)，对两种细胞观察到可重复的统计学上显著增加的细胞数量(增加约20％)。这与以前其他人发表的研究结果一致，他们观察发现，较低浓度的其它NSAIDs可以诱导蛋白质合成的增加，而较高浓度的NSAIDs却抑制蛋白质的合成(Hial et al.(1977)J.Pharm.Exp.Therap.202446-452)。
实施例2balsalazide和代谢物对大鼠畸变小囊形成体的影响。
在致癌物诱导的结肠粘膜中，畸变小囊最初被描述为“体积增大、上皮变厚、小囊周区增大”(Bird et al.(1989)Cancer Surv.8189-200)。NSAIDs是大鼠体内致癌物氧化偶氮基甲烷(AOM)诱导畸变小囊形成的最强的抑制剂之一(Wargovich et al.(1992)J.Cell.Biochem.16G51-54)在用AOM长期对动物研究中已确证这些因子的抗肿瘤活性。因此，畸变小囊模型对体外研究balsalazide和代谢物的效能是理想的。
对畸变小囊诱导的抑制作用在大鼠上氧化偶氮基甲烷(AOM)诱导的结肠癌试验模型中，测定了balsalazide(BSZ)和其它代谢物5-氨基水杨酸(5-ASA)和4-氨基苯-β-丙氨酸(4-ABA)对畸变小囊体形成的抑制效能。
使用四组雄性F344大鼠，每组5只。大鼠为6-8周龄，开始的体重在总平均体重的+/-20％范围之内。按已发表的研究方法用AOM处理后，每头大鼠预期反应可形成100-400个畸变小囊(Wangovich et al.(1992)J.cell.Biochem.16G51-54)。利用这些比率和95％置信度的卡方分析，当观察发现每头动物用试验药物处理后形成的畸变小囊数达到50-75个时，每组5只动物样本数量使得可以对试验动物进行统计学上显著抑制(P＜0.05水平)的检测。
在按体重级别把大鼠分成测验组后，让实验动物适应10天。将试验药物溶于饮水中，浓度根据每天50ml的饮水量的平均值计算，使每头动物每天获得所需的剂量。在注射AOM之前，两组动物用药物处理一周，在第二周和第三周开始再通过两次皮下注射AOM，注射剂量为20mg/kg，诱导癌变的形成。然后再在第五周末给试验动物用药。
根据其他的在结肠炎模型方面的预临床研究，选择balsalazide用药剂量。一头500克大鼠，每天每公斤200毫克的剂量相当于一个70公斤体重的人每天用药14天，大约为活动性溃疡性结肠炎治疗剂量的两倍，为维持恢复期使用剂量的四倍以上。该剂量水平可使结肠中5-ASA的浓度为5-20mM。大鼠对balsalazide的最大耐受剂量超过12,000毫克/千克/天。
每周记录二次体重，每周测量两次每个笼子中动物的饮水量，饮水量按每个笼子中每个动物饮水的平均毫升数计算。
为了分析畸变小囊，在施药后的3周或5周末用CO2安死术处死大鼠。在直肠和肛门处切下大肠，取出大肠，并沿纵切面剖开。把大肠组织中的内含物清除干净，用盐溶液冲洗，在4℃下于2％的多聚甲醛溶液固定2小时，用0.2％亚甲蓝染色3-5分钟。再用盐溶液冲洗一次后，在40-100倍放大的显微镜下检查计数畸变小囊病灶的数量，同时测量结肠组织长度。在4℃下用乙二醇异丁烯酸盐包括经肉眼鉴别的病斑代表性样品；每个病灶3-4/um的切片用苏木精、曙红和苯胺蓝(HEA)染色，作组织学上计数检查。
为了分析胃十二指肠的糜烂，分别取出其基底、窦、和十二指肠，再分别按上述方法处理。根据描述的长度和严重度糜烂指数对胃糜烂进行记录(Peskar et al.(1986)Prostaglandins31283-287)。
结果如图4所示，示出了两次皮下注射氧化偶氮基甲烷一周或三周后检查的大鼠每cm纵向长度的结肠组织中畸变小囊的平均数。在两个不同时间的检查中，用balsalazide处理的动物比对照动物形成的小囊平均数少得多。第1周对畸变小囊平均值的抑制率为61.8％，第3周的抑制率为58.1％。
对畸变小囊进程的抑制图4中表示的数值取自于7-8cm结肠末端组织。在检查的早期点，该区域约含80％以上的总的畸变小囊病灶。因此，需再设计一个实验，在更长时间范围内，检查整个25cm的结肠组织，测定第二次注射AOM后，药物处理是否开始发生作用。此实验目的很有意义，因为当致癌物诱导的最初转化事件发生后，尤为重要的是证明化学预防剂对畸变小囊生长进程的抑制。
在此第二项研究中，8只动物分成一组，每组动物每周分二次注射氧化偶氮基甲烷。第二次注射24小时后，对一组动物开始用bal-salazide处理。六周以后分析检查畸变的小囊。大鼠在麻醉条件下，通过直肠滴注0.2％的亚甲基蓝，对小囊进行原位染色，然后再给大鼠去血，切除从肛门至盲肠的结肠组织，清洗用2％的多聚甲醛溶液固定2小时。在40x的放大镜下检查小囊数量。除计数病灶数量外，也检查每个病灶的畸变小囊的数量。如图6示出了这些研究结果。显然即使在第二次注射AOM后的开始的24小时，也观察到对畸变小囊病灶的极大抑制作用，该结果可与图4所示的原先的实验的结果相比较，总体上约60％的抑制作用。
Pretlow等(Pretlow et al(1992)Carcinogenesis131505-1512)用同样的癌症诱变模型研究报道了畸变小囊数量与最终肿瘤发展的相互关系。在其研究中，包含4个或更多的畸变小囊的病灶数量与肿瘤的形成非常相关，表明这些较大的病灶很可能发展为肿瘤。对上述实验结果进行分析，确定了balsalazide对畸变小囊数量(multi-plicity)的影响。这些结果如下面表II所示，balsalazide对含4个或更多畸变小囊的病灶数比含不到4个畸变小囊的病灶数的抑制作用更大。对含1-3个小囊的病灶，平均抑制率为57-61％(P＜0.003，Fischer准确测验)，而含4个或更多小囊的病灶数量平均减少72-76％(P＜0.001)。当含4个或更多小囊的病灶数与含3个或以下的小囊的病灶数的抑制结果相互比较时，用Fischer准确测验法，在P＜0.022水平上有显著差异。
表IIBalsalazide对畸变小囊数量的抑制作用所示数目为在每一8个动物组中在第二次注射AOM六周后测量的各种大小病灶的平均数数量1 2 3 4 5至8 共BSZ 10.3 19.1 15.3 8.59.6 63.75对照24 48.8 37.3 30.5 40.6 181.75％抑制率57±23％ 61±16％ 59±17％ 72±19％ 76±12％ 65±10％Fischar 0.001 0.001 0.003 0.0001 0.00010.001这些结果表明，含最多数量的病灶数的减少量几乎为含2-3个畸变小囊病灶数的减少量的两倍。当用Pretlow等的研究结果解释时，对实验动物在更晚一些时间检查时，这种抑制作用可能转化为对肿瘤形成的抑制作用。
实施例35-ASA的氧化产物在体外对结肠癌细胞增生的影响虽然上述实验中balsalazide对两类细胞表现出相同的抑制作用，但LS174T细胞似乎始终比HT-29细胞对5-ASA的作用更加敏感。此外，两类细胞对5-ASA的抑制反应在个别单独的实验中有一定差异，最大变化程度为70％，最小为10％。在寻找变异的原因实验中，研究发现在添加到细胞中前最少3天配制的5-ASA贮存液可一直产生较好的抑制效果。图7中显示出这种差异。
在该实验中，暴露于刚刚溶解的10mM5-ASA中的LS174T细胞4天后的生长率为对照细胞的82.7％。相比之下，暴露于在实验之前4天溶解于培养基的10mM5-ASA中的LS174T细胞4天后的生长率只有对照培养物的22.9％。这种显著差异说明5-ASA在有某种培养基成分存在时可被转变为一种更有活性的代谢物。
与5-ASA相关的重要活性之一是其抗氧化剂性质。的确，在肠炎治疗中的疗效被认为是由于它可以清除炎症细胞释放的自由基(包括O2-)，故而减少氧化损伤。这表明当5-ASA与组织培养基一起预培养时，观察发现的与5-ASA相关的抑制活性可能与一种发生的氧化事件相一致。为了验证这种可能性，用各种浓度的次氯酸钠使5-ASA发生氧化，然后再测定相应的对细胞生长的抑制活性。如下表III所示，增加次氯酸盐的用量可使5-ASA产生更大的抑制活性。
表III5-ASA暴露于次氯酸盐后细胞生长抑制活性的增加5-ASA(mM) 次氯酸钠(mM) 生长抑制增加％10 0010 0.01 210 0.05 410 0.1 810 0.2 2610 0.3 4210 0.4 48未氧化的5-ASA基本抑制活性为45％，0.4mMNaOCl的背景抑制活性不到2％其他人以前的研究已经表明，氧化条件(如露于次氯酸盐或过氧化氢下)可产生几种不同的5-ASA代谢物。两种这样的氧化产物龙胆酸(Dull et al(1987)Biochem.Pharmacol.362467-2472)和5-硝基-水杨酸(Laffafian et al.(1991)Biochem.Pharmacel.421869-1874)的作用已经阐明。鉴于上述结果，测定了5-ASA的这两种氧化产物对结肠癌细胞生长的抑制活性。如表IV所示，用四种不同的人体结肠癌细胞系实验时，两种代谢产物均可抑制细胞生长，5-硝基衍生物的作用似乎更强。balsalazide及其初级代谢产物5-ASA和两种可能的5-ASA氧化产物对每个细胞系的生长抑制作用概括性地列于下表IV中。
表IVBalsalazide和其代谢物对人结肠癌细胞增生抑制的IC50值，浓度为mM细胞系balsalazide5-ASA5-ASAox龙胆酸5-硝基水杨酸LS174T5.29 11.566.55 5.85 2.69
HT-29 5.7111.895.915.051.63LoVo5.0010.215.444.421.38HRT-18 3.8810.496.982.981.46本说明书中引用的所有出版物和专利申请以被特别地或单独指明本文一并参考的各个出版物或专利申请书相同的程度在此一并参考。
现已充分描述了本发明，本领域普通技术人员很清楚，在不偏离所附权利要求精神和范围的情况下可以进行许多变化和修改。
权利要求
1.一种治疗结肠癌或有发展为结肠癌危险的患者的方法，该方法包括给患者施用一种有效量的一种药物组合物，该药物组合物包含具有下通式的2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物 其中，X为-SO2-基或-CO-基，R为苯基或羧甲苯基或者是-(CH2)n-Y基团，其中Y是羟基、氨基、单烷基-或二烷基-氨基基团(其中的烷基部分含有的碳原子数可达6个)或羧基或磺酸基团，n为1至6个的整数，亚烷基上的一个或更多的氢原子可以被氨基、单烷基-或二烷基-氨基(其烷基部分包含的碳原子数可达6个)或烷基取代，其中-(CH2)n-Y基团可直接与氮原子相连，也可通过本环与氮原子相连，但-R-NH-X-不能是-CO-NH-CH2-COOH基团；或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物；或者为2-羟基-5-苯基-偶氮苯甲酸衍生物非毒性的、药理学上可接受的盐或其酯或其活性代谢物或活性代谢物的氧化产物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述药物组合物基本上由2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物，或者2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物的盐与固体或液体药物稀释剂或载体组成。
3.根据权利要求1的方法，其中2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物为balsalazide。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的活性代谢物为5-ASA。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的活性代谢物的氧化产物为5-ASA的氧化产物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的5-ASA的氧化产物为龙胆酸。
7.根据权利要求5的方法，其中5-ASA的氧化产物为5-硝基-水扬酸盐。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的药物组合物以每70公斤体重每天1至14克2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物，或者2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的盐或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化物的日剂量对结肠癌或有发展为结肠癌危险的患者口服给药。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的药物组合物以每70公斤体重每天1至14克2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物，或者2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的盐或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化物的日剂量对结肠癌或有发展为结肠癌危险的患者直肠给药。
全文摘要
本发明提供了一种化学预防或化学治疗结肠癌的方法。该方法包括给结肠癌或有发展为结肠癌危险的患者施用一种药物组合物，该药物组合物包含有效量的2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物，或者2-羟基-5-苯基偶氮苯甲酸衍生物的药理学上可接受的盐。或其酯或活性代谢物或活性代谢物的氧化产物。
文档编号A61K31/60GK1140994SQ95191519
公开日1997年1月22日 申请日期1995年1月6日 优先权日1994年1月7日
发明者L·K·约翰逊, M·H·斯雷森格 申请人:萨利克斯药物有限公司