(e)-n-(2-氨基-苯基)-3-{1-[4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-苯磺酰基]-1h-吡咯-3-基}-丙 ...的制作方法
【专利说明】(E) -N- (2-氨基-苯基）-3- {1 - [4- (1 -甲基-1H-吡 唑-4-基苯磺酰基]H Hh吡略_3-基卜丙稀酰胺甲苯 磺酸盐
[0001] 发明应用领域
[0002] 本发明涉及（E)-N-(2-氨基-苯基）-3-{1-[4-(1_甲基-IH-吡唑-4-基）-苯磺 酰基]-IH-吡咯-3-基}-丙烯酰胺盐，其在制药工业中用于药物组合物的制备。 技术背景
[0003] 细胞中的转录调节是复杂的生物过程。一个基本的原理是通过组蛋白即形成八聚 体组蛋白核心复合体的组蛋白H2A/B、H3和H4的翻译后修饰的调节。这些通过乙酰化或甲 基化作用在赖氨酸残基上及通过磷酸化作用在丝氨酸残基上进行的复杂的N-末端修饰构 成了所谓的"组蛋白编码"的一部分（Strahl&Ellis，Nature 403, 41-45, 2000)。在简单的 模型中，带正电荷的赖氨酸残基的乙酰化作用降低了对带负电荷的DNA的亲和力，所述DNA 就变得容易让转录因子进入。
[0004] 组蛋白的乙酰化作用和脱乙酰化作用是由组蛋白乙酰基转移酶（HAT)和组蛋白 脱乙酰酶（HDAC)催化的。HDAC与转录抑制复合物缔合，将染色质转变成无转录活性的沉默 结构（Marks et al. Nature Cancer Rev 1,194-202, 2001)。对立面适用于与转录激活因子 复合物缔合的HAT。迄今为止已经描述了三种不同类型的HDAC，即Mr = 42-55kDa的I型 (HDAC 1-3, 8)，主要位于细胞核中，并且对曲古霉素 A (TSA)的抑制敏感，Mr = 120-130kDa 且对TSA敏感的II型（HDAC 4-7, 9, 10)，和III型（Sir2同源物），其以对NAD+的依赖 性和TSA的不敏感性而显得非常特别（Ruijter et al. BiochemJ. 370, 737-749, 2003; Khochbin et al. Curr Opin Gen Dev 11, 162-166,2001 ；Verdin et al. Trends Gen 19, 286-293, 2003)。最近克隆了 Mr = 39kDa的HDAC 11，其显示出与I型和II型家族成员 的同源性（Gao et al. J Biol Chem 277, 25748-25755, 2002) QHAT和HDAC与细胞中的转录 因子和平台蛋白一起出现在大复合物中（Fischle et al. Mol Cell 9, 45-47, 2002)。出人 意料地，基于对340种基因和作为参照HDI的TSA的差异显示分析，估计所有基因中只有约 2%通过组蛋白乙酰化作用调节（von Lint et al. Gene Expression 5, 245-253, 1996)。用 SAHA对多发性骨髓瘤细胞进行的新研宄显示，能够将这些转录变化分成对例如细胞凋亡或 增殖的调节起到重要作用的截然不同的功能基因种类（Mitsiades et at. Proc Natl Acad Sci 101，pp540, 2004)。
[0005] 存在不同于组蛋白的物质。对于HDAC，这些物质包括诸如p53和TFII E/的转录 因子或诸如 Hsp90 的伴侣分子（Johnstone&Licht, Cancer Cell 4, 13-18, 2003)。因此HDAC 的正确名称会是赖氨酸特异性蛋白脱乙酰酶。由于这些发现，HDAC的抑制剂通过总体上调 节蛋白乙酰化作用不仅影响染色质结构和基因转录，还影响蛋白功能和稳定性。HDAC在蛋 白乙酰化作用中的这种功能可能对理解用HDI处理而引起的即刻基因抑制也很重要（von Lint et al. Gene Expression 5, 245-253, 1996)。在这点上，致癌性转化、细胞凋亡调节和 恶性细胞生长中涉及的蛋白都特别重要。
[0006] 不同的出版物都强调了组蛋白乙酰化作用对于癌症发展的重要性（综述见 Kramer et al. Trends Endocrin Metabol 12, 294-300, 2001 ;Marks et al. Nature Cancer Rev 1，194-202, 2001)。这些疾病包括
[0007] (i)与鲁宾斯坦-泰比综合征、癌症易染病体质相关的HATcAMP应答元件结合蛋白 (CBP)的突变（Murata et al. Hum MoI Genet 10, 1〇71-1〇76,2〇01)，
[0008] (ii)急性前髓细胞性白血病（APL)中的PML-视磺酸受体α融合基因表达的转录 因子引起的 HDACl 活性的异常募集（He et al. Nat genet 18,126-135,1998)，
[0009] (iii)非何杰金淋巴瘤中的过量表达的BCL6蛋白引起的HDAC活性的异常募集 (Dhordain et al. Nuceic Acid Res 26, 4645-4651，1998)，并且最终
[0010] (iv)急性粒细胞性白血病中的AML-ETO融合蛋白引起的HDAC活性的异常募集 (AML M2 亚型；Wang et al. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10860-10865, 1998)。在这种 AML 亚型中，HDACl活性的募集因此导致基因沉默、分化受阻和致癌性转化。
[0011] (V)小鼠中的HDACl基因敲除显示，HDACl通过抑制细胞周期蛋白依赖性激 酶抑制剂p21wafl和p27 kipl在胚胎干细胞增殖方面具有强大功能（Lagger et al.Embo J. 21，2672-2681，2002)。由于在许多癌细胞系中p21wafl由HDI诱导，因此HDACl可能也是 癌细胞增殖中的决定性组分。以初始的SiRNA为基础的在HeLa细胞中进行的基因敲低试 验支持这种假说（Glaser et al. 310, 529-536, 2003)。
[0012] (vi)Zhu等人最近报道，当功能性结肠腺瘤样息肉（APC)蛋白的损失造成wnt/ β-连接素/TCF信号通路的组成性活化时，HDAC2在结肠癌中过量表达（Cancer cell 5, 455-463, 2004)〇
[0013] 在分子水平上，许多与诸如曲古霉素 A(TSA)的各种HDAC抑制剂相关的公开数据 显示，许多癌症相关基因被上调或下调。这些包括被上调的p21waf1、细胞周期蛋白E、转化生 长因子MTGF0)、p53或希佩尔-林道（VHL)肿瘤抑制基因，而Bcl-XL、bcl2、缺氧诱导因 子（HIF) I α、血管内皮细胞生长因子（VEGF)和细胞周期蛋白A/D通过HDAC的抑制被下调 (综述见 Kramer et al. Trends Endocrin Metabol 12,294-300,2001)。HDAC 抑制剂在细 胞周期内的Gl和G2/M处阻滞细胞并使S期细胞耗竭，如作为实例的缩酚酸肽所示（Sandor et al.，British J Cancer 83, 817-825, 2000)。抑制 HDAC 的化合物诱导不依赖p53 和半胱 氨酸天冬氨酸蛋白酶3/8的细胞凋亡并具有广谱抗肿瘤活性。还描述了抗血管形成活性， 其可能与VEGF和HIFla的下调有关。总之，HDAC抑制在不同的分子水平上影响肿瘤细胞， 并靶向多种细胞蛋白。
[0014] 有意思的是，发现HDAC抑制剂诱导细胞分化并且该药理活性还可能导致其具 有抗癌活性。例如，最近显示，辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA)诱导乳腺癌细胞系的分化， 例如乳脂肪膜球蛋白（MFMG)、乳脂肪球蛋白和脂质的再合成（Munster et al.Cancer Res. 61, 8492, 2001) 〇
[0015] HDAC抑制剂越来越显示出与化学治疗以及靶向特异性的癌症药物具有合理 的协同作用。例如，SAHA与激酶/cdk抑制剂夫拉平度（Alemenara et al. Leukemia 16, 1331-1343, 2002)、LAQ-824 与 bcr-abl 激酶抑制剂格列卫（Glivec)在 CML 细胞中 (Nimmanapalli et al. Cancer Res. 63, 5126-5135, 2003)、SAHA 和曲古霉素 A(TSA)与依托 泊苷（VP16)、顺铂和多柔比星（Kim et al. Cancer Res. 63, 7291-7300, 2003)，以及 LBH589 与hsp90抑制剂17-烯丙基-氨基-脱甲氧基-格尔德霉素（17-AAG;George et al.Blood online, Oct. 28, 2004)显示出协同作用。还显示出HDAC抑制引起雌激素或雄激素受体在乳 腺癌和前列腺癌细胞中的再表达，具有使这些肿瘤对抗激素疗法再敏感的可能性（Yang et al. Cancer Res. 60, 6890-6894, 2000 ；Nakayama et al. Lab Invest 80, 1789-1796, 2000)〇
[0016] 文献中描述的各种化学类型的HDAC抑制剂有四个最重要的类型，即（i)异羟肟酸 类似物、（ii)苯甲酰胺类似物、（iii)环肽/酯肽类和（iv)脂肪酸类似物。最近Miller 等人公开发表了已知的HDAC抑制剂的全面总结（J Med Chem 46, 5097-5116, 2003)。关 于这些组蛋白脱乙酰酶抑制剂的特异性只公开了有限的数据。通常大多数基于HDI的异 羟肟酸盐对HDAC酶I型和II型没有特异性。例如，TSA抑制HDAC1、3、4、6和10的IC 5tl 值为约 20nM，而抑制 HDAC8 的的 IC5tl= 0.49 μ M(Tatamiya et al, AACR Annual Meeting 2004, Abstract#2451)。但也有例外，如试验性HDI Tubacin对II型酶HDAC6具有选择 性（Haggarty et al. Proc natl Acad Sci USA 100,4389-4394,2003)。此外，出现了苯 甲酰胺HDI对I型的选择性的数据。MS-275抑制I型HDACl和3的IC 5tl分别为0. 51 μΜ 和1. 7μΜ。相反，其抑制II型HDAC 4、6、8和10的IC5tl值分别为>100μΜ、82. 5μΜ和 94. 7 yM(Tatamiya et al, AACR Annual Meeting 2004, Abstract#2451)。迄今为止还不清 楚对HDAC I型或II型酶或者特定的单一同工酶的特异性是否应该在治疗效果和指数上更 优异。
[0017] 用HDAC抑制剂对癌症的临床研宄正在进行中，即用SAHA (Merck Inc.)、丙戊 酸、FK228/ 缩酷酸肽（Gloucester Pharmaceuticals/NCI)、MS275 (Berlex-Schering)、 NVP LBH-589 (Novartis)