艰难梭菌芽孢的抗体及其用途的制作方法

专利名称：艰难梭菌芽孢的抗体及其用途的制作方法
艰难梭菌芽孢的抗体及其用途相关专利申请的交叉引用本申请要求于2008年2月28日提交的美国临时申请序列号61/032，270的优先 权，将该美国临时申请以引用的方式并入本文。
背景技术：
艰难梭菌(Clostridium difficile)(即形成厌氧芽孢的革兰氏阳性菌)是在人 中引起伪膜性肠炎和抗生素相关性腹泻的主要原因并且是牵涉于医院引起的医院内感染 的最广泛的细菌之一(参见例如Wren，2006，Future Microbiol ； 1(3) :243_245)。根据疾 病控制中心(⑶C)，艰难梭菌在美国每年可造成成百上千例腹泻病例和至少5，000例死亡。 在1993年至2003年之间，艰难梭菌感染数目翻番，在2000年后增长最大。患有与艰难梭菌相关的疾病的个体在粪便中排出芽孢。艰难梭菌感染常常在住院 患者之间传播并且该生物体通常存在于医院工作人员的手上(参见，例如McFarland等人， 1989，N Engl J Med ；320 204-210)。需对感染艰难梭菌的患者进行隔离并采取防范措施 来避免感染蔓延。无症状的携带者可排出芽孢并且为了隔离目的而需要进行筛选(参见例 如，Kyne 等人，2000，N Engl J Med ；342 :390_397)。艰难梭菌芽孢能耐热、耐干燥和耐清洗剂，并且可在诸如手推车手柄、床栏杆、便 盆、盥洗室、浴盆、地板、器具、亚麻制品、电话、听诊器、温度计和远程控制器之类的环境表 面上存活多达70天。因而，环境表面是易感染源。需要在住院期间对患者的房间进行彻底清洁。显然需要监控清洁效果以及需要确认患者房间和环境表面没有艰难梭菌芽孢。目 前，还没有用于检测环境样品和患者样品中的艰难梭菌芽孢的易用快速方法。虽然目前有 市售的试剂盒(免疫测定法和分子测定法两种试剂盒)可用于检测艰难梭菌毒素，但这些 试剂盒不能检测艰难梭菌芽孢。因而，存在对用于检测艰难梭菌芽孢的快速易用系统的需要。

发明内容
本发明包括与艰难梭菌芽孢结合的分离的抗体。在一些实施例中，该芽孢是未萌 发的芽孢。在一些实施例中，该芽孢是萌发的芽孢。在一些实施例中，该抗体不与艰难梭菌 营养细胞结合。在一些实施例中，该抗体不与艰难梭菌毒素结合。本发明包括一种分离的抗体，该抗体与艰难梭菌菌株630的具有SEQID NO :1的假 定蛋白CD1021或假定蛋白CD1021的片段结合。在一些实施例中，该分离的抗体与假定蛋 白⑶1021的包含氨基酸残基505至604的片段结合。在一些实施例中，该分离的抗体与假 定蛋白CD1021的包含氨基酸残基30至120的片段结合。在一些实施例中，该分离的抗体 与假定蛋白CD1021的包含氨基酸残基194至293的片段结合。在一些实施例中，该分离的 抗体与假定蛋白⑶1021的包含氨基酸残基203至217的片段结合。在一些实施例中，该分 离的抗体与假定蛋白⑶1021的包含氨基酸残基333至347的片段结合。
本发明包括与氨基酸序列SEQ ID NO 2结合的分离的抗体。本发明包括与氨基酸序列SEQ ID NO 9结合的分离的抗体。本发明包括与氨基酸序列SEQ ID NO 10结合的分离的抗体。本发明包括与氨基酸序列EGSSLQYKGDDPESY(SEQ ID NO 3)结合的分离的抗体。本发明包括与氨基酸序列LKNETYKTKYHKYLE(SEQ ID NO 4)结合的分离的抗体。本发明包括一种分离的抗体，该抗体与艰难梭菌菌株630的具有SEQID NO 5的 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺 酶蛋白的片段结合。在一些实施例中，该分离的抗体与推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸 酰胺酶蛋白的包含氨基酸残基294至393的片段结合。在一些实施例中，该分离的抗体与 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸残基582至596的片段结合。 在一些实施例中，该分离的抗体与推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨 基酸残基64至78的片段结合。本发明包括与氨基酸序列SEQ ID NO 6结合的分离的抗体。本发明包括与氨基酸序列YKLKDKNGGTTKTVA(SEQ ID NO 7)结合的分离的抗体。本发明包括与氨基酸序列KFKEKPDADSIKLKY(SEQ ID NO 8)结合的分离的抗体。本发明包括单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段 抑制本发明的抗体与其抗原靶标的结合。本发明包括本发明的分离的抗体的抗原结合片段。在一些实施例中，本发明的分离的抗体是多克隆抗体。在一些实施例中，本发明 的分离的抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，本发明的分离的抗体不与枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)芽孢或产孢梭菌(Clostridium sporogenes)芽孢结合。在一些实施 例中，本发明的抗体和抗原结合片段带有标记。本发明包括包含一种或多种本发明的分离的抗体或它们的抗原结合片段的组合 物。本发明包括包含一种或多种本发明的分离的抗体或它们的抗原结合片段的试剂
品.ο本发明包括产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或转化的B细胞系。本发明包括分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括编码本发明单克隆抗体的 重链、轻链、重链可变区、轻链可变区或一个或多个互补决定区的核酸序列。本发明包括表 达载体，该表达载体包括这种分离的多核苷酸序列。本发明包括宿主细胞，该宿主细胞包括 这种表达载体。本发明包括制备抗艰难梭菌抗体的方法，该方法包括用包含艰难梭菌基因组所编 码的蛋白质的至少一部分的多肽，对宿主生物体以可有效产生响应所述多肽的抗体的量进 行免疫。在一些实施例中，所述包括由艰难梭菌基因组编码的蛋白质的至少一部分的多肽 选自 SEQ ID N0:1、SEQ IDN0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、 SEQ IDNO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10 以及它们的片段。在一些实施例 中，本方法还包括对抗体制备物进行纯化。本发明包括制备抗艰难梭菌抗体的方法，该方法包括使编码由艰难梭菌基因组编 码的蛋白质的至少一部分的核酸序列在免疫活性宿主生物体中表达。在一些实施例中，所
7述编码由艰难梭菌基因组编码的蛋白质的至少一部分的核酸序列编码选自SEQ ID NO=U SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ IDN0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10以及它们的片段的氨基酸序列。在一些实施例中，本 方法还包括对抗体制备物进行纯化。本发明包括组合物，该组合物包括至少两种分离的抗体或它们的抗原结合片段， 其中每种分离的抗体与艰难梭菌芽孢的独特抗原表位结合。在所述组合物的一些实施例中，至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或与假定蛋白⑶1021的多肽片段结 合。在一些实施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10 以及它们的片段。在所述组合物的一些实施例中，至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。在一些实施例中，所述推定的N-乙酰 基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段选自SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO 8以及它们的片段。在所述组合物的一些实施例中，第一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌 菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结合，并 且第二种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 的片段结合。在一些实施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段选自SEQ ID NO :2、SEQID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10以及它们的片段。在一些实施例中，所述 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段选自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8以及它们的片段。本发明包括试剂盒，该试剂盒包括至少两种分离的抗体或它们的抗原结合片段， 其中每种分离的抗体与艰难梭菌芽孢的独特抗原表位结合。在所述试剂盒的一些实施例中，至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO 1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结合。 在一些实施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQID NO 10 以及它们的片段。在所述试剂盒的一些实施例中，至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。在一些实施例中，所述推定的N-乙酰 基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段选自SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO 8以及它们的片段。在所述试剂盒的一些实施例中，第一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌 菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结合，并 且第二种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 的片段结合。在一些实施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段选自SEQ ID NO :2、SEQIDN0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10以及它们的片段。在一些实施例中，所述 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段选自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8以及它们的片段。本发明包括检测样品中艰难梭菌芽孢的存在的方法，该方法包括使所述样品与一 种或多种本发明的分离的抗体接触。本发明包括检测样品中艰难梭菌芽孢的存在的方法，该方法包括使所述样品与至 少两种分离的抗体或它们的抗原结合片段接触，其中每种分离的抗体与艰难梭菌芽孢的独 特抗原表位结合。本发明包括检测样品中艰难梭菌芽孢的存在的方法，该方法包括使所述样品与 第一种分离的抗体或其抗原结合片段接触，其中第一种分离的抗体与艰难梭菌芽孢的第一 抗原表位结合；以及使所述样品与第二种分离的抗体或其抗原结合片段接触，其中第二种 分离的抗体与艰难梭菌芽孢的第二抗原表位结合。在本发明方法的一些实施例中，至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO 1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结合。 在一些实施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQID NO 10 以及它们的片段。在本发明方法的一些实施例中，至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。在一些实施例中，所述推定的N-乙酰 基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段选自SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8以及它们的片段。在本发明方法的一些实施例中，第一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌 菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结合，并 且第二种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 的片段结合。在一些实施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段选自SEQ ID N02,SEQID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10以及它们的片段。在一些实施例中，所述 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段选自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7、SEQ ID N0:8以及它们的片段。除非另外指明，否则“一个”、“一种”、“所述”和“至少一种”可互换使用并且意指
一种或多于一种。


图1表示如下氨基酸序列之间的同源性来自艰难梭菌菌株630的假定⑶1021 蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :1，对应GenBank登录号ΥΡ_001087502)、来自艰难梭 菌QCD_32g58的假定CD1021蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :11，对应GenBank登录号 ZP_01804840)、来自艰难梭菌QCD-32g58的假定CD1021蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 12, 对应GenBank登录号ZP_01804841)、来自艰难梭菌QCD-32g58的假定CD1021蛋白的氨基 酸序列(SEQ ID NO :21，翻译自对应GenBank登录号NZ_AAML04000007的核苷酸461827至462825的区域)、来自艰难梭菌QCD-32g58的假定CD1021蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 22，翻译自对应GenBank登录号NZ_AAML04000007的核苷酸462824至463732的区域)以 及来自艰难梭菌Q⑶_66c26的假定⑶1021蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO :23，翻译自对应 GenBank登录号NZ_ABFD01000037的核苷酸15690至17597的区域的互补序列)。利用多 序列比对程序CustalW对这些序列进行比对，该程序可从http://WWW. ebi. ac. uk/Tools/ custalw/公开获得。所示出的共有序列为SEQ ID NO :38。在这六种假定蛋白中的至少四 种中相同的氨基酸残基在该共有序列中示出。共有序列中的“X”残基指示所比对的序列中 的两个或更多个在各自残基处显示出非同一性，或其指示缺少关于三个或更多个比对序列 中各自残基的序列信息。位于比对序列其中之一的任何给定位置的“ · ”符号指示该氨基 酸位置在相应的GenBank序列中未报道。
具体实施例方式本发明涉及与细菌艰难梭菌的内生孢子结合的抗体。这种芽孢特异性抗体可(例 如)用于检测环境样品、生物样品和食物样品中的艰难梭菌内生孢子。仅一些属的细菌(例 如芽孢杆菌属(Bacillus)和梭状芽胞杆菌属(Clostridium))能够形成内生孢子。细菌内 生孢子对恶劣的物理和化学条件具有高度耐受性，使得其成为自然界中存在的最耐久的细 胞类型。它们可存活于高热、干燥、辐射和许多破坏性化学试剂并且为该细菌的非活性形 式，该形式使得其能存活于亚最佳环境条件下。内生孢子可存活十分长的时间然后恢复生 长状态，即称为萌发的过程。由于内生孢子可耐受热、辐射、消毒剂和干燥，它们难以从医疗 和药物材料除去并且是污染的常见原因。本发明的抗体与细菌艰难梭菌的内生孢子(在本文中也称为“芽孢”)结合。如 本文所用，术语“抗体”或“多种抗体”可互换使用。本发明的抗体既与艰难梭菌芽孢的活 芽孢结合又与其灭活的芽孢结合。可通过多种方法(包括(但不限于)例如用福尔马林、 甲醛、戊二醛、化学消毒剂、高压蒸汽和紫外辐射处理)中的任一种对芽孢进行灭活。本发 明的抗体与萌发和未萌发的艰难梭菌芽孢两者结合。本发明的抗体与未萌发的艰难梭菌芽 孢结合并且不与萌发的艰难梭菌芽孢结合。本发明的抗体与萌发的艰难梭菌芽孢结合并且 不与未萌发的艰难梭菌芽孢结合。制备未萌发的芽孢和萌发的芽孢的方法是技术人员所 熟知的。简而言之，通常通过将细菌在诸如胰酶大豆琼脂之类的培养基上或在胰酶大豆肉 汤中培养直至多数细胞变成芽孢来制备细菌芽孢。通过离心收集芽孢并用诸如PBS之类 的缓冲液洗涤数次。可用醇处理悬浮液以杀死营养细胞并进行洗涤以收集芽孢(参见例 如，Long 禾口 Williams，1958，J Bacteriol 76 :332 禾口 Powers，1968，Appl Microbiol ；16 180-181)。可通过多种方法来引发芽孢萌发。参见(例如)Gould，1970，J Appl Bacteriol ； 33 34-49 ；Foerster 和 Foster，1966，J Bacteriol ；91:1168_1177 ；Moir 和 Smith，1990， Ann Rev Microbiol ；44 :531_553 ；以及美国专利申请系列号 2003/0175318A1。本发明的抗体与艰难梭菌芽孢结合并且不与其他形成内生孢子的细菌的芽 孢结合。本发明的抗体与艰难梭菌芽孢结合并且不与厚壁菌门(Firmicute)的其他 形成内生孢子的细菌的芽孢(例如由梭菌属或芽孢杆菌属的多个种中任一者产生 的内生孢子)结合。细菌梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的种包括(但不限于)醋 酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮 丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、肉 梭菌(Clostridiumcarnis)、气月中疽梭菌(Clostridium chauvoei)、反硝化梭 菌(Clostridiumdenitrificans)、发光梭菌(Clostridium fervidus)、蚁酸醋酸 梭菌(Clostridium formicoaceticum)、诺氏梭菌(Clostridium novyi)、巴氏杆 菌(Clostridium pasteurianum)、产气英月莫梭菌(Clostridiumperfringens)、败毒 梭菌(Clostridium septicum)、产芽抱梭菌(Clostridium sporogenes)、破伤风梭 菌(Clostridium tetani)、热乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)、热纤梭菌 (Clostridiumthermocellum)、热角军糖梭菌(Clostridium thermosacchroIyticum)、酪 丁 酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)、Bacillus 已garadh已erens、^ ^ If S" (Bacillusalcalophilus)、Ι 定㈱ Hfi If 胃(Bacillus amyloliquefaciens)、炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthracis)、萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus) λ/^Μ^ΜΙΤ^ (Bacillus azotoformans)、LHfi|f胃(Bacillusbadius)、 菌(Bacillus benzoevorans)、女子炭芽 包杆菌(Bacillus carboniphilus) λ^η 状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、嗜几丁质芽孢杆菌(Bacillus chitinolyticus)、环状芽 Ifilf胃(Bacilluscirculans) Λ Bacillus clarkii、&胃氏Ufelf胃(Bacillus clausii)、 凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulms)、科氏芽孢杆菌(Bacillus cohnii)、土壤芽孢杆菌 (Bacillus edaphicus)、Bacillus ehimensis、昔求芽胞杆菌(Bacillus fastidiosus)、 坚硬芽胞杆菌(Bacillus firmus)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、Bacillus fumarioli、梭状杆菌(Bacillusfusiformis)、吉氏芽抱杆菌(Bacillus gibsonii)、圆抱 芽孢杆菌(Bacillus globisporus)、盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)、Bacillus haloalkaliphilus、月兑 ft I 包 If 胃(Bacillushalodenitrificans)、而 H 包 If 胃 (Bacillus halodurans)、Baci 1 lushalophiIusΛ M 氏芽 包!f (Bacillus horikoshii)、 Bacillus horti、Bacillus infernos、异常芽胞杆菌(Bacillus insolitus)、0誉热芽 胞杆菌(Bacillus kaustophilus)、左方宠乳酸芽孢杆菌(Bacilluslaevolacticus)、 迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)、藓样芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、海洋 芽胞杆菌(Bacillus marinus)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、甲酉享芽孢杆 菌(Bacillusmethanolicus)、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mo javensis)、胶质芽孢杆 菌(Bacillus mucilaginosus)、蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、长里予芽孢杆菌 (Bacillus naganoensis)、；■芽 包 If 胃(Bacillus niacini)、Bacillus olernius、 苍白芽胞杆菌(Bacillus pallidus)、巴氏幼虫芽胞杆菌(Bacillus pasteurii)、 Bacillus pseudalcaliphilus、专性嗜碱芽孢杆菌(Bacillus Pseudofirmus)、假蕈状 芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、嗜冷芽胞杆菌(Bacillus psychrophilus)、冷角军 糖芽抱杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、短小芽胞杆菌(Baci 1 luspumiIus)、 施氏芽胞杆菌(Bacillus schlegelii)、Bacillussilvestris、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、Bacillus siralis、史氏芽胞杆菌(Bacillus smithii)、球形芽孢杆菌 (Bacillus sphaericus)、Bacillus sporothermoduransΛ >嗜热脂肪芽孢杆菌ο、 枯草芽孢杆菌、嗜热淀粉芽孢杆菌(Baci 1 Ius thermoamylovorans)、热链形芽孢杆 胃(Bacillus thermocatenulatus)、^！；阴肖 $ 包 If 胃(Bacillusthermocloaceae)、^ 反硝化芽孢杆菌(Bacillus thermodenitrificans)、热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidasius)、喜热芽抱杆菌(Bacillus thermoleovorans)、Bacillus thermosphaericus、苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis)、热泉芽胞杆菌(Bacillus tusciae)、死谷芽抱杆菌(Bacillus vallismortis)、Bacillus vedderi、Bacillusvulcani 禾口韦氏芽抱杆菌(Bacillus weihenstephanensis)。本发明的抗体可结合艰难梭菌芽孢并且不与诸如脱硫肠状菌属 (Desulfotomaculum)、芽胞乳杆菌属(Sporolactobacillus)、短芽孢杆菌属 (Brevibacillus)、芽胞乂V叠球菌属(Sporosarcina)禾口热放线菌属(Thermoactinomyces) 之类的其他细菌的芽孢结合。在一些实施例中，本发明的抗体与艰难梭菌芽孢结合并且不与枯草芽孢杆菌和产 孢梭菌的芽孢结合。本发明的抗体与艰难梭菌芽孢结合并且不与艰难梭菌营养细胞结合。本发明的 抗体与艰难梭菌芽孢结合并且不与其他形成内生孢子的细菌(包括任何本文所述的那些) 的营养细胞结合。在一些实施例中，本发明的抗体不与艰难梭菌、枯草芽孢杆菌和产孢梭 菌的营养细胞结合。培养各种各样的梭菌属和芽孢杆菌属菌种(包括(但不限于)艰难 梭菌、产孢梭菌和枯草芽孢杆菌)的营养细胞的方法是技术人员所熟知的。参见(例如) Madigan 等人，2003，Brock Biology of Microorganisms，PrenticeHall ；禾口 Cappucino， 2005，Microbiology Laboratory Manual，Benjamin Cummings。病原性艰难梭菌菌株产生多种毒素。得到最好表征的是肠毒素(毒素A)和细胞 毒素(毒素B)，这两种毒素可造成受感染患者中可见的腹泻和炎症(参见例如Gianfrilli 等人，1984,Microbiologica ；7 :375_9)。本发明的抗体与艰难梭菌芽孢结合并且不与艰难 梭菌产生的毒素结合，例如该抗体不与毒素A和/或毒素B结合。制备艰难梭菌毒素A和 毒素B以及测定抗体是否与艰难梭菌毒素A和/或毒素B结合的方法是技术人员所熟知 的。参见(例如)美国专利 No. 4，530，833 ；No. 4，533，630 ；No. 4，863，852 ；No. 4，879，218 ； No. 5，231，003 ；No. 5，610，023 ；No. 5，965，375 ；No. 6，503，722 ；No. 6，939，548 ；禾P No. 7，179，611。细菌内生孢子(包括艰难梭菌内生孢子)包封在由多种多肽的有序组装形成的多 层蛋白质结构中。内生孢子含有四个保护层核心、皮质、外壳和外壁。芽孢的最外层是外 壁，其为由蛋白质构成的薄的覆盖层。该外壁内部是芽孢外壳，其由高度交联的角蛋白和多 层芽孢特异性蛋白质构成。芽孢外壳是多种毒素分子不可渗透的并且还可含有涉及萌发的 酶。皮质处于芽孢外壳之下并且由肽聚糖构成。核心壁处于皮质之下并且包围原生质或内 生孢子的核心。核心具有标准的细胞结构，例如DNA和核糖体，但在代谢上是不活动的。本发明的一些实施例包括与艰难梭菌的芽孢特异性蛋白质(例如芽孢外壁蛋白、 芽孢外壳蛋白、芽孢皮质蛋白和芽孢内膜蛋白或芽孢核心蛋白)结合。这种抗体与存在于 一种或多种本文所述的厚壁菌门的形成内生孢子的细菌上的芽孢特异性蛋白质结合。在一 些实施例中，该抗体与存在于艰难梭菌中的芽孢特异性蛋白质结合但不与厚壁菌门的其他 形成内生孢子的细菌(例如菌株枯草芽孢杆菌和产孢梭菌)的芽孢特异性蛋白质结合。本发明的一些实施例包括与艰难梭菌的芽孢外壳组装蛋白结合的抗体。一种这类 芽孢外壳组装蛋白是CotH蛋白(在本文中也称为“cotH”)。CotH蛋白是芽孢外壳的结构 组分并且在枯草芽孢杆菌中已得到很好表征。其涉及引导外壳蛋白的组装并且涉及使外壳蛋白稳定。参见(例如)Naclerio 等人，1996，J Bacteriol ；178 (15) :4375_4380 和 Zilha 等人，1999，J Bacteriol ；181 =2631-2633) 本发明包括与艰难梭菌中的推定CotH蛋白结 合的抗体。已确定了艰难梭菌菌株630的完整基因组序列并且其可从GenBank 序 列数据库(由美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))、美国国家医学图书馆(NationalLibrary of Medicine (NLM))、美国 国立卫生研究院(Nationallnstitutes of Health (NIH))维护)获得。还可参见Sebaihia 等人，2006，Nat. Genet ;38 (7) :779_786)。菌株630是多重耐药的并且分离自患有严重 伪膜性结肠炎的患者，该疾病于1982年在瑞士的苏黎世传播给同一病房的许多其他患者 (Wren, 2006,Future Microbiol ； 1(3) :243_245)。因而，菌株 630 具有有完全毒力的、高度 传染性的耐药菌株的遗传属性。目前正努力去获得其他艰难梭菌菌株的基因组序列。桑格研究院(Sanger Institute) (Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton, Cambridge，UK)正在对艮难梭菌 菌株R20291的基因组进行测序。艰难梭菌菌株R20291分离自英国的斯托克·曼德维尔 (Stoke Mandevilie,UK)并且与北美超高毒性的BI菌株密切相关(参见ftp站点Sanger. ac.uk/pub/pathogens/cd/C_difficile_Bi_454. dbs)。圣路易斯市(St. Louis，M0)的华盛 顿大学(Washington University)正在对艰难梭菌QCD_32g58的基因组进行测序(参见万 维网网址 cmr. jcvi. org/cgi-bin/CMR/GenomePage. cgi ？ org = ntcd03)。对艰难梭菌菌株630的所有GenBank 序列进行了全面搜索，确定了假定蛋白 ⑶1021(ΥΡ_001087502)，其显示具有与枯草芽孢杆菌的芽孢外壳组装蛋白H(cotH)同源的 保守结构域(氨基酸残基90至393)。该分析用可得自NCBI和万维网网址ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/cdd. shtml的保守结构域搜索工具进行。艰难梭菌630的假定蛋白 CD1021 (GenBank 登录号 YP_001087502)具有氨基酸序列 SEQ ID NO :1。参见 Sebaihia 等 人，2006，Nat. Genet ；38 (7) :779_786 和万维网网址 ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer. fcgi ？ db = protein&id = 126698605。本发明的一些实施例包括与艰难梭菌的假定蛋白CD1021及其片段结合的抗体。 本发明的抗体与多种艰难梭菌菌株(包括(但不限于)本文所论述的任何艰难梭菌菌株) 中的假定蛋白CD1021结合。例如，本发明的抗体与如下菌株的假定蛋白CD1021结合艰难 梭菌菌株630、艰难梭菌菌株R20291、艰难梭菌菌株QCD_32q58、艰难梭菌菌株QCD_66c26、 艰难梭菌ATCC 43255、艰难梭菌ATCC 43593、艰难梭菌ATCC 43594、艰难梭菌ATCC 43596、 艰难梭菌ATCC 43597、艰难梭菌ATCC 43598、艰难梭菌ATCC 43603、艰难梭菌ATCC 9689和 /或艰难梭菌ATCC 700792。本发明的抗体包括与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 1 的假定蛋白⑶1021结合的抗体。本发明的一些实施例包括与艰难梭菌的假定蛋白CD1021的多肽片段结合的抗 体。多肽片段可(例如)为约50、约100、约200、约300、约400、约500或约600个氨基酸 长。多肽片段可(例如)为约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40或约45个氨基酸 长。多肽片段可为约8-20、约12-15或约10-20个氨基酸长。本发明的一些实施例包括与艰难梭菌菌株630的假定蛋白⑶1021 (SEQ ID NO 1) 的多肽片段结合的抗体。例如，本发明包括与包括艰难梭菌菌株630的假定蛋白CD1021
13的残基505-604 (SEQ ID NO :2)的多肽结合的抗体、与包括艰难梭菌菌株630的假定蛋白 ⑶1021的残基30-120 (SEQID NO 9)的多肽结合的抗体、与包括艰难梭菌菌株630的假定 蛋白CD1021的残基194-293 (SEQ ID NO 10)的多肽结合的抗体、与包括艰难梭菌菌株630 的假定蛋白⑶1021的残基203至217 (SEQ ID NO 3)的多肽结合的抗体、与包括艰难梭菌 菌株630的假定蛋白CD1021的残基333至347 (SEQID NO 4)的多肽结合的抗体。芽孢皮质(厚的肽聚糖层)负责维持芽孢的高度脱水状态并且有助于芽孢的极端 休眠和耐热性。细菌芽孢萌发包括一系列的降解事件，这些事件导致芽孢休眠的不可逆丧 失和核心的再水化。芽孢含有涉及萌发的酶。因而，可将与涉及萌发的芽孢特异性蛋白质 结合的抗体用于鉴别萌发芽孢。本发明包括与涉及萌发的芽孢特异性蛋白质结合的抗体。 这种抗体与萌发的芽孢结合但不与未萌发的芽孢结合。这种抗体与未萌发的芽孢结合但不 与萌发的芽孢结合。皮质裂解酶(包括酰胺酶N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)在萌发中起关键 作用，导致皮质的水解(参见例如Moriyama等人，1996，JBacteriol ；181 =2373-2378) 本 发明包括与艰难梭菌酰胺酶结合的抗体，包括与艰难梭菌N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺 酶结合的抗体。对艰难梭菌菌株630的所有GenBank 序列进行了全面的搜索，确定了细胞表 面蛋白(推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，YP_001087517，在本文中也称为 “⑶1036”)，其具有保守的结构域CW_binding_2(推定的细胞壁结合重复序列2 ；174至 265、275至368、381至461)和Amidase_3 (N-乙酰基胞壁酰_L_丙氨酸酰胺酶，493至 673)。艰难梭菌630的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶细胞表面蛋白(GenBank 登录号YP_001087517)具有氨基酸序列SEQ ID NO :5。参见Sebaihia等人，2006，Nat. Genet ；38 (7) :779_786 和万维网网址 ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer. fcgi ？ db = protein&icL本发明包括与艰难梭菌的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶及其片段结 合的抗体。本发明的抗体与多种艰难梭菌菌株(包括(但不限于)任何本文所论述的艰难 梭菌菌株)中的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶结合。例如，本发明的抗体与如 下菌株的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶结合艰难梭菌菌株630、艰难梭菌菌株 R20291、艰难梭菌菌株QCD_32q58、艰难梭菌ATCC 43255、艰难梭菌ATCC 43593、艰难梭菌 ATCC 43594、艰难梭菌ATCC 43596、艰难梭菌ATCC 43597、艰难梭菌ATCC 43598、艰难梭菌 ATCC 9689和/或艰难梭菌ATCC 700792。本发明的抗体包括与艰难梭菌菌株630的具有 SEQ ID NO 5的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶结合的抗体。本发明的一些实施例包括与推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的多肽片 段结合的抗体。多肽片段可(例如)为约50、约100、约200、约300、约400、约500或约600 个氨基酸长。多肽片段可(例如)为约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40或约45个 氨基酸长。多肽片段可为约8-20、约12-15或约10-20个氨基酸长。本发明包括与艰难梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的多肽片段结 合的抗体。例如，本发明包括与包括艰难梭菌菌株630的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸 酰胺酶的残基294-393 (SEQ ID NO 6)的多肽结合的抗体、与包括艰难梭菌菌株630的推定 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的残基582-596 (SEQ ID NO :7)的多肽结合的抗体、与包括艰难梭菌菌株630的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的残基64-78 (SEQ IDNO 8)的多肽结合的抗体。本发明的抗体包括(但不限于)多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克 隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗独特型抗体、多特异性抗体、单链抗体、单链 Fvs (scFv)、二硫键连接的 Fvs (sdFv)、Fab 片段、F (ab，)片段、F(ab，)2 片段、Fv 片段、双 体、由Fab表达文库产生的线性抗体片段、包括VL或VH结构域的片段、细胞内制备的抗体 (即细胞内抗体)以及它们的抗原结合抗体片段。多种靶标抗原中的任一种均可用于产生 本发明的抗体，包括(但不限于)艰难梭菌细胞、芽孢或毒素、蛋白质、肽、碳水化合物以及 它们的组合。蛋白质和肽可以(例如)是天然存在的、通过化学合成或通过重组产生。可 将抗原缀合至载体。另外包括在本发明中的是多种抗体片段，也称作抗原结合片段，其仅包括完整抗 体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点，从而保留了结合抗原的能力。可通过对完 整的或完全的抗体或抗体链进行化学或酶处理而获得片段。还可通过重组手段获得片段。 抗体片段的例子包括(例如)通过蛋白水解消化和/或还原二硫键而产生的Fab、Fab’、Fd、 Fd’、Fv、dAB和F(ab’)2片段以及从Fab表达文库产生的片段。可通过本领域所熟知的技 术来产生这些抗体片段。本发明的抗体可包括单独的可变区或可变区与铰链区、CHl结构 域、CH2结构域、CH3结构域和/或Fc结构域的全部或一部分的组合。术语“抗原结合片段” 指免疫球蛋白或抗体的结合抗原或与完整抗体竞争结合抗原的多肽片段。本发明的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、任何类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。在一些实施例中，免疫 球蛋白是IgG。免疫球蛋白可具有重链和轻链两者。一组IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY重 链与k或λ形式的轻链配对。本发明的抗体可来自任何动物起源，包括鸟类和哺乳动物。在一些实施例中，抗体 是人、鼠、大鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、大羊驼、骆驼或鸡抗体。如本文所用，“人” 抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体以及包括分离自人免疫球蛋白文库或分 离自具有一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体。术语“多克隆抗体”指从不止一种浆细胞克隆 产生的抗体。相比之下，“单克隆抗体”指从单种浆细胞克隆产生的抗体。多克隆抗体的制 备是为人所熟知的。针对靶标抗原的多克隆抗体可通过用免疫原对多种宿主动物进行免疫而获得。可 使用多种免疫方案中的任一种。宿主动物可以是任何哺乳动物，例如，小鼠、仓鼠、大鼠、兔、 豚鼠、山羊、绵羊、马、奶牛、水牛、野牛、骆驼或美洲驼。宿主动物可以是禽，例如鸡或火鸡。 在一些实施例中，抗体制备物不是从血样获得，而是从另外的流体源获得，例如从牛奶、初 乳、蛋白或蛋黄获得。在一些实施例中，抗体制备物不是通过用靶标抗原免疫宿主动物获 得，而是从先前暴露于抗原的个体获得或从汇集的血清获得，例如从汇集的人血清获得。将免疫剂与已知在进行免疫的哺乳动物中具有免疫源性的蛋白质缀合可能是有 用的。这种免疫源性蛋白质的例子包括(但不限于)钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛 甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM 佐剂(单磷酰脂质Α，合成的海藻糖白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。免疫方案可由本领域技术人员选择而无需过多的实验。本发明的一些实施例包括与艰难梭菌芽孢结合的抗血清。如本文所用，抗血清指 来自经免疫的宿主动物的血液，其中凝血蛋白和红血细胞(RBC)已被移除。抗血清(在本文 中也称为“抗血清制备物”、“粗抗血清”或“原始抗血清”)仍具有所有类型的免疫球蛋白以 及其他多种血清蛋白。因而，除了可识别靶标抗原的抗体，抗血清还含有针对多种非靶标抗 原的抗体，这些针对多种非靶标抗原的抗体有时候可在免疫测定法中发生非特异性反应。在本发明的一些实施例中，可使抗体富集。这种富集可将非免疫球蛋白从制备物 中除去和/或在该样品中富集一种或多种类型的免疫球蛋白(例如IgG)。可将多种方法 中的任一种用于获得这种富集的抗体，包括(但不限于)本文描述的那些。将非免疫球蛋 白血清蛋白质从抗体制备物中除去的方法以及富集IgG级分的方法是本领域所熟知的。例 如，硫酸铵沉淀、蛋白A结合、蛋白G结合或辛酸沉淀可用于富集IgG型抗体。本发明的抗体包括具有增强的靶标抗原亲合力的抗体。这种抗体可通过抗原亲 和免疫吸附制备。抗原亲和免疫吸附可通过多种手段中的任一种来进行。例如，抗原亲和 免疫吸附可通过抗原亲和柱色谱来进行。柱色谱可通过任何机械手段来进行，例如通过在 采用压力或不采用压力的柱操作中进行、在柱操作中从顶部到底部或从底部到顶部进行， 或者可在色谱处理过程中反转流体在柱中的流动方向。或者，抗原亲和免疫吸附可通过除 柱色谱之外的手段进行。例如，亲和免疫吸附可利用分批法进行，其中将固相支持物与用于 上样的液体分离、洗涤、通过任何合适的手段(包括重力、离心或过滤)洗脱。亲和免疫吸 附还可通过使样品与过滤材料接触来进行，该过滤材料吸附或保留样品中的某些分子的能 力比吸附或保留其他分子的能力更强。抗原亲和柱可通过多种方法中的任一种制备，包括 (但不限于)本文所描述的那些。抗体制备物与抗原亲和柱的结合可通过多种免疫吸附方 法(包括(但不限于)本文所描述的那些)中的任一种来进行。抗体制备物与抗原亲和柱 的结合可在多种缓冲液或盐(包括(但不限于)钠盐、钾盐、铵盐、盐酸盐、醋酸盐、磷酸盐、 柠檬酸盐、Tris缓冲液和/或缓冲容量接近中性的有机缓冲液)中进行。这种缓冲液和盐 的具体例子包括(例如)Tris、磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、氯化钠、氯化钾、氯化铵、柠檬酸钠、 柠檬酸钾、柠檬酸铵、醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵。本发明的抗体包括单克隆抗体。单克隆抗体的群组是均质的。制备物中的所有单 克隆抗体可识别靶标分子上的相同表位并且所有单克隆抗体具有相同的亲和力。如本文所 用，“亲和力，，是单克隆抗体与其抗原表位相互作用的结合强度。如本文所用，“表位”是抗 原为抗体所结合的部分。亲和力越高，则抗原和抗体之间的缔合就越紧密，并且抗原就更可 能保持在结合位点。本发明的单克隆抗体包括(但不限于)人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、单链 Fvs (scFv)、二硫键连接的 Fvs (sdFv)、Fab 片段、F (ab，)片段、F(ab，)2 片段、Fv 片段、双 体、通过Fab表达文库产生的线性抗体片段、包括VL或VH结构域的片段、细胞内制备的抗 体(即细胞内抗体)以及它们的抗原结合抗体片段。本发明的单克隆抗体可通过动物(包括(但不限于)人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山 羊、马、小鸡或火鸡)产生、通过化学合成或通过重组表达。本发明的单克隆抗体可通过本 领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任一种方法(例如，通过色谱法(如，离子交换色 谱、亲和色谱以及分级柱色谱)、离心法、差别溶解法)或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术进行纯化。此外，本发明的抗体或其片段可融合至本文所述或本领域已知的异源 多肽序列，以有利于纯化。本发明的单克隆抗体可以是任何同种型。本发明的单克隆抗体可以是(例如)鼠 IgM、IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD或IgE0本发明的单克隆抗体可以是(例如)人 IgM, IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE0在一些实施例中，单克隆抗体可为鼠 IgG2a、IgGl或IgG3。根据本发明，可将给定的重链与k或λ形式的轻链配对。单克隆抗体可通过本领域技术人员所熟悉的多种技术获得。例如，使来自用所 需抗原免疫过的动物的脾细胞永生化，通常通过与骨髓瘤细胞融合来永生化(参见(例 如)Kohler 禾口 Milstein，1976，Eur J Immunol ；6 511-519 J.Goding 的"Monoclonal Antibodies Principles andPractice, "Academic Press,第 59-103 页(1986)；禾口 Harlow 等)κ, Antibodies :A Laboratory Manual,H 726 M (Cold Spring Harbor Pub. (1988))。 可通过本领域所熟知的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。还可使用其他已知 的制备产生单克隆抗体的转化的B细胞系的方法。本发明的单克隆抗体可通过重组DNA技 术产生，例如通过噬菌体展示或通过组合方法产生。参见(例如)美国专利No. 5，223，409 ； W092/18619 ；WO 91/17271 ；WO 92/20791 ；WO 92/15679 ；WO 93/01288 ；W092/01047 ；WO 92/09690;或WO 90/02809。这些方法可用于产生人单克隆抗体。本发明的抗体包括嵌合抗体。嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物物种的抗 体。例如，嵌合抗体可通过将来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具 有合适生物特异性的人抗体分子的基因接合在一起而获得。参见例如Takeda等人，1985， Nature ；314 544-546。在治疗上有用的抗体可源自“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体可通过这 样制备将一个或多个来自小鼠(或其他物种)重链和轻链可变区的CDR转移进人可变结 构域中，然后用人的残基取代骨架区中的鼠的对应残基。源自人源化单克隆抗体的抗体组 分的使用避免了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。用于制备人源化单克隆抗体的技 术可在 Jones 等人，1986，Nature ；321 522 和 Singer 等人，1993，J Immunol 150 2844 中 找到。本发明的人源化单克隆抗体的恒定区可以为来自属于任何同种型的人免疫球蛋白的 恒定区。其可以(例如)是人IgG的恒定区。源自人免疫球蛋白的恒定区的骨架区没有具 体限制。完整抗体分子具有两个重(H)链可变区(在本文中简写为VH)和两个轻(L)链 可变区(在本文中简写为VL)。VH区和VL区可进一步细分为超变区，称为“互补决定 区”(“CDR”)，散布有较保守的区域，称为“骨架区”(FR)。已经精确限定了骨架区和CDR的范 围(参见 Kabat, Ε· A.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版，U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication No. 91-3242 和 Chothia，C.等人，J. Mol. Biol. 1987 ； 196 :901_917)。VH 禾口 VL 各由三个 CDR 禾口四个 FR 构成，以如下顺序从氨基末端到羧基末端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本发 明包括具有本发明单克隆抗体的重链、轻链、重链可变区、轻链可变区和/或一个或多个互 补决定区的抗体。本发明包括双特异性或双功能抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的 重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法制备，包括融合杂交瘤或连接F(ab’)片段。参见(例如)Songsivilai和Lachmann，1990， Clin Exp Immunol ;79 :315-321 和 Kostelny 等人，1992，J Immunol ;148 :1547_1553。此 外，双特异性抗体可形成为“双体” (Holliger等人，1993，PNAS USA 90 =6444-6448)或 "Janusin" (Traunecker 等人，1991，EMBO J ；10 :3655_3659 和 Traunecker 等人，1992，Int J Cancer Suppl ；7 :51_52)。还包括在本发明中的是产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系、转化的B细胞 系和宿主细胞；这些杂交瘤、转化的B细胞系和宿主细胞的子代和衍生物；以及等价的或类 似的杂交瘤、转化的B细胞系和宿主细胞。它们的子代或衍生物产生具有亲本品系所产生 的抗体的一种或多种识别特征(例如同种型和抗原特异性)的抗体。本发明还提供了分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子具有编码本发明的单克隆 抗体的核苷酸序列。本发明还涉及分离的多核苷酸分子，该核苷酸分子具有的核苷酸序列 与编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至 少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性。本发明还涵盖了在高严 格条件下与编码本发明抗体的核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸。如本文所用，“严 格条件”指在如下条件下第一多核苷酸分子与结合过滤材料的第二多核苷酸分子杂交并保 持与之结合的能力在65°C下于0. 5M NaHP04、7%十二烷基硫酸钠(SDS)和ImM EDTA中 反应，然后在42°C下，在0. 2XSSC/0. 1% SDS中洗涤(参见Ausubel等人(编辑)，Current Protocolsin Molecular Biology,第1 卷，Green Publishing Associates,Inc. ,and John Wiley & Sons，Inc.，NY，第2. 10. 3页(1989))。还包括在本发明中的是编码本发明单克隆 抗体的一个或多个CDR区或重链和/或轻链的多核苷酸。用于对免疫球蛋白可变结构域和 恒定区进行克隆和测序的通用技术是为人所熟知的。参见例如Orlandi等人，1989，PNAS USA ；86 :3833ο本发明还包括重组载体，所述重组载体包括分离的本发明的多核苷酸。该载体可 以是(例如)质粒、病毒颗粒或噬菌体形式。可通过多种方法将合适的DNA序列插入载体 中。通常，通过本领域已知的方法将DNA序列插入至载体中的合适限制性内切核酸酶位点。 这种方法被认为是处于本领域技术人员的能力范围内。大量的合适载体和启动子是本领域 技术人员已知的，并且可商购获得。如下载体是以举例的方式给出的。细菌载体包括(例 如)pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、 pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540 和 pRIT5。真核载体包括 (例如)pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL。然而，可以使用任 何其他质粒或载体。本发明的一些实施例还包括含有上述载体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核 细胞(例如哺乳动物或昆虫的细胞)或低等真核细胞(例如酵母细胞)。或者，宿主细胞 可以是原核细胞(例如细菌细胞)或植物细胞。将载体构建体引入宿主细胞可通过任何合 适的技术来实现，例如磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导的转染或电穿孔。(Davis，L.，等人， BasicMethods in Molecular Biology (1986))。本发明的单克隆抗体可在合适启动子的控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其 他细胞中表达。还可以采用无细胞翻译系统使用源自本发明的DNA构建体的RNA来产 生这类蛋白质。适用于原核和真核宿主的克隆和表达载体由Sambrook等人，MolecularCloning :A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor, NY(1989)进行了描述。还包括在本发明中的是表达来自本发明单克隆抗体的一个或多个超变区的噬菌 体展示文库和从这种噬菌体展示文库获得的克隆。可将噬菌体展示文库用于产生抗体衍生 的分子。将编码抗体的抗原结合可变结构域的基因片段融合至编码噬菌体的外壳蛋白的基 因。将含有这种基因融合物的噬菌体用于感染细菌，所得的噬菌体颗粒具有可表达抗体融 合蛋白的外壳，其中抗原结合结构域展示在噬菌体的外表面上。噬菌体展示文库可(例如) 用得自New England Biolabs Inc. (Ipswich, MA)的Ph. D. TM-7噬菌体展示肽文库试剂盒 (产品编号E8100S)或Ph.D. TM-12噬菌体展示肽文库试剂盒(产品编号E8110S)制备。还 可参见 Smith 和 Petrenko, 1997，Chem Rev ；97 :391_410。可通过本领域所熟知的技术将本发明的抗体直接或间接偶联至基材或可检测标 记上。可检测标记是可(例如)通过光谱(例如紫外光谱、红外光谱、可见光谱、拉曼光谱、 表面增强拉曼散射(SERS)、质谱)、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的试剂。可 用的可检测标记包括(但不限于)荧光染料、化学发光化合物、放射性同位素、电子高密度 试剂、酶、有色粒子、生物素或地高辛。可检测标记通常产生可测量的信号，例如放射性、荧 光、颜色或酶活性。与可检测试剂缀合的抗体可用于诊断或治疗目的。可检测试剂的例子包 括多种酶、天然存在的芽孢相关的生物分子(例如吡啶二羧酸、吡啶二羧酸钙)、辅基、荧光 材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用多种正电子发射断层扫描术的正电子发 射材料、非放射性顺磁性金属离子、拉曼标签和SERS标签。可使用本领域已知的技术，将所 述可检测物质直接偶联或缀合至抗体，或将其通过介质(例如本领域已知的连接基)间接 偶联或缀合至抗体。参见(例如)美国专利No. 4，741，900，其描述了金属离子与抗体的缀 合以用于诊断目的。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β “半乳糖苷酶和 乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白 /生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪 基氨基荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子 包括虫荧光素和水母发光蛋白；以及合适的放射性材料的例子包括碘(1211、1231、1251、1311)、 碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(mln、112ln、113mln、115mln)、锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga, 67Ga)、钯(103Pd)、销(99Mo)、氣(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177LU、159Gd、149Pm、14°La、175Yb、166H0、9。Y、 47Sc,186Re,188Re,142Pr^105Rh和97Ru。用于将这些部分缀合至抗体的技术是为人所熟知的。本发明的抗体包括通过将任何类型的分子共价连接至抗体而进行修饰或缀合的 抗体衍生物。这种抗体衍生物包括(例如)已通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰 胺化、用已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解或连接至细胞配体或其他蛋白质而 进行修饰的抗体。多种化学修饰中的任一种均可通过已知的技术进行，包括(但不限于) 特异性化学裂解、乙酰化、甲基化和衣霉素的代谢合成。另外，衍生物可含有一种或多种非 典型氨基酸。可通过本文所述的方法或通过本领域已知的任何合适方法测定本发明抗体的免 疫特异性结合。可使用的免疫测定法包括(但不限于)竞争性和非竞争性测定系统，这些 系统使用诸如BIAcore分析、荧光激活细胞分选器(FACS)分析、免疫荧光、免疫细胞化学、 蛋白质印记、放射_免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“夹心”免疫测定法、免疫 沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法之类的技术。这些测定法是 常规的并且是并领域所熟知的(参见例如Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology,第 1 卷，John Wiley & Sons, Inc.，NY(1994))。还包括在本发明中的是包含一种或多种本文所述抗体的组合物。组合物还可包含 (例如)缓冲剂以将PH保持在可接受的范围内以及包含防腐剂以延迟微生物生长。组合物 可包括(例如)载体、赋形剂、稳定剂、螯合剂、盐或抗微生物剂。可接受的载体、赋形剂、稳 定剂、螯合剂、盐、防腐剂、缓冲剂或抗微生物剂包括(但不限于)缓冲剂，例如磷酸盐、柠 檬酸盐和其他有机酸之类；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如叠氮化钠、 十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对 羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇； 3_戊醇；和间甲酚；多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或非特异性免疫球蛋白；亲水性聚 合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖 氨酸；单糖、二糖，以及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA ；糖 类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋 白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。如 本文所用，组合物不是多克隆抗血清。本发明还提供包含一种或多种本发明抗体的试剂盒或检测系统。试剂盒可包括装 满一种或多种本发明抗体的容器。另外，试剂盒可包含诸如缓冲液之类的其他试剂，并且还 包含实践本发明所需的溶液。任选的，这种容器可附带告示或印刷说明书。试剂盒可包括 包装材料。如本文所用，短语“包装材料”指用于覆盖试剂盒内容物的一种或多种物理结构。 包装材料通过熟知的方法构造，其可提供无菌、无污染的环境。本发明包括分离的抗体。在用于描述本文所公开的多种抗体时，“分离的”意指已 经被鉴定并且从其天然环境的组分分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是通常 会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白 质性溶质。本发明的抗体与特定多肽或特定多肽上的表位“特异性结合”或是其“特异性的”。 这种抗体是与特定多肽或特定多肽上的表位结合而不会与任何其他多肽或多肽表位显著 结合的抗体。本发明的抗体可通过动物产生、通过化学合成或通过重组表达。本发明的抗体可 通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任一种方法，例如，通过色谱法(包括(但不 限于)离子交换色谱、亲和色谱以及分级柱色谱)、离心法、差别溶解法或通过任何其他用 于纯化蛋白质的标准技术进行纯化。此外，可使本发明的抗体或其片段融合至本文所述或 本领域已知的异源多肽序列，以有利于纯化或检测。本发明的抗体可用于多种诊断和治疗方法，包括(但不限于)用于检测艰难梭菌 芽孢以及其多肽片段的方法和用于分离或纯化艰难梭菌芽孢或其多肽片段的方法。本发明的抗体可用于多种本领域已知的免疫测定技术中的任一种来确定样品中 艰难梭菌芽孢的存在与否。如本文所用，免疫测定法是利用抗体与其抗原靶标反应来鉴别 样品中的被分析物(例如艰难梭菌芽孢)的存在的测试法。该测定法利用抗体与其抗原的 特异性结合。还包括在本发明中的是这种检测方法。
在免疫测定法中，使样品与一种或多种抗体接触，并让该抗体与它们的样品中可 能存在的靶标结合。然后，通过检测结合至其抗原靶标的抗体来确定所述一种或多种抗体 与它们的抗原靶标的结合。这种检测可(例如)通过比色测定法、荧光测定法、酶促方法或 使用放射性同位素来完成。取决于测定法的形式，可将可检测标签结合至抗原或抗体。该 可检测部分应该能够(直接或间接)产生可检测信号。例如，可检测部分可以是放射性同 位素(例如3h、14C、32P、35S或1251)、荧光或化学发光化合物(例如异硫氰酸荧光素、若丹明或 虫荧光素)或酶(例如碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)、拉曼标签或SERS 标签。可采用本领域已知的用于将抗体或抗原缀合至可检测部分的任何方法。可将可检测 部分(在本文中也称为可检测标签)直接或间接缀合至抗体以生成“标记”抗体。标签可 以是自身可检测的(如放射性标签或荧光标签)，或在酶标签的情形中，标签可催化底物化 合物或组合物的化学改变，这种化学改变是可检测的。本发明的免疫测定法包括(但不限于)竞争性和非竞争性测定系统，这些系统使 用诸如BIAcore分析、荧光激活细胞分选器(FACS)分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质 印记、放射_免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定 法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免 疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法之类的技术。这些测定法是常规的并 且是并领域所熟知的(参见例如Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，第 1 卷，John Wiley &Sons, Inc.，NY(1994))。本发明的免疫测定法可以是均相或非均相的。非均相免疫测定法需要一将未结合 的抗体或抗原从样品中除去的步骤，通常利用固相试剂。因为均相测定法不需要该步骤，它 们通常能更快更容易地进行。分离方法包括(例如)沉淀(如，使用二抗)并在包被的管、 包被的珠、包被的孔、磁性粒子或玻璃粒子上移除。本发明的免疫测定法可以是(例如)竞争性结合测定法。在竞争性结合测定法中， 样品中的抗原与标记抗原竞争与抗体结合。然后测量与抗体位点结合的标记抗原的量。在 该方法中，响应将与未知的抗原浓度成反比例。这是因为响应越大，样品中越少抗原可用于 与标记抗原竞争。竞争性免疫测定法的例子是放射性免疫测定法(RIA)。本发明的免疫测定法可以是(例如)酶联免疫吸附测定法(ELISA)。在ELISA中， 未知量的抗原被固定至表面，然后在表面上用特异性抗体冲刷从而其可结合至该抗原。将 该抗体与酶连接，并且在最后的步骤中添加物质，可将酶转化为某些可检测的信号并且可 测量样品中抗原的量。进行ELISA涉及至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。使具有未 知量抗原的样品非特异性地(通过吸附至表面)或特异性地(在“夹心”ELISA中，通过由 对相同抗原具有特异性的另一抗体进行捕获)固定至固相载体(例如，聚苯乙烯微量滴定 板)。在固定抗原后，加入检测抗体，与所述抗原形成复合物。可将该检测抗体共价连接至 酶，或该检测抗体可自身用通过生物缀合连接至酶的二抗检测。在各步之间，通常用温和去 垢剂溶液洗涤所述板，以除去未特异性结合的任何蛋白质或抗体。在最终的洗涤步骤后，通 过添加酶底物对所述板进行显影以产生可见信号，所述可见信号可指示样品中抗原的量。 ELISA可利用生色底物、发光底物或荧光生成底物。本发明的免疫测定法可以是夹心测定法。在夹心测定法中，被分析物“夹在”两种 结合所述靶标被分析物上的不同抗原表位的抗体之间。一种抗体用作捕获抗体，而第二抗体则用作检测抗体。可将捕获抗体包被至固相(例如管或孔)，并且可使检测抗体带可检测 标记。本发明的免疫测定法可以是(例如)免疫色谱横流测定法(在本文中也称为横流 测定法、横流测试法或免疫色谱试纸条测试法)。横流测定法使用简单的装置来快速检测 样品中靶标被分析物的存在(或不存在)。通常将这些检测法用于医学诊断，或用于家庭 检测、即时检测或用于实验室用途。横流测试通常制备成试纸条形式，横流测试是其中测试 样品(其可以悬浮于水溶液中)通过朝向吸收垫的毛细或芯吸作用流过多孔基材(例如硝 酸纤维素膜)。将样品施加于该基材后，其可遇到有色试剂(例如金或胶乳粒子)，该有色 试剂与样品混合并与样品中可能存在的被分析物结合。该混合物通过该基材，遇到已经过 预先处理而使能结合被分析物的抗体固定的线或带。如果被分析物存在于样品中，则有色 试剂可在检测线或检测带处结合。在可供选择的实施例中，可将横流测定法用于检测存在 于样品中的特异性抗体。在那些实施例中，有色试剂可以是抗原包被的粒子并且可以用抗 原预先处理检测线或检测带。参见(例如)美国专利申请No. 5，753，517、No. 6，485，982、 No. 6，509, 196、No. 7，189，522 或 No. RE39664、美国专利申请 2006/0275920 或 Jeong 等人， 2003，korean JBiol Sci ；7 :89_92)。还包括在本发明中的是检测方法，在该检测方法中将一种或多种本文所述的抗体 用于使样品中可能存在的艰难梭菌芽孢结合至基材，然后通过多种手段中的任一种检测和 /或定量芽孢的存在。芽孢的存在可通过(例如)显微镜法、培养、酶活性抗体结合(例如， 像在ELISA测定法中一样)、钙分子荧光或发光或镧系元素金属介导的发光。批啶二羧酸与 钙离子的1 1复合物在细菌芽孢中以高浓度存在，并且还未在任何其他生活形式中观察 到。镧系元素金属(铽或铕)会与样品中的任何细菌芽孢中存在的吡啶二羧酸(DPA)结合 而产生镧系金属盐螯合物(lanthanate chelate)，例如吡啶二羧酸铽或铕。这种镧系金属 盐螯合物具有截然不同的吸收和发射光谱，可用光致发光测试法检测该吸收和发射光谱。 还可将镧系元素金属介导的发光在本文所述的多种免疫测定方法中的任一种中(例如在 横流测定法中)用作检测信号。芽孢萌发后，释放Ca-DPA，可以通过多种手段检测钙。利用 分子荧光或发光来感测的钙荧光检测可提供高灵敏性。钙指示染料可分为两组第一组是 在存在钙的情况下增加其荧光的染料，而第二组是在存在钙的情况下具有的激发和/或发 射波长与在不存在钙的情况下其具有的激发和/或发射波长不同的染料。钙指示剂染料钙 绿-1、钙绿-2和Fluo-4代表了在存在钙离子(Ca2+)的情况下增加其荧光而不改变波长的 染料。Fura-2和Indo-I是可按比例计算的Ca2+指示剂，通常认为它们在大多数实验中可互 换。Fura-2 —旦结合Ca2+，即表现出其吸收峰或激发峰从338nm变为366nm。而Indo-I则在 存在钙的情况下发射峰从485nm变为405nm。钙还可以用钙激活发光蛋白(例如水母发光蛋 白和obelin)来检测。由于不需要用外部照射激发生物发光的发射，所以所产生的信号基 本上没有背景。这使得检测极限处于极其低的水平，使这些发光蛋白成为用于分析应用的 引人注目的标签。还可将钙介导的信号传导在本文所述的多种免疫测定方法中的任一种中 (例如在横流测定法中)用作检测信号。这种方法以及本文所述的其他方法也使得能定量 样品中存在的芽孢。参见(例如)美国专利No. 5，876，960 ；No. 6，498，041 ；No. 6，815，178 ； 和 No. 7，306，942、美国专利系列号 2003/0138876 ；2004/0014154 ；和 2005/0136508 ；以及 Ponce, 2003, NASA Tech Brief ；27 (3)第 i_ii，l_3 页。
对于本发明的检测方法，可以使用一种或多种抗体，包括一种或多种本文所述 的与艰难梭菌芽孢结合的抗体。此外，可以使用一种或多种具有已知特异性的额外抗 体，例如可以使用一种或多种与艰难梭菌营养细胞结合的、与不同的细菌物种(例如 C. Clostridium或枯草芽孢杆菌)的营养细胞结合的或与不同细菌物种的芽孢(例如 C. Clostridium或枯草芽孢杆菌的芽孢)结合的抗体。样品可从各种各样的来源获得，包括(但不限于)环境或食物样品以及医学或兽 医学样品。环境样品的例子包括(但不限于)水样品、土壤样品、植物样品和空气样品。食 物的例子包括(但不限于)肉类、家禽、蛋、鱼、海鲜、蔬菜、水果、预加工食品(如汤、调味 汁、糊)、谷物产品(如面粉、谷类食物、面包)、罐装食物、奶、其他乳制品(如奶酪、酸奶、酸 奶油)、脂肪、油类、甜点、调味品、香料、干面食、饮料、水、动物饲料。医学或兽医学样品包 括(但不限于)临床样品、细胞溶解物、全血或其部分(如血清)、其他体液或分泌物(如 唾液、痰、汗液、皮脂、尿液、脑脊液)、粪便、细胞、组织、器官、活组织检查以及不同类型的拭 子。样品可以从传染体获得。术语“传染体”通常用于表示能够携带和/或传播传染性 有机体的无生命物体或基质。传染体起到将传染物例如艰难梭菌在人之间传播的作用。传 染体可包括(但不限于)布、拖把头、毛巾、海绵、抹布、餐具、硬币、纸币、手机、衣物(包括 鞋子)、门把手、女性用品、尿布等以及它们的部分或它们的组合。就医学方面而论，有很多 传染体的例子；在使用之间没有进行正确消毒的诸如喉镜之类的器具、脏的毛巾、餐具和诸 如地板、壁或桌子之类的表面全部可起到传播疾病的作用。所关注的表面可包括多种表面 的至少一部分，包括(但不限于)壁(包括门)、地板、天花板、排水管、制冷系统、管道(如 风道)、通风孔、马桶座圈、手柄、门把手、扶手、床栏杆(如医院中的床栏杆)、工作台面、桌 面、餐具表面(如盘、器皿等)、工作表面、设备表面、衣服等以及它们的组合。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是来自固体表面的拭子。可将样品直 接用于本发明的检测方法而无需准备或稀释。例如，也直接测定液体样品。可将样品稀释 或悬浮于溶液中，溶液可包括(但不限于)缓冲溶液或细菌培养基。可将为固体或半固体 的样品通过将固体在液体中切碎、混合或浸软而悬浮于液体中。可对样品进行进一步浓缩 或富集。本发明的免疫测定法可包括多种合适的对照样品。例如，可对不含有细菌的芽孢、 细胞或毒素的阴性对照样品或含有细菌的细胞、芽孢或毒素的阳性对照样品进行测定。本 发明的免疫测定法可能耗费短至数分钟的时间来显影，并且可能需要极少或不需要样品或 试剂准备。本发明的免疫测定法可以定性或定量的方式进行。定性结果可为样品提供简单 的阳性或阴性结果。阳性或阴性之间的截止值通过分析者确定并且可以是统计值。通常将 标准偏差的两倍或三倍值用于区分阳性和阴性结果。在定量形式中，可将结果内插进标准 曲线中，该标准曲线通常是靶标的系列稀释度。通过下列实例示出本发明。应当理解，具体的实例、材料、量及方法应根据本发明 的范围和精神进行广义地解释。SM实例1艰难梭菌芽孢的生成
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用艰难梭菌(ATCC No. 700792，美国典型培养物保藏中心，Manassas, VA)对一 管脑心浸出液肉汤(BHI)进行接种，并在厌氧条件下于35-37°C孵育二十四小时。孵育后， 将该肉体培养物的一毫升(mL)等分试样转移至最少四个装有BHI肉汤的管中，然后在厌氧 条件下于35-37°C孵育十二小时。将该肉汤培养物以10，000转/分钟(rpm)离心10分钟 (min)，将细胞沉淀物再悬浮于IOML无水乙醇中室温下持续1小时以杀死营养细胞。一小 时后，将该悬浮液以10，000RPM离心10分钟，用无菌Butterfield缓冲液洗涤细胞沉淀物 至少两次。将沉淀物再悬浮于无菌Butterfield缓冲液中，通过将系列稀释物涂布于厌氧 血琼脂上来确定每毫升的芽孢数目。将再悬浮的芽孢用于如下实例中，既在针对灭活芽孢 的多克隆抗体的产生中用作免疫原又在测定抗芽孢抗体的结合特异性的ELISA测定法中 用作抗原靶标。实例2舌·纏·白姊■秘白妒Φ将浓度为约IO6个芽孢/mL的艰难梭菌芽孢用5%福尔马林处理10分钟以灭活芽 孢。用无菌Butterfield缓冲液将该灭活的芽孢洗涤两次，然后再悬浮于无菌Butterfield 缓冲液中。使用标准方法在兔中产生针对该灭活芽孢的多克隆抗体(Antagene，Inc, Mountain View, CA) 0简而言之，将新西兰白兔(两只兔个体)每次免疫用IXlOfVmL当量 的灭活芽孢进行免疫。将免疫原用无菌盐水稀释至ImL并与ImL合适佐剂合并。将抗原和 佐剂混合而形成稳定的乳状液，皮下注射该乳状液。在第一天用完全弗氏佐剂(CFA)中的 抗原对兔进行免疫，然后在第20、40、60天进行免疫，用完全弗氏佐剂(CFA)中的抗原进行 所有的后续注射。在最后一次免疫十天后，从兔收集血液，让其在37°C下凝结收缩过夜。将该凝结 的血液冷冻24，轻轻倒出血清并通过以2500rpm离心20分钟使其澄清。通过ELISA用灭 活芽孢对免疫前血清和免疫血清进行测试。对于ELISA方法，将灭活的艰难梭菌芽孢在包 被缓冲液(0. IM碳酸氢盐缓冲液，每升无菌蒸馏水1. 59克(g) Na2CO3和2. 93g NaHCO3, pH 9. 6)中稀释至IO5个芽孢/毫升(mL)。将100微升(μ L)芽孢溶液加至ELISA板(ELISA Enhanced Surface plate,BD Falcon,Franklin Lakes,NJ)的孑L中。向对照孑UJ口人 100 μ L 包被缓冲液。用PARAFILM包裹ELISA板，在4°C下孵育15至16小时。将板倒空，用洗涤 缓冲液(具有0. 05% Tween20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤三次。用100 μ L封闭缓冲液(PBS 中的BSA或0.05% Tween-20)将板在室温下伴随摇动封闭两小时。将板倒空，用洗涤 缓冲液洗涤三次，用IOOyL封闭缓冲液中的一抗在室温下伴随摇动孵育一至两小时。将板 倒空，用洗涤缓冲液洗涤三次，用100 μ L带HRP标签的二抗(山羊抗兔抗体HRP缀合物； 1 10，000稀释液，？化1~(^，1 0(31^(^(1，IL)在室温下伴随摇动孵育一小时。将板倒空，用 洗涤缓冲液洗涤四次。将50 μ L底物溶液(1-step Ultra TMB, Pierce, Rockford，IL)加 至每孔，在室温下伴随摇动孵育15至30分钟。通过添加50 μ L终止溶液(1. 5Μ磷酸)终 ltH色，用 SpectraMax plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)在 450nm 处i卖取每 个板的吸光度。将吸光度进行比较以确定针对靶标的信号的增强倍数。免疫血清显示了对 灭活芽孢的良好响应，大约是用免疫前血清所获得的响应的13至15倍(表1)。表1.对抗灭活的艰难梭菌芽孢所产生的抗血清的表征
权利要求
一种分离的抗体，其与艰难梭菌(Clostridium difficile)芽孢结合。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述芽孢是未萌发的芽孢。
3.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述芽孢是萌发的芽孢。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体不与艰难梭菌营养细胞结I=I O
5.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体不与艰难梭菌毒素结合。
6.一种分离的抗体，其与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白CD1021或 假定蛋白⑶1021的片段结合。
7.根据权利要求6所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与假定蛋白CD1021的包含 氨基酸残基505至604的片段结合。
8.一种分离的抗体，其与氨基酸序列SEQ ID N0:2结合。
9.根据权利要求6所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与假定蛋白CD1021的包含 氨基酸残基30至120的片段结合。
10.一种分离的抗体，其与氨基酸序列SEQ ID N0:9结合。
11.根据权利要求6所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与假定蛋白CD1021的包 含氨基酸残基194至293的片段结合。
12.—种分离的抗体，其与氨基酸序列SEQ ID N0:10结合。
13.根据权利要求6所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与假定蛋白CD1021的包 含氨基酸残基203至217的片段结合。
14.根据权利要求6所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与假定蛋白CD1021的包 含氨基酸残基333至347的片段结合。
15.一种分离的抗体，其与氨基酸序列EGSSLQYKGDDPESY(SEQ ID NO 3)结合。
16.一种分离的抗体，其与氨基酸序列LKNETYKTKYHKYLE(SEQ ID NO 4)结合。
17.一种分离的抗体，其与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片 段结合。
18.根据权利要求17所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与所述推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸残基294至393的片段结合。
19.一种分离的抗体，其与氨基酸序列SEQ ID N0:6结合。
20.根据权利要求17所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与所述推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸残基582至596的片段结合。
21.根据权利要求17所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与所述推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸残基64至78的片段结合。
22.—种分离的抗体，其与氨基酸序列YKLKDKNGGTTKTVA(SEQ ID NO 7)结合。
23.一种分离的抗体，其与氨基酸序列KFKEKPDADSIKLKY(SEQ ID NO 8)结合。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体是多克隆 抗体。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体是单克隆2抗体。
26.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段抑制根 据权利要求25所述的单克隆抗体与其抗原靶标的结合。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体不与枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)芽孢或产孢梭菌(Clostridium sporogenes)芽孢结合。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的分离的抗体的抗原结合片段。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的分离的抗体或根据权利要求28所述的抗原 结合片段，其中将所述分离的抗体或抗原结合片段进行了标记。
30.一种组合物，包含一种或多种根据权利要求1至29所述的分离的抗体。
31.一种试剂盒，包含一种或多种根据权利要求1至29所述的分离的抗体。
32.—种杂交瘤细胞系或转化的B细胞系，其产生根据权利要求25或权利要求26所述 的单克隆抗体。
33.一种分离的多核苷酸序列，包含编码根据权利要求25或权利要求26所述的单克隆 抗体的重链、轻链、重链可变区、轻链可变区或一个或多个互补决定区的核酸序列。
34.一种表达载体，包含根据权利要求33所述的分离的多核苷酸序列。
35.一种宿主细胞，包含根据权利要求34所述的表达载体。
36.一种制备抗艰难梭菌抗体的方法，所述方法包括用包含艰难梭菌基因组所编码的 蛋白质的至少一部分的多肽，对宿主生物体以可有效产生响应所述多肽的抗体的量进行免疫。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述包含艰难梭菌基因组所编码的蛋白质的至 少一部分的多Jft选自 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5,SEQ ID N0:6、SEQ IDNO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10 以及它们的片段。
38.一种制备抗艰难梭菌抗体的方法，所述方法包括使编码由艰难梭菌基因组编码的蛋白质的至少一部分的核酸序列在免疫活性宿主生 物体中表达。
39.根据权利要求38所述的方法，所述编码由艰难梭菌基因组编码的蛋白质的至少一 部分的核酸序列编码选自 SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10 以及它们的片段的氨基酸序列。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的方法，还包括纯化所述抗体制备物。
41.一种组合物，包含至少两种分离的抗体或它们的抗原结合片段，其中每种分离的抗 体与艰难梭菌芽孢的独特抗原表位结合。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰 难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或与假定蛋白⑶1021的多肽片段纟口口。
43.根据权利要求41所述的组合物，其中至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰 难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或 所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。
44.根据权利要求41所述的组合物，其中第一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结 合，并且其中第二种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙 氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。
45.根据权利要求42或权利要求43所述的组合物，其中所述假定蛋白CD1021的所述 多月太片段选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10 以及 它们的片段。
46.根据权利要求43或权利要求45所述的组合物，其中所述推定的N-乙酰基胞壁 酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的所述多肽片段选自SEQ IDNO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8以 及它们的片段。
47.一种试剂盒，包含至少两种分离的抗体或它们的抗原结合片段，其中每种分离的抗 体与艰难梭菌芽孢的独特抗原表位结合。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰 难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结口 O
49.根据权利要求47所述的试剂盒，其中至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰 难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或 所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。
50.根据权利要求47所述的试剂盒，其中第一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难 梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结 合，并且其中第二种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙 氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。
51.根据权利要求48或权利要求50所述的试剂盒，其中所述假定蛋白CD1021的所述 多月太片段选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10 以及 它们的片段。
52.根据权利要求49或权利要求50所述的试剂盒，其中所述推定的N-乙酰基胞壁 酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的所述多肽片段选自SEQ IDNO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8以 及它们的片段。
53.一种检测样品中艰难梭菌芽孢的存在的方法，所述方法包括使所述样品与根据权 利要求1至29中任一项所述的分离的抗体接触。
54.一种检测样品中艰难梭菌芽孢的存在的方法，所述方法包括使所述样品与至少两 种分离的抗体或它们的抗原结合片段接触，其中每种分离的抗体与所述艰难梭菌芽孢的独 特抗原表位结合。
55.一种检测样品中艰难梭菌芽孢的存在的方法，所述方法包括使所述样品与第一种分离的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述第一种分离的抗体 与所述艰难梭菌芽孢的第一抗原表位结合；以及使所述样品与第二种分离的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述第二种分离的抗体 与所述艰难梭菌芽孢的第二抗原表位结合。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与 艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 1的假定蛋白⑶1021或与假定蛋白⑶1021的多肽片段结合。
57.根据权利要求54或55所述的方法，其中至少一种分离的抗体或其抗原结合片段与 艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。
58.根据权利要求54或55所述的方法，其中第一种分离的抗体或其抗原结合片段与艰 难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段结 合，并且其中第二种分离的抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙 氨酸酰胺酶蛋白的片段结合。
59.根据权利要求56或58所述的方法，其中所述假定蛋白CD1021的所述多肽片段选 自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQID NO :9、SEQ ID NO 10 以及它们的片 段。
60.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸 酰胺酶蛋白的所述多肽片段选自SEQ ID NO :6、SEQ IDNO :7、SEQ ID NO 8以及它们的片段。
全文摘要
本发明提供了与细菌艰难梭菌的内生孢子结合的抗体、制备这种抗体的方法以及使用这种抗体的方法，包括检测艰难梭菌内生孢子的方法。
文档编号C07H21/04GK101980723SQ200980111355
公开日2011年2月23日 申请日期2009年2月25日 优先权日2008年2月28日
发明者拉伊·拉贾戈帕尔, 魏爱平 申请人:3M创新有限公司