工程化抗体恒定结构域分子的制作方法

专利名称：工程化抗体恒定结构域分子的制作方法
工程化抗体恒定结构域分子相关申请的交叉引用本申请要求享有2008年1月31日提交的美国临时申请第61/063，245号的优先 权，通过引用将其整体并入本文。领域本发明涉及抗体，特别地涉及在特定位置突变的抗体恒定结构域和/或从特异性 结合目的抗原的异源抗体移入一个或多个可变链环的抗体恒定结构域。背景常规抗体是包含至少四条多肽链的大型多亚基蛋白复合物，所述四条多肽链包括 两条轻链和两条重链。抗体的重链和轻链含有结合抗原的可变(V)区和提供结构支撑和效 应物功能的恒定(C)区。抗原结合区包含两个分离的结构域，重链可变结构域(Vh)和轻链 可变结构域(\)。互补决定区(CDR)为抗体可变结构域中的短氨基酸序列，它提供抗原特 异性。抗体分子的重链和轻链各提供三个⑶R(⑶R1、⑶R2和⑶R3)，因此能够与抗原接触 的每个抗体具有六个CDR，产生抗原特异性。典型的抗体如IgG分子具有大约150kD的分子量。治疗应用可能受限，因为抗体 相对较大的尺寸能够限制组织渗透或表位进入。已在鉴定了蛋白酶消化后天然存在的抗体的许多较小的抗原结合片段(例如， Fab、Fab'和F(ab，)2)。这些抗体片段具有范围在大约50kD至IOOkD的分子量。已使用 重组的方法来产生替代的抗原结合片段，称为单链可变片段(scFv)，它是由通过合成的肽 接头相接合的\和Vh构成。scFv分子具有大约25-30kD的分子量。尽管在人类和大多数其他的哺乳动物中的天然存在的抗体的抗原结合单元一 般已知是由一对可变区组成，但是骆驼科(camelid)物种表达大比例的缺乏轻链序列的 全功能、高特异性抗体。骆驼科重链抗体作为通过其恒定区二聚的单一重链的同源二 聚体而存在(美国专利第5，840，526号和第6，838，254号；以及美国专利申请公开号 2003-0088074)。这些骆驼科重链抗体的可变结构域称为VhH结构域，它们在被分离为 Vh链的片段时保留了高特异性结合抗原的能力(Hamer s-Casterman等人.Nature 363 446-448，1993 ；Gahroudi 等人.FEBS Lett. 414 :521_526，1997)。结合抗原的单Vh结构域称作结构域抗体(dAb)，也已将其从由免疫小鼠的基因组 DNA扩增的小鼠Vh基因文库中鉴定出来(Ward等，Nature 341 :544_546，1989)。还已描述 了能够高亲和力结合抗原的人类单免疫球蛋白可变结构域多肽(参见例如，PCT公开号WO 2005/035572 和 WO 2003/002609)。然而，对能够特异性结合抗原的非常小的抗体的需求仍存在。此类小分子可能提 供提高的表位进入、更好的组织渗透，并且可能被用于利用抗体或其片段的任何诊断性或 治疗性的应用。概述本公开涉及工程化抗体恒定结构域分子。在一个实施方案中，抗体恒定结构域是 来自IgG、IgA或IgD的CH2结构域。在另一个实施方案中，抗体恒定结构域是来自IgE或
6IgM的CH3结构域。如本文所述，CH2或CH3结构域分子是小的、稳定的、可溶的，具有最小 毒性乃至没有毒性并且有效地结合抗原。因此，本文提供了包含免疫球蛋白CH2或CH3结 构域的多肽，其中所述CH2或CH3结构域的环的至少一个被突变，或者所述CH2或CH3结构 域的环区域的至少一部分被来自异源免疫球蛋白可变结构域的互补决定区(CDR)或其功 能片段(如含有特异性决定残基(SDR)的功能片段)取代，或者二者兼有。本文所述的CH2 和CH3结构域分子具有小于约15kD的分子量。本文还提供了包含CH2或CH3结构域分子 的组合物、文库和试剂盒以及使用方法。还提供了表现出提高的稳定性的重组恒定结构域， 其可被用作构建抗原结合的CH2或CH3结构域的支架。还提供了鉴定特异性结合抗原的重 组CH2或CH3结构域的方法和产生包含重组CH2或CH3结构域的文库的方法。上述的和其他的特征和优点将从以下关于附图进行的若干实施方案的详细描述 中变得更明显。附图简述图IA是免疫球蛋白分子的示意图。常规抗体是包含至少四条多肽链的大型多亚 基蛋白复合物，所述四条多肽链包括两条轻(L)链和两条重(H)链。抗体的重链和轻链含有 结合抗原的可变(V)区和提供结构支撑和效应物功能的恒定(C)区(如CH1、CH2和CH3结 构域)。抗原结合区包含两个分离的结构域，重链可变结构域(Vh)和轻链可变结构域(\)。图IB显示人类重链可变结构域的共有氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。指出了⑶Rl、 ⑶R2、⑶R3(表示为H1、H2和H3)的位置。还显示了三种不同的抗原特异性人类抗体的重链 的氨基酸序列(SEQID NO 2-4)。显示的数字是基于Kabat编号系统(Wu和Kabat，J. Exp. Med. 132(2) :211_250，1970)。图2显示人类Y 1 CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO 5)。指出了在β -折叠 (...)和α-螺旋(***)区域中的残基。还显示了环B-C (这里表示为环1)、环D-E (这里 表示为环2)、环F-G (这里表示为环3)、环Α-Β、环C-D和环E-F的位置。每个环中的残基以 粗体显示。图3A-3C是图解了在CH2结构域上移植⑶R(或高变环)的可能策略的示意图。图4显示了展现工程化CH2结构域的蛋白表达的凝胶图像，所述工程化CH2结构 域由箭头指出。图5A显示人类CH2(NCB登录号J00228 ;SEQ ID NO :5)与小鼠CH2 (NCB登录号 J00453 ；SEQ ID NO 92)的氨基酸序列比对。相同和相似的残基分别是67%和92%。图5B 是显示人类CH2的尺寸排阻色谱的图。插图显示标准曲线。图5C是显示CH2结构域分子 (以每泳道1-10 μ g或2-5 μ g的浓度)、单链可变片段(scFv)、抗体片段(Fab)和完整的抗 体分子(IgG)的分子量的SDS-PAGE凝胶的图像。图6A-6B是显示通过圆二色性(⑶)和差示扫描热量法(DSC)测量的人类CH2的 稳定性的图。(A)通过⑶测量，在25°C的折叠曲线(_)，在90°C的解折叠(□□□)和在 25°C的重折叠(一)。将蛋白的折叠级分(ff)计算为ff = ([Θ]-[ΘΜ])/([ΘΤ]-[ΘΜ])。 [θ τ]和[θ J其中在25°C的折叠态和90°C的解折叠态的平均残基椭圆率是216。从对温 度(T)的一阶导数[d(折叠级分)/dT]确定了来自CD的精确Tm值(54. 1 士 1. 2°C )。(B) 来自DSC的热诱导的解折叠曲线。Tm = 55. 4°C，其与来自⑶的Tm相似。图7是显示基于CH2结构的m01和m02的设计的示意图。在两个天然Cys中的两个Cas之间的距离是6.53 A。这两个Cys残基形成了天然二硫键(由黑色箭头指出)。在 被半胱氨酸取代的VlO与K104(m01)之间或L12与K104(m02)之间引入工程化二硫键。图8是显示m01和m02高水平表达的SDS-PAGE凝胶的图像。将m01和m02可溶 性表达与CH2的可溶性表达对比。表达是由箭头指出。图9A-9E是显示通过⑶(A_C)、DSC (D)和荧光分光光度法(E)测量的两种突变体 的提高的稳定性的图。显示了 mOl(A)和m02(B)的在25°C的折叠曲线(_)，在90°C的解折 叠(□ □ □)和在25°C的重折叠(一)。(C)通过与CH2相同的方法计算m01和m02的折 叠级分。mOl 的 Tm = 77. 4士 1. 7°C，m02 的 Tm = 68. 6士0. 6°C。(D)mOl 和 m02 的热诱导的解 折叠曲线也由DSC记录。与CH2相比，mOl的Tm和m02的Tm分别提高约20°C和10°C。(E) 通过荧光分光光度法对比在CH2、m01和m02之间的尿素诱导的解折叠。CH2、m01和m02的 解折叠的中点分别是4. 2Μ、6· 8Μ和5. 8Μ。图IOA显示mOl和m02的尺寸排阻色谱。如CH2，m01只形成单体，而m02主要形成 单体并且在较小程度上形成二聚体。图IOB是显示N端平截的CH2(CH2)和平截的mOl(mOl) 的高稳定性的图。前七个N端残基被缺失(SEQ ID NO :5的残基1-7)。通过⑶测量的50% 解折叠温度(Tm)(分别为62°C和79°C )显著高(分别高8°C和5°C )于相应的CH2和mOl 的解折叠温度(分别为54°C和74°C )。

图11是显示CH2文库的设计的示意图。显示了 CH2片段的图示，其中实心矩形代 表环(L1-L3)。阴影矩形代表面向从环1到环3的相反方向环(L)和螺旋(HI、H2)。以字 母A-G标记的空矩形代表形成β夹层结构的七条β链。数字231和341代表在IgGl的情 况下CH2片段的起始残基和末端残基。CH2环1(SEQ ID NO 93)和环3 (SEQID NO 95)的 序列在下面示出，并加注下划线。引入的突变显示在括号中(SEQ ID N0:94和SEQ ID NO: 96)。图12A-12B 显示 CH2 结合物(binder)的表征。(A)四个 Balgpl20_CD4 特异性 CH2 克隆如以下实施例所述地被表达并纯化。纯化的产物通过蛋白质印迹分析。样品1-4代表 来自可溶级分的克隆mlal到mla3’，而5_8从包涵体中复性。(B) CH2克隆与Bal gpl20_CD4 的结合的ELISA分析。图13A-13B是显示CH2特异性结合的决定簇的电泳凝胶的图和图像。㈧环1决 定了结合能力。两个优势克隆mlal和mla2以及含有来自mlal和mla3的环1序列而非原 始的CH2环3序列的两个杂合子从包涵体中被表达并纯化，并且被重折叠(左图)。然后将 这些蛋白用在ELISA分析中(右图)。(B) CH2为环1提供关键性结构支持。携带额外的二 硫键的优势克隆mlal及其突变体被表达、纯化以及重折叠(左图)。然后将它们用在ELISA 分析中(右图)。图14是显示由CH2结合物对HIV Env假型病毒感染进行的广泛中和的图。两个 CH2克隆mlal和mla2以100 μ g/ml的固定浓度用来测试其抗一组九种HIV假病毒的中和 能力。浓度为4 μ g/ml或6 μ g/ml的C34肽用作阳性对照。图15显示基于mlal的第二 CH2文库的设计。来自CH2克隆mlal的环2 (SEQ ID NO 97)和环3 (SEQ ID NO 99)序列(以下划线标出)被括号中所示的序列(SEQ ID NO 98 和 SEQ ID NO 100)取代。图16A-16D显示了选自于第二 CH2文库的CH2克隆的表征。(A)选自于第二文库的CH2克隆的表达和纯化。(B)mlb3的凝胶过滤分析。(C)CH2克隆的ELISA分析。(D)克 隆mlb3的环2和环3序列，其与原始CH2序列(SEQ ID NO :97_100)相比主要具有单体的形式。图17是显示由来自第二 CH2文库的克隆的假病毒中和的图。分析分离自第二文 库的三个克隆在100μ g/ml的浓度针对相同组的HIV假病毒的中和能力。20μ g/ml的浓度 的平行纯化的ScFv X5用作对照。图18是显示识别保守表位的CH2结合物的图。主要为单体的CH2克隆mlb3是生 物素标记并且将其在竞争ELISA测定中使用。将ELISA抗原Bal gpl20_⑶4包被在ELISA 板的底部。将固定量的1. 7 μ M的生物素酰化的mlb3与指示量的未标记的mlb3、scFv X5 或m36-Fc混合并添加到每个孔。用链亲和素-HRP检测结合的mlb3。序列表在附随的序列表中列出的核酸序列和氨基酸序列是使用如在37C. F. R. 1. 822中 所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三个字母密码示出。只显示每个核酸序列 的一条链，但是将互补链理解为通过任何提及的显示的链而被包括在内。在随附的序列表 中SEQIDNO1是人类Vh结构域的氨基酸序列。
SEQIDNO2-4是三种人类抗体的Vh结构域的氨基酸序列。
SEQIDNO5是人类Y 1CH2结构域的氨基酸序列。
SEQID NO 6-10是用于产生突变CH2结构域的文库的PCR引物的核苷·陵序列。
SEQIDNO11-30是具有随机的环1的突变CH2结构域的片段的氨基酸丨序列。
SEQIDNO31-50是具有随机的环3的突变CH2结构域的片段的氨基酸丨序列。
SEQIDNO51-68是用于将来自人抗体的⑶R3移入到CH2支架中的PCR引物的核苷酩〖序列。
SEQIDNO69-87是具有移植的H3的工程化CH2结构域的片段的氨基·陵序列。
SEQIDNO88和89是CH2结构域突变体m01的片段的氨基酸序列。
SEQIDNO90和91是CH2结构域突变体m02的片段的氨基酸序列。
SEQIDNO:92是鼠CH2的氨基酸序列。
SEQIDNO:93是CH2环1的氨基酸序列。
SEQIDNO94是突变体CH2环1的共有氨基酸序列。
SEQIDNO:95是CH2环3的氨基酸序列。
SEQIDNO96是突变体CH2环3的共有氨基酸序列。
SEQIDNO97是来自克隆mlal的CH2环2的氨基酸序列。
SEQIDNO98是来自克隆mlal的突变体CH2环2的共有氨基酸序列。
SEQIDNO99是来自克隆mlal的CH2环3的氨基酸序列。
SEQIDNO100是来自克隆mlal的突变体CH2环3的共有氨基酸序列。
SEQIDNO=101-105是用于扩增第一 CH2文库的PCR引物的核苷酸序列L
SEQIDNO106是mlal合成肽的氨基酸序列。
SEQIDNO107是mlal环1的氨基酸序列。
SEQIDNO:108是mla2环1的氨基酸序列。
详述I.缩写ADCC 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性⑶C 补体依赖性细胞毒性⑶R 互补决定区DNA 脱氧核糖核酸ELISA 酶联免疫吸附测定HIV 人免疫缺陷病毒Ig:免疫球蛋白NK 天然杀伤细胞RNA 核糖核酸SDR:特异性决定残基II.术语除非另外指明，否则技术术语是根据常规用法使用。在分子生物学中常见术语的 定义可见于由牛津大学出版社1994年出版的BenjaminLewin的Genes V(基因V) (ISBN 0-19-854287-9)；由 Blackwell ScienceLtd 在 1994 年出版的 Kendrew 等人(编)The Encyclopedia of MolecularBiology (分子生物学百科全书)(ISBN 0-632-02182-9)；以及 S VCHPublishers, Inc. $ 1995 $出片反的 Robert A. Meyers (IS ), MolecularBiology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference (分子生物学和生物技术综合案头参 考)(ISBN 1-56081-569-8)。为了促进本发明的各实施方案的叙述，提供以下对具体术语的解释施用通过选定的途径将组合物引入到受试者中。例如，如果选定的途径是静脉 内，那么通过将组合物引入到受试者的静脉中来施用组合物。动物有生命的多细胞脊椎动物生物体，包括例如哺乳动物和禽类的分类。术语哺 乳动物包括人和非人动物。类似地，术语“受试者”包括人和兽医受试者。抗体包括基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种 多肽的蛋白(或蛋白复合物)。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒 定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为Y、 μ、α、δ或ε，它们进而分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE0基本的免疫球蛋白(抗体)结构单元一般为四聚体。每个四聚体包含两对相同的 多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N端 定义了主要负责抗原识别的约100至110个或者以上个氨基酸的可变区。术语“可变的轻 链(\)”和“可变的重链(Vh) ”分别是指这些轻链和重链。每条轻链含有单个恒定结构域 (CL)，而每条重链含有三个恒定结构域CH1、CH2和CH3 (或者对于IgE和IgM而言四个恒定 结构域)。参见图IA的常规免疫球蛋白分子的示意图。如在此所用，术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白以及一些具有约25至IOOkD分 子量的良好表征的片段。例如，与靶蛋白(或者与蛋白或融合蛋白内的表位)结合的Fab、 Fv和单链Fv(SCFV)还将是该蛋白(或表位)的特异性结合剂。这些抗体片段被定义如 下(l)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，它是通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体得到完整的轻链和一条重链的一部分而产生；(2)Fab’，通过用胃蛋白酶处理整个抗体， 随后还原得到完整的轻链和重链的一部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两 个Fab’片段；(3) (Fab’)2，通过用胃蛋白酶处理整个抗体且没有随后的还原所获得的抗体 的片段；(4)F(ab’)2，通过两个二硫键连在一起的两个Fab’片段的二聚体；(5)Fv，含有轻 链的可变区和重链的可变区的表达为两条链的基因工程化片段；以及(6)scFv，单链抗体， 含有轻链的可变区、重链的可变区的基因工程化分子，所述轻链的可变区和重链的可变区 通过作为基因融合单链分子的适合多肽接头相连接。制备这些片段的方法是常规的(参见 例如，Harlow 禾口 Lane, Using Antibodies :A LaboratoryManual (使用抗体实验室手册), CSHL, New York,1999)。抗体可以是单克隆或多克隆的。仅通过举例，单克隆抗体可以根据Kohler和 Milstein的经典方法(Nature 256 =495-97,1975)或其衍生方法从鼠杂交瘤中制备。例如， 用于单克隆抗体生产的详细步骤由Harlow和Lane描述(Using Antibodies :A Laboratory Manual (使用抗体实验室手册)，CSHL, New York, 1999)。“人源化”免疫球蛋白例如人源化抗体是包括人框架区和来自非人类(例如小鼠、 大鼠或合成的)免疫球蛋白的一种或多种CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋 白命名为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白命名为“受体”。在一个实施方案中，所有的 CDR是来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人 源化重链免疫球蛋白的抗体，例如人源化单克隆抗体。人源化抗体结合至与提供CDR的供 体抗体相同或相似的抗原上。人源化免疫球蛋白的受体框架可具有限制数目的取自供体框 架的氨基酸取代。人源化分子可以具有额外的保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代对抗 原结合或其他免疫球蛋白功能实质上没有影响。这些分子可以通过基因工程化手段构建 (例如参见美国专利5，585，089)。抗原能够刺激动物中抗体或T细胞应答的产生的化合物、组合物或物质，包括被 注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特异性体液免疫或特异性细胞免疫的产物进行反应。自身免疫疾病其中因组织损伤而起的免疫系统产生针对为正常宿主的一部分的 抗原(也就是自身抗原)的免疫应答(例如，B细胞应答或T细胞应答)的疾病。自身抗 原可以获自宿主细胞，或者可以获自正常定殖粘膜表面的共栖生物，例如微生物(称为共 栖生物)。影响哺乳动物的示例性自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、幼年型少关节型关节 炎(juvenile oligoarthritis)、胶原诱导性关节炎、佐剂诱导性关节炎、干燥综合征、多发 性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、自身免 疫性胃萎缩、寻常天疱疮、牛皮癣、白癜风、1型糖尿病、非肥胖型糖尿病、重症肌无力、Grave 病、桥本氏甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性涎腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减 少性紫癜、肺出血_肾炎综合征(Goodpasture’ s syndrome)、Addison病、全身性硬化症、 多发性肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血以及类似疾病。结合亲和力在结合位点与配体之间(例如，抗体、CH2结构域或CH3结构域与抗 原或表位之间)的结合的力。结合位点X对配体Y的亲和力由解离常数(Kd)表示，解离常 数是占据溶液中存在的半数X的结合位点所需的Y的浓度。较低的(Kd)表明在X与Y之
11间较强或较高的亲和力相互作用，并且需要较低浓度的配体占据这些位点。一般来说，结合 亲和力可以受由互补位(识别表位的分子的部分)所识别的表位中一个或多个氨基酸的改 变、修饰和/或取代影响。结合亲和力可以是抗体结合抗原的亲和力。在一个实例中，结合亲和力是通过Ag-ELISA测定中的终点滴定所测量。如果修 饰的/置换的表位的特异性抗体的终点滴度与未改变的表位相比相差至少4倍，如至少10 倍，至少100倍或更大，那么结合亲和力大体上是通过由抗体互补位所识别的表位中的一 个或多个氨基酸的修饰和/或取代来降低(或可测量地减少)。CH2或CH3结构域分子获自免疫球蛋白CH2或CH2结构域的多肽(或编码多肽的 核酸)。免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在本文所述的一个实施方案中，CH2 或CH3结构域分子包含至少一个⑶R或其功能片段。CH2或CH3结构域分子还可以包含额 外的氨基酸序列，例如完整的高变环。在另一个实施方案中，CH2或CH3结构域分子至少具 有以⑶R或其功能片段置换的一个或多个环区域的至少一部分。在本文所述的一些实施方 案中，CH2或CH3结构域在该分子的环区域中包含一个或多个突变。CH2或CH3结构域的 “环区域”是指位于β-折叠的区域之间的蛋白部分(例如，每个CH2结构域包含七个β-折 叠A至G，方向从N端到C端)。如在图3A-3C中所示，CH2结构域包含六个环区域环1、环 2、环3、环Α-Β、环C-D和环E-F。环Α-Β、环C-D和环E-F分别位于β -折叠A与B之间、C 与D之间、以及E与F之间。环1、2和3分别位于β-折叠B与C之间、D与E之间、以及F 与G之间。对于CH2结构域中的环的氨基酸范围参见表1。本文所公开的CH2和CH3结构 域分子还可以包含N端缺失，例如约1个至约7个氨基酸的缺失。在具体的实例中，N端缺 失是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸长度。本文所公开的CH2和CH3结构域分子还可以包含C 端缺失，例如约1个至约4个氨基酸的缺失。在具体的实例中，C端缺失是1、2、3或4个氨 基酸长度。CH2和CH3结构域分子的尺寸较小，通常小于15kD。CH2和CH3结构域分子的尺 寸可以改变，这取决于在环区域中插入的CDR/高变氨基酸序列的长度、插入CDR的数量以 及另一分子(如效应物分子或标记)是否与CH2或CH3结构域结合。在一些实施方案中， CH2和CH3结构域分子不包含额外的恒定结构域(即CHl结构域或另一 CH2结构域或CH3 结构域)或可变结构域。在一个实施方案中，CH2结构域是来自IgG、IgA或IgD。在另一实 施方案中，恒定结构域是与IgG、IgA或IgD的CH2结构域同源的来自IgE或IgM的CH3结 构域。本文提供的CH2和CH3结构域分子可以是糖基化或非糖基化的。例如，可以将重 组CH2结构域或CH3结构域表达在适当的哺乳动物细胞中以允许该分子的糖基化。互补决定区(CDR)在抗原受体(如免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白的可变结构 域中发现的短氨基酸序列，其为该受体提供对抗原的接触位点及其对特定抗原的特异性。 抗原受体的每个多肽链含有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。抗原受体通常是由两个多肽链 (重链和轻链)组成，因此每个抗原受体具有六个能够与抗原接触的CDR。因为与抗原受体 相关的大多数序列变异在CDR中被发现，所以这些区域有时被称为高变结构域。⑶R在抗原受体的环区域内(通常在β-折叠结构的区域之间；参见图3A-3C)被 发现。这些环区域通常称为高变环。每个抗原受体包含六个高变环111、!12、!13、1^1、1^2和 L3。例如，Hl环包含重链的⑶Rl，并且L3环包含轻链的⑶R3。本文所述的CH2和CH3结构域分子包含来自抗体可变结构域的移入的氨基酸。移入的氨基酸包含CDR的至少一部分。 移入的氨基酸还可以包括额外的氨基酸序列，如完整的高变环。如本文所用，⑶R的“功能 片段”是保留了结合特异性抗原的能力的CDR的至少一部分。CDR 位置的编号规贝丨」由 Kabat 等人.，(1991) Sequences of Proteinsof Immunological Interest (免疫学目的蛋白的序列)，第5版，美国卫生与公共服务部，公共 卫生服务，国立卫生研究院，Bethesda, MD (NIH公开号91-3242)描述。接触以直接物理关联来放置，其包括以固体形式和以液体形式二者。简并变体如本文所述，CH2或CH3结构域分子的“简并变体”是编码CH2或CH3结 构域分子的多核苷酸，该多核苷酸包括由于遗传密码简并的序列。存在20种天然氨基酸， 它们大多数被多于一个密码子指定。因此，所有的简并核苷酸序列被包括在内，只要由该核 苷酸序列所编码的CH2或CH3结构域分子的氨基酸序列是不变的。结构域一种蛋白质结构，该结构保留了独立于蛋白质的其余部分的三级结构。在 一些情况下，结构域具有分离的功能特性并且可被添加、移除或转移至另一蛋白而没有功 能损失。效应物分子预期对分子或嵌合分子所靶向的细胞具有期望的作用的分子或嵌合 分子的部分。效应物分子也称为效应部分(EM)、治疗剂或诊断剂或类似术语。治疗剂包括这类化合物，如核酸、蛋白、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位 素、脂质、碳水化合物或重组病毒。核酸治疗部分和诊断部分包括反义核酸、与单链或双链 DNA共价交联的衍生的寡核苷酸和形成三股螺旋的寡核苷酸。可选地，与靶向部分相连的 分子如CH2或CH3结构域分子可以是含有治疗组合物的囊封系统，如脂质体或胶束，所述治 疗组合物例如药物、核酸(如反义核酸)或能够被屏蔽免于直接暴露于循环系统的另外的 治疗部分。制备连接于抗体的脂质体的方法是本领域技术人员公知的。参见例如，美国专 利第 4，957，735 号；以及 Connor 等人·，Pharm. Ther. 28 :341_365，1985。诊断剂或诊断部 分包括放射性同位素或其他可检测的标记。用于此类目的的可检测的标记也是本领域公知 的，并且包括放射性同位素(如32p、125I和131I)、荧光团、化学放光剂和酶。表位抗原决定簇。是在有抗原性的分子(即该分子引发特异性免疫应答)上的 特定化学基团，或者连续或不连续的肽序列。抗体结合特定的抗原表位是基于该抗体的三 维结构和匹配(或同源)的表位。表达核酸翻译为蛋白质。蛋白质可以被表达并留在细胞内，成为细胞表面膜的组 分，或者被分泌到细胞外基质或介质中。表达控制序列调控异源核酸序列的表达的核酸序列，所述异源核酸序列与之可 操作地连接。当表达控制序列控制并调控核酸序列的转录和(适当时)翻译时，该表达控 制序列与该核酸序列可操作地连接。因此表达控制序列可包括适当的启动子、增强子、转录 终止子、在编码蛋白的基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、允许mRNA的适 当翻译的该基因的正确可读框的维持序列以及终止密码子。术语“控制序列”旨在最少包 括其存在能够影响表达的组分，并且还包括其存在有利的额外组分，例如前导序列和融合 配偶体序列。表达控制序列可包括启动子。启动子是指导核酸转录的一系列核酸控制序列。启动子包括转录起始位点附近的 必要核酸序列，如在聚合酶II型启动子情况下的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑物元件，它们可位于距离转录起始位点多达数千碱基对处。包括组成型启动子 和诱导型启动子二者(参见例如，Bitter等人，Methods in Enzymology (酶学方法)153 516-544，1987)。还包括足以赋予启动子依赖性基因表达的那些启动子元件，所述启动子依赖性基 因表达是细胞类型特异性、组织特异性可控的，或者通过外部信号或试剂可诱导的；此类元 件可位于基因的5'或3'区域中。包括组成型启动子和诱导型启动子二者(参见例如， Bitter 等人，Methodsin Enzymology (酶学方法)153 =516-544,1987) 例如，当在细菌系 统中克隆时，可使用诱导型启动子，如细菌噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂 合启动子)以及类似启动子。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用 获自哺乳动物细胞的基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动 子(如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；痘苗病毒7. 5K启动子)。通过重 组DNA或合成技术产生的启动子也可以用来提供核酸序列的转录。可将多核苷酸插入到含有启动子序列的表达载体中，所述启动子序列促进宿主的 插入基因序列的有效转录。表达载体通常含有复制起点、启动子以及允许对转化细胞的表 型选择的特异性核酸序列。框架区在CDR(或高变区)之间插入的氨基酸序列。框架区包括可变的轻链框架 区和可变的重链框架区。每个可变结构域包含四个框架区，通常称为Rl、FR2、FR3和FR4。 框架区用来将CDR保持在适当的方向以用于抗原结合。框架区通常形成折叠结构。真菌相关抗原(FAA)能够刺激真菌特异性T细胞限定的免疫应答的真菌抗原。 示例性FAA包括但不限于来自以下的抗原白色念珠菌(Candida albicans)、隐球菌属 (Cryptococcus)(如来自新型隐球菌(C. neoformans)的d25或MP98或MP88，或者其免疫 片段)、芽生菌属(Blastomyces)(如皮炎芽生菌(B. dermatitidis)，例如WI-1或其免疫片 段)和组织胞浆菌属(Histoplasma)(如荚膜组织胞浆菌(H. capsulatum)) 0异源的异源的多肽或多核苷酸是指获自不同来源或物种的多肽或多核苷酸。高变区在抗体可变结构域内的序列变异性特别高的区域。高变区形成框架区的 β-折叠之间的环结构。因此，高变区也称为“高变环”。每个可变结构域包含三个高变区， 在重链中通常称为Η1、Η2和Η3，而在轻链中通常称为L1、L2和L3。高变环的环结构描绘在 图3A-5C中。免疫应答免疫系统的细胞如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞 (polymorphonucleocyte)对诸如抗原的刺激物的反应。免疫应答可包括参与宿主防御反应 的身体的任何细胞，例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天 免疫应答或炎症。免疫结合物效应物分子与抗体或者与CH2或CH3结构域分子的共价连接。效应 物分子可以是可检测的标记或免疫毒素。毒素的具体、非限制性实例包括但不限于相思豆 毒蛋白，蓖麻毒蛋白，假单胞菌外毒素(PE，如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)，肉 毒杆菌毒素或其改性的毒素，或者直接或间接地抑制细胞生长或杀死细胞的其他毒剂。例 如，PE和DT是通常通过肝毒性导致死亡的高毒性化合物。然而，可通过如下方式将PE和 DT改性成为用作免疫毒素的形式移除毒素的天然靶向组分(如PE的结构域Ia和DT的 B链)并且用不同的靶向部分(如CH2或CH3结构域分子)取代该天然靶向组分。在一个实施方案中，将CH2或CH3结构域分子与效应物分子(EM)相接合。在另一个实施方案中， 与效应物分子相接合的CH2或CH3结构域分子还与脂质或蛋白或肽的其他分子相连接以提 高CH2或CH3结构域分子在体内的半衰期。该连接可以通过化学手段或重组手段。“化学 手段”是指在CH2或CH3结构域分子与效应物分子之间的反应，以使得在这两个分子之间形 成共价键从而形成一个分子。在CH2或CH3结构域分子与效应物分子之间可以任选地包括 肽接头(短肽序列)。因为免疫结合物最初是由具有不同官能性的两个分子，如抗体和效应 物分子制备，所以它们有时被称为“嵌合分子”。本文所用的术语“嵌合分子”因此是指结合 (偶联)至效应物分子的靶向部分，如配体、抗体或者CH2或CH3结构域分子。术语“结合”、“接合”、“键合”或“连接”是指使两个多肽成为一个连续多肽分子， 或者是指将放射性核苷酸或其他分子与多肽，如CH2或CH3结构域分子共价连接。在具体 的上下文中，所述术语包括指配体，如抗体部分与效应物分子(“EM”)相接合。免疫原能够在适当条件下刺激动物的免疫应答，如抗体或T细胞免疫应答的产 生的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物中的组合物。分离的“分离的”生物组分(如核酸分子或蛋白)已从该组分天然存在的其他生 物组分(例如，细胞的其他生物组分)中基本上分离或纯化出来，所述其他生物组分例如其 他的染色体的和染色体外的DNA和RNA以及蛋白，包括其他抗体。已被“分离的”核酸和蛋 白包括通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白。“分离的抗体”是其已从其他蛋白或生物组 分基本上分离或纯化出来以使得保持其抗原特异性的抗体。该术语还包括通过宿主细胞中 的重组表达制备的核酸和蛋白(包括CH2和CH3结构域分子)以及化学合成的核酸或蛋白 或者其片段。标记直接或间接地与另外的分子如抗体或者CH2或CH3结构域分子结合以促进 该分子的检测的可检测的化合物或组合物。标记的具体、非限制性实例包括荧光标签、酶连 接和放射性同位素。配体接触残基或特异性决定残基(SDR)在CDR内的参与接触配体或抗原的残基。 配体接触残基也被称为特异性决定残基(SDR)。非配体接触残基是CDR中不接触配体的残 基。非配体接触残基也可以是框架残基。纳米抗体(nAb)被工程化以使得分子特异性结合抗原的CH2或CH3结构域分子。 被工程化以结合抗原的CH2和CH3结构域分子是基于抗原特异性结合抗体结构域的已知的 最小分子。瘤形成和肿瘤瘤形成的产物是瘤(肿瘤)，它是由细胞过度分裂产生的组织异常 生长。瘤也被称为“癌症”。不转移的肿瘤也被称为“良性的”。入侵周围组织和/或能够 转移的肿瘤也被称为“恶性的”。实体肿瘤，如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨 性肉瘤、以及其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴 样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、 腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、胆管 癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌和中枢神经系统肿瘤(如神经胶 质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管 母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视
15网膜母细胞瘤)。血液肿瘤的实例包括白血病，白血病包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血 病、急性粒细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨 髓单核细胞性白血病、单核细胞性及红白血病)；慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞 性)白血病、慢性骨髓性白血病以及慢性淋巴细胞性白血病)；真性红细胞增多症；淋巴瘤； 霍奇金病；非霍奇金淋巴瘤(无痛形式和高级形式)；多发性骨髓瘤；沃尔丹斯特伦氏巨球 蛋白血症；重链病；骨髓增生异常综合症；多毛细胞白血病；以及骨髓发育不良。核酸由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关 的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)、相关的天然存在的结构变体及 其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。因此，该术语包括如下核苷酸聚合物其中核 苷酸与它们之间的连接包括非天然存在的合成类似物，诸如例如且不限制于硫代磷酸酯、 氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-0_甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)以及类 似物。此类多核苷酸可以例如使用自动化DNA合成仪来合成。术语“寡核苷酸”通常是指 不超过约50个核苷酸的短的多核苷酸。应理解当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表 示时，这还包括RNA序列(即A、U、G、C)，在RNA序列中“U”代替“T”。本文使用常规符号来描述核苷酸序列单链核苷酸序列的左手末端是5'端；双 链核苷酸序列的左手方向称为5'方向。将核苷酸以5'到3'添加到新生RNA转录物的方 向也称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链称为“编码链”;在具有与从该DNA转 录的mRNA相同的序列的DNA链上并且被定位在RNA转录物的5'到5'端的序列称为“上 游序列”；在具有与mRNA相同的序列的DNA链上并且是编码RNA转录物的3'到3'端的序 列称为“下游序列”。“cDNA”是指与mRNA互补或相同的单链或双链形式的DNA。“编码”是指在多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特定序列充当合成生 物过程中的其他聚合物或大分子的模板的固有特性以及从中产生的生物特性，所述其他聚 合物或大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列。因 此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白，那么该基 因编码该蛋白。用作基因或cDNA的转录模板的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并 且通常被提供在序列表中)和非编码链二者可称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。 除非另外指定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的兼并形式并且编码相同 的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可包括内含子。“重组核酸”是指具有如下核苷酸序列的核酸所述核苷酸序列并非天然接合在一 起并且可通过人工组合两个原本分离的序列区段而制备。人工组合通常是通过化学合成， 或更为常见地通过人工操作分离的核酸片段(例如通过基因工程技术)来实现。重组核酸 包括核酸载体，所述核酸载体包含可用来转化适合的宿主细胞的扩增的或装配的核酸。包 含重组核酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。然后将该基因表达在重组宿主细胞中以产生 “重组多肽”。重组核酸也可起非编码功能的作用(例如，启动子、复制起点、核糖体结合位 点以及类似物)。可操作地连接当第一核酸序列以功能关系与第二核酸序列一起放置时，该第一 核酸序列与该第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么该启动子与该编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，并 且如果有必要接合两个蛋白编码区，则可操作地连接的DNA序列是在相同的阅读框内。病原体引起宿主的疾病或疾患的生物原。病原体包括例如细菌、病毒、真菌、原生 动物和寄生虫。病原体也称为传染原。致病病毒的实例包括以下病毒科中的病毒逆转录病毒科(Retroviridae)(例如 人免疫缺陷病毒(HIV)；人T细胞性白血病病毒(HTLV)；小RNA病毒科(Picornaviridae) (例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、 艾可病毒、口蹄疫病病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如引起胃肠炎的毒株)；披 膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革 病毒、黄病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及其他脑炎病毒)；冠状 病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒、严重急性呼吸窘迫综合征(SARS)病毒；弹状病 毒科(Rhabdoviridae)(例如疱疹性口炎病毒、狂犬病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae) (例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻 疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV))；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布 尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如汉坦病毒、辛诺瓦病毒、立夫特山谷热病毒、布尼亚病 毒、静脉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒、马秋波病毒、鸠 宁病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA 病毒科(Birnaviridae)嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)(型肝炎病毒)；细小病毒科 (Parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒、BK 病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大部分腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱 疹病毒(HSV)-I和HSV-2 ；巨细胞病毒(CMV) ；EB病毒(EBV)；水痘带状疱疹病毒(VZV)；以 及其他疱疹病毒，包括HSV-6)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和 虹彩病毒科(Iridoviridae)(如非洲猪瘟病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉 病毒、马尔堡病毒)；杯状病毒科(Caliciviridae)(例如诺瓦克病毒)和未分类病毒(例 如海绵状脑病的病原、S肝炎的病原(被认为是乙型肝炎缺陷型卫星病毒)；以及星状病
) ο真菌病原体的实例包括但不限于新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、荚膜 组织胞楽菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽 生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙目艮衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌 (Candida albicans)0细菌病原体的实例包括但不限于幽门螺杆菌(Helicobacterpyloris)、伯氏 疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜月市军团菌(LegionelIapneumophi 1 ia)、分枝杆 菌(Mycobacteria sps)(如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、禽分枝杆菌(M. avium)、 胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M. krnsaii)、戈登分枝杆菌 (M. gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、化月农链球菌(Streptococcus pyogenes) (Α 群链球菌)、 无乳链球菌(Streptococcusagalactiae) (B 群链球菌)、链球菌(Streptococcus) (草绿色种群)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus
17bovis)、链球菌(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲 杆菌(pathogenic Campylobacter sp.)、肠道球菌(Enterococcus sp.)、流感嗜血 菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、白喉棒杆菌 (corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌(corynebacterium sp·)、猪红斑丹毒丝 菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气英月莫梭菌(Clostridium perfringers)、 破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、月市炎克 雷伯氏杆菌(Enterobacter aerogenes)、多杀性巴氏杆菌(Pasturella multocida)、 拟杆菌(Bacteroides sp·)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌 (Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Tr印onemapallidium)、极细密螺旋 W (Treponema pertenue)、^(㈱(Leptospira)以i^fe歹[J方文(Actinomyces israelii)。其他的病原体(如原生生物)包括恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)和刚地 弓形体(Toxoplasma gondii)。药学上可接受的介质在本公开内容中有用的药学上可接受的载体(介质)是常 夫 1 白勺。Remington’ s Pharmaceutical Sciences (), Ε. W. Martin, Mack dj 版公司，Easton，PA，第15版(1975)描述了适合于一种或多种治疗性化合物或分子(如一 种或多种抗体)和其他药剂的药物递送的组合物和制剂。一般来说，载体的种类将取决于采用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含 可注射液体，所述可注射液体包括作为介质的药学上和生理学上可接受的流体，如水、生理 盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊 形式)来说，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除 了生物学上中性的载体以外，待施用的药物组合物可以含有少量的无毒辅助性物质，如湿 润剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。多肽一种聚合物，其中单体为通过酰胺键接合在一起的氨基酸残基。当氨基酸是 α氨基酸时，可使用L型光学异构体或D型光学异构体。如本文所用的术语“多肽”或“蛋 白质”旨在涵盖任何氨基酸序列并且包括修饰的序列，如糖蛋白。术语“多肽”具体旨在覆 盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的蛋白质。术语“残基”或“氨基酸残基”包括所指的被掺入到蛋白、多肽或肽中的氨基酸。“保守的”氨基酸取代是基本上不影响或者降低多肽的活性或抗原性的那些取代。 例如，多肽可以包括至多约1个、至多约2个、至多约5个、至多约10个或至多约15个保守 取代，并且其特异性结合与原多肽结合的抗体。术语保守的变异还包括使用取代的氨基酸 置换未取代的母体氨基酸，条件是针对取代的多肽所产生的抗体产生的抗体(antibodies raised antibodies raised)也与未取代的多肽免疫反应。保守性取代的实例在下面显示。
权利要求
一种包含IgG、IgA或IgD的免疫球蛋白CH2结构域，或者IgE或IgM的CH3结构域的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域包含约1个至约7个氨基酸的N端平截，并且其中(i)所述CH2或CH3结构域的环的至少一个被突变；(ii)所述CH2结构域或CH3结构域的环区域的至少一部分被来自异源免疫球蛋白可变结构域的互补决定区(CDR)或其功能片段置换；或者(iii)二者兼有，其中所述多肽具有小于约15kD的分子量，并且其中所述多肽特异性结合抗原。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含来自IgG的CH2结构域。
3.如权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域的环1 被突变。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域的环2被突变。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域的环3被突变。
6.如权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述CH2或CH3结构域的环A-B被突变。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述CH2或CH3结构域的环C-D被突变。
8.如权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述CH2或CH3结构域的环E-F被突变。
9.如权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中环A-B被⑶R置换。
10.如权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中环E-F被⑶R置换。
11.如权利要求9或权利要求10所述的多肽，其中所述⑶R是⑶R3。
12.如权利要求1-11中任一项所述的多肽，所述多肽具有约12kD至约14kD的分子量。
13.如权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域包含约 7个氨基酸的N端平截。
14.如权利要求1-13中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域还包含 约1个至约4个氨基酸的C端平截。
15.如权利要求1-14中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域是非糖 基化的。
16.如权利要求1-14中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域是糖基 化的。
17.如权利要求1-16中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域能够结 合Fc受体。
18.如权利要求1-16中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域能够结 合补体蛋白。
19.如权利要求18所述的多肽，其中所述补体蛋白是Clq。
20.如权利要求1-16中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域能够结 合新生儿Fc受体。
21.如权利要求1-20中任一项所述的多肽，其中所述抗原来自病原体。
22.如权利要求21所述的多肽，其中所述病原体是病毒或细菌。
23.如权利要求2所述的多肽，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
24.如权利要求1-20中任一项所述的多肽，其中所述抗原是癌症特异性抗原或癌症相关蛋白。
25.如权利要求24所述的多肽，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性 黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌或肾细胞癌。
26.如权利要求1-20中任一项所述的多肽，其中所述抗原与自身免疫疾患或炎性疾患有关。
27.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-26中任一项所述的多肽。
28.—种载体，所述载体包含权利要求27所述的核酸分子。
29.一种分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求28所述的载体。
30.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-26中任一项所述的多肽和药学上可接受 的载体。
31.一种组合物，所述组合物包含与效应物分子或可检测的标记结合的权利要求1-26 中任一项所述的多肽。
32.—种治疗受试者的HIV的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权 利要求23所述的多肽。
33.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权 利要求24或权利要求25所述的多肽。
34.一种治疗受试者的自身免疫疾患或炎性疾患的方法，所述方法包括向所述受试者 施用治疗有效量的权利要求26所述的多肽。
35.如权利要求23-26中任一项所述的多肽在制备用于治疗HIV感染，用于治疗癌症或 者治疗自身免疫疾患或炎性疾患的药物中的应用。
36.一种包含IgG、IgA或IgD的免疫球蛋白CH2结构域，或者IgE或IgM的CH3结构 域的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域包含第一氨基酸取代和第二氨基酸取代，其中 所述第一氨基酸和第二氨基酸取代各自用半胱氨酸残基置换原始的残基，其中所述半胱氨 酸残基形成二硫键，并且其中所述多肽具有小于约15kD的分子量。
37.如权利要求36所述的多肽，其中所述第一氨基酸取代是在N端A链并且所述第二 氨基酸取代是在C端G链。
38.如权利要求36或权利要求37所述的多肽，所述多肽包含IgG的CH2结构域。
39.如权利要求38所述的多肽，其中所述第一氨基酸取代是L12至C12，并且所述第二 氨基酸取代是K104至C104 (参考SEQ ID NO :5编号)。
40.如权利要求38所述的多肽，其中所述第一氨基酸取代是VlO至C10，并且所述第二 氨基酸取代是K104至C104 (参考SEQ ID NO :5编号)。
41.如权利要求36-40中任一项所述的多肽，其中所述CH2或CH3结构域包含约1个至 约7个氨基酸的N端平截。
42.如权利要求36-41中任一项所述的多肽，其中(i)CH2或CH3结构域的环的至少一 个被突变；(ii)所述CH2结构域或CH3结构域的环区域的至少一部分被来自异源免疫球蛋 白可变结构域的互补决定区(CDR)或其功能片段置换；或者(iii) 二者兼有，并且其中所述 多肽特异性结合抗原。
43.一种包含IgG、IgA或IgD的免疫球蛋白CH2结构域，或者IgE或IgM的CH3结构 域的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域包含约1个至约7个氨基酸的N端平截，并且其中所述多肽具有小于约15KD的分子量。
44.如权利要求43所述的多肽，所述多肽包含约7个氨基酸的N端平截。
45.如权利要求43或权利要求44所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域还包 含第一氨基酸取代和第二氨基酸取代，其中所述第一和第二氨基酸取代各自用半胱氨酸残 基置换原始的残基，其中所述半胱氨酸残基形成二硫键。
46.如权利要求43-45中任一项所述的多肽，其中(i)CH2或CH3结构域的环的至少一 个被突变；( )所述CH2结构域或CH3结构域的环区域的至少一部分被来自异源免疫球蛋 白可变结构域的互补决定区(CDR)或其功能片段置换；或者(iii) 二者兼有，并且其中所述 多肽特异性结合抗原。
47.如权利要求36-46中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域是非糖 基化的。
48.如权利要求36-46中任一项所述的多肽，其中所述CH2结构域或CH3结构域是糖基 化的。
49.一种鉴定特异性结合靶抗原的重组CH2结构域或CH3结构域的方法，所述方法包括(a)提供在它们的表面上展示重组CH2或CH3结构域的粒子的文库，其中所述CH2或 CH3结构域包含约1个至约8个氨基酸的N端缺失，并且其中所述CH2或CH3结构域具有小 于约15KD的分子量，其中所述文库是通过以下产生(i)提供编码CH2或CH3结构域的遗传多样性群体的核酸分子的文库，其中所述遗传多 样性群体是通过将突变引入CH2或CH3结构域的一个或多个环区域中来提供；并且( )在重组的宿主细胞中表达核酸分子的文库，从而将CH2结构域或CH3结构域表 达在所述粒子的表面上，并且所述CH2或CH3结构域的核酸分子被所述粒子的遗传材料编 码；(b)将所述粒子的文库与所述靶抗原接触以选择特异性结合所述靶抗原的粒子；以及(c)从表达特异性结合所述靶抗原的CH2或CH3结构域的粒子中克隆CH2或CH3结构 域核酸分子，由此鉴定特异性结合所述靶抗原的CH2或CH3结构域。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述CH2结构域或CH3结构域在环1中包含至少一个突变。
51.如权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述CH2结构域或CH3结构域在环 2中包含至少一个突变。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述CH2结构域或CH3结构域在环3 中包含至少一个突变。
53.如权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述CH2结构域或CH3结构域在环 A-B中包含至少一个突变。
54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，其中所述CH2结构域或CH3结构域在环 C-D中包含至少一个突变。
55.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述CH2结构域或CH3结构域在环 E-F中包含至少一个突变。
56.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中所述文库包含重组CH2结构域。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述CH2结构域是IgGCH2结构域。
58.一种鉴定特异性结合靶抗原的重组CH2结构域的方法，所述方法包括(a)提供在它们的表面上展示重组IgGCH2结构域的粒子的文库，其中所述CH2结构域 包含约1个至约8个氨基酸的N端缺失，并且其中所述CH2结构域具有小于约15KD的分子 量，其中所述文库是通过以下产生(i)提供编码CH2结构域的遗传多样性群体的核酸分子的文库，其中所述遗传多样性 群体是通过将突变引入CH2结构域的一个或多个环区域中来提供，其中所述环区域选自环 1、环2和环3 ；并且( )在重组的宿主细胞中表达核酸分子的文库，从而CH2结构域被表达在所述粒子的 表面上，并且所述CH2结构域的核酸分子被所述粒子的遗传材料编码；(b)将粒子的文库与所述靶抗原接触以选择特异性结合靶抗原的粒子；以及(c)从表达特异性结合所述靶抗原的CH2结构域的粒子中克隆所述CH2结构域的核酸 分子，由此鉴定特异性结合所述靶抗原的CH2结构域。
59.如权利要求49-58中任一项所述的方法，其中所述粒子是噬菌体粒子。
60.一种制备重组CH2或CH3结构域的文库的方法，所述方法包括⑴将突变引入CH2 结构域或CH3结构域支架的一个或多个环区域中，或者(ii)用来自异源免疫球蛋白可变结 构域的CDR或其功能片段置换所述CH2结构域或CH3结构域支架的环区域的一部分，或者 (iii) 二者兼有，其中所述支架包含IgG、IgA或IgD的分离的免疫球蛋白CH2结构域或者 IgE或IgM的CH3结构域。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述CH2或CH3结构域支架还包含约1个至约7 个氨基酸的N端平截。
62.如权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述CH2或CH3结构域支架还包含 约1个至约4个氨基酸的C端平截。
63.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中所述CH2或CH3结构域支架还包含第 一氨基酸取代和第二氨基酸取代，其中所述第一和第二氨基酸取代各自用半胱氨酸残基置 换原始的残基，其中所述半胱氨酸残基形成二硫键。
64.一种鉴定特异性结合靶抗原的重组CH2结构域或CH3结构域的方法，所述方法包括 使通过权利要求60-63中任一项所述方法产生的文库与所述靶抗原接触以选择特异性结 合所述靶抗原的重组CH2或CH3结构域。
全文摘要
本申请描述的是工程化抗体恒定结构域分子，例如CH2或CH3结构域分子，所述工程化抗体恒定结构域分子包含至少一个突变，或者包含在所述CH2结构域的环区域中移入的至少一个互补决定区(CDR)或其功能片段。本申请所述的CH2结构域分子是小的、稳定的、可溶的，表现出很少毒性乃至没有毒性并且能够结合抗原。
文档编号C07K16/10GK101977932SQ200980110221
公开日2011年2月16日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年1月31日
发明者迪米特尔·S·迪米特罗夫 申请人:美国政府健康及人类服务部