专利名称：引导癌细胞分化之药物及其在癌症之治疗与预防上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗和预防癌症药剂的制备致癌基因是人类细胞基因的一部分，有人类以来即有癌症，到目前为止，还没有很好的克服方法，可以说这是有史以来持续最久但却仍无法解决的顽疾。癌症之所以难以治疗，癌细胞本身的组成复杂是一个原因，而未找到妥善的防治对策倒是更重要的因素。癌细胞会持续不断地分裂，侵入正常的器管及组织，最后造成病害而致死。传统医学界向来把癌细胞持续分裂当作癌症的最根本症结，进而寻求细胞毒来中止DNA合成以防止细胞分裂，细胞毒疗法源由于此。近四十年来治疗癌症的方针都着重于发展细胞毒疗法。癌症医疗市场亦被这种药物所垄断。二十多年前，甚至说服尼克松总统动用美国总统权威向癌症宣战，投入无数资源，动员美全国医学界人力，期在短期内克服这难症，但癌症并没有被制服。所以单靠财力和人力是无法解决癌症问题，必须寻求突破性的新疗法。
随着医学的进步，寿命的延长，加上工业发达促成环境的污染，世界癌症的发生率和死亡率节节上升，每年死亡于癌症的人数高达数百万人，实际上癌症在中年时代(30-60岁)的死亡率已高居首位，目前寻求有效的新疗法已刻不容缓。
本发明人发现异常的甲基转移复合酵素才是癌症最根本的症结，因为这复合酵素的异常才导致了癌细胞的持续分裂。甲基转移复合酵素在细胞的分裂以及分化扮演着很重要的主导角色，这些酵素活性高时细胞就进行分裂，活性由高转低时，细胞会合成缺甲基核酸，结果细胞就被导引进行分化而变成不再分裂的终末分化细胞。所有的癌细胞甲基转移复合酵素都有异常的甲基转移复合酵素，把这些酵素固定在活性很高又稳定的状态，因而细胞不断地分裂，所以异常的甲基转移复合酵素是癌症的病因，持续的细胞分裂是癌症的症状。一般说来，要医疗一个疾病，从消除病因着手要比消除症状有效得多。中国医学有这样一个金科玉律，即“上医医病于未发，中医治本，下医治标”。就是说最好的医疗策略是预防疾病的发生，预防尤其适合于极困难治疗的疾病，象癌症、心血管病、爱滋病等；次好的医疗策略是消除致病的根本原因；最下策才从消除疾病症状治病。人们用治标的下策和癌症斗争四十多年，并没有制服这个病。
其实正常人体内有足够的化学物质抑制这些异常甲基转移复合酵素的形成，这说明发癌的过程要经过漫长的促成时间，在这期间病人加速排泄抗癌化学物质，到这些抗癌物质减低到不足以抑制异常甲基转移复合酵素时，癌细胞才开始生根繁殖，病症才被发现。
细胞分化剂发展过程要解决癌症问题必须先要掌握致病的根本原因，找出癌细胞和正常细胞根本的差异，对症下药才能解决这个难题。本发明人在1977年发现诺比可夫肝癌细胞的甲硫胺酸腺苷转移酵素(MethionineAdenosyltransferase，MAT)和正常细胞的酵素不相同(文献19)，其相异之处不仅是量的差异，还有质的不同。这发现对癌症的治疗有不可磨灭的贡献，虽然重要性在那个时候并没有被肯定，因为甲基转移最重要的DNA甲基转移的功能在当时还没有被发现出来。一旦DNA甲基转移在调节基因表现的功能被确定后(文献12、15)，异常MAT的重要性就凸显出来。因为这种酵素有重要的功能，癌细胞的酵素和正常细胞的酵素又有质的差异，我们可以利用这种差异找到理想有选择性的抗癌药物。
甲基转移复合酵素的功能MAT是甲基转移复合酵素三个成员酵素之一，另外两个成员酵素是甲基转移酵素和SAHH。甲基转移酵素有许多种，(各色各样都有)而且互不相干，因为每一个酵素都有特异的基质选择性，不过由于和相同的MAT和SAHH形成复合酵素，这些功能殊异的甲基转移酵素却接受同一机理在调节活性。这三个成员酵素要结合在一起才能发挥甲基转移的功能。在正常细胞内，复合酵素的结合需要依赖外来的促进因素，辟如固醇激素即是这激素靶组织之复合酵素的促进因素。有固醇激素时，这三个成员酵素会结合在一起形成稳定而有活性的复合酵素。一旦固醇激素不复存在，复合酵素就分离成单独成员酵素，单独成员酵素稳定性不好，会立即遭受破坏而失去活性(文献23)。非固醇激素靶组织的细胞中，甲基转移复合酵素的形成则有赖于生长激素的刺激，使该细胞产生类似固醇激素的促进因素。总而言之，正常细胞的甲基转移复合酵素的活性是完全受制于外来的促进因素。
核酸的甲基转移复合酵素在细胞的分裂以及分化上扮演着很重要的主导角色，其必要性与生长激素不相上下。核酸的甲基转移种类繁多，然而其中只有两种对细胞分裂以及分化特别有关联，这两种甲基转移是DNA的5-甲基胞苷(5-mC)，和RNA的2′-氧甲基核糖。DNA的5-甲基胞苷发生在DNA双股序列的对应位置上。
当一个基因的启动子序列有这种甲基时，这个基因就被抑制而不能表现出来。人体内每一个细胞都有相同的基因，但是各种不同的细胞都只有一小部分不同的基因被表现出来而形成各种不同功能的细胞。DNA的甲基就是扮演选择基因表现的角色(文献12、15)。每一器官或组织都有其特殊的基础细胞，这些基础细胞已分化至某种程度，但是并未达到终末程度，所以还有分裂能力，但是有特殊功能的分化基因在基础细胞仍然藉甲基的引入而处于被抑制的状态。当基础细胞受到生长激素刺激进行分裂时，甲基转移复合酵素的活性随着生长激素而提高，DNA甲基的分布照样复制，所以分裂出来的子细胞和母细胞相同，都是基础细胞。等到生长激素不复存在时，甲基转移复合酵素的活性立即下降，可是DNA合成酵素是相当稳定，这时会合成缺甲基的DNA，经过两个细胞分裂周期的缺甲基DNA合成，往往会使特殊和分化有关的基因表现出来而变成有特殊功能的终末分化细胞，这种细胞就不再具有分裂能力。缺甲基之DNA合成作用可以说是细胞分化的一个很重要的机理(文献28)。
rRNA的甲基绝大部分发生在核糖这单位的2′氧位置，这种甲基的引入对核糖体的制造有很重要的调节作用(文献18)。细胞在制造核糖体的过程是先合成分子量大于最后产物约两倍的先驱RNA，这先驱RNA在细胞核内经过RNA分解酵素的剪修，把不用的序列剪修分解掉，有用的序列则保留下来形成核糖体。甲基的分布全部着落在有用的序列上，如果这部分序列缺乏甲基，则这部分有用序列也和无用的序列一样会被分解掉。所以甲基化如果进行的完整就可以产生有用的核糖体；如果进行的不完整，就不能产生核糖体。换句话说，核糖体之生产取决于甲基转移复合酵素的活性。核糖体的增产是细胞进入DNA合成前的必备要件，有核糖体的增产细胞才能提供用以复制DNA的必要蛋白质，包括核酸合成酵素、染色体蛋白质和细胞结构蛋白质等。如果没有核糖体的增产，则这些必需蛋白质无法产生足够的量，细胞也就不能进行DNA合成。核糖体的增产对细胞分裂的重要性可从两个简单的实验证明。第一个实验利用放射线菌素D的特殊敏感度，细胞经生长激素刺激8小时后，核糖体的生产才会提升上来，如果在这个时候加入微量的放射线菌素D选择性地抑制核糖体的生产，则发现细胞停止在G1阶段(文献13)，另一个实验利用特殊温度的敏度细胞，这种细胞的rRNA的加工分解酵素在39℃完全失去活性，所以如果在生长激素刺激8小时后将温度从37℃提升到39℃，核糖体的生产便停不来，细胞也随着停止在G1阶段(文献41)。这个实验很清楚地证明核糖体的增产是细胞分裂的一个必要因素，那么调节核糖体生产有决定性关联的甲基转移复合酵素当然对于细胞的生长也有决定性的影响。一旦生长激素不复存在，细胞就会停止分裂而不需大量的核糖体，甲基转移复合酵素率先失去活性，但是细胞在短时间内仍继续合成缺甲基的rRNA先驱产物，这种产物不能够产生有用的核糖体，故相关蛋白质减产，细胞朝向分化的过程前进，终于变成终末分化细胞。可见甲基转移复合酵素在细胞的生长与分化扮演着很重要的主导角色。
异常甲基转移复合酵素在癌症所扮演的角色异常的MAT是由干癌细胞产生一种特殊的蛋白质因素，这因素和正常的MAT结合而造成异常癌细胞酵素(文献21)这一结合把原来正常酵素的活性和调节机理完全改观，癌细胞的特殊蛋白质因素有如固醇激素对正常复合酵素的作用，将三个成员酵素结合成非常稳定有活性的复合酵素，因为有这种特殊蛋白质因素，癌细胞复合酵素的稳定性和活性远远超过正常细胞的复合酵素(文献21)。正常酵素和癌细胞的特殊蛋白质因素的结合不只改变了复合酵素的调节功能，单独成员酵素的动力性能也起了变化，正常MAT和异常MAT的Km(methionine)值不相同，前者为3μM而后者为20μM。为区别相异，前者定名为MATL后者为MATLT，T代表一个特殊的癌因素。癌细胞的MAT和正常酵素相异已被其他研究者证实。癌细胞的S-腺苷高胱胺酸水解酶S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH)也有同样或类似的因素改变其动力性能(文献24)。因为癌细胞自行产生甲基转移复合酵素的促进因素，癌细胞这种酵素的活性就不需依赖外来的因素而能自行维持高的活性，这高活性促成癌细胞在分裂周期运转不息，所以异常的甲基转移复合酵素是癌症的根本病因。
所有癌细胞都有这种异常的甲基转移复合酵素，包括动物的初发癌、移殖癌，移殖在无胸线无毛老鼠的各种人类癌组织，外科手术和组织培养的人类癌细胞等(文献21、22)。这种复合酵素活性的高低和癌组织的成长率有很明显的对应关系。正常组织不管有无积极的进行细胞分裂，都没有异常的甲基转移复合酵素。所以异常的甲基转移复合酵素可以说是构成正常生长和异常的癌生长之间很特殊的差别，我们可以利用这种显著的差别探求药物有选择地抑制异常甲基转移复合酵素。事实上早期的实验也证实可以抑制癌细胞甲基转移复合酵素的化合物，如寡核苷酸类，对正常酵素作用相对的很微弱，甚至毫无作用；相反地，可以促进正常复合酵素活性的化合物对异常癌复合酵素却不能产生同样的效果(文献18、20)。这些实验一再阐明癌细胞的异常的甲基转移复合酵素是癌症化学疗法一个最恰当的医疗靶。
异常甲基转移复合酵素作为医疗靶化学疗法如上所述异常的甲基转移复合酵素是癌症的根本病因，如果消除这些异常酵素之后，癌细胞应该可以像正常细胞那样被引导进行分化而变成不再分裂的终末分化细胞。事实证明这种假设是正确的，诺比可夫腹水肝癌经poly(I)(C)处理后，异常的甲基转移复合酵素会变成正常酵素，经过一段时间的延迟后，核酸的合成迅速减低，终于细胞停止分裂(文献17、18)。poly(I)(C)不能进入细胞内，因而poly(I)(C)的效果很可能是间接的，先由poly(I)(C)引导癌细胞产生寡异腺苷基酯(oligoisoadenylate)合成酵素(文献9)，然后透过这个酵素的产物，寡异腺苷基酯把异常甲基转移复合酵素改变成正常酵素。寡异腺苷基酯是分化细胞的产物。类似寡异腺苷基酯可以将异常甲基转移复合酵素改变成正常酵素的，还有寡肽类和某些有机酸等(文献27)。Burzynski把这些具有抗癌的天然人体产物命名为抗癌素(Antineoplastons)(文献4)。这些抗癌物质大半是低分子量的代谢产物，所以在肾脏过滤后经过再吸收才能回归血液维持一定浓度，再吸收往往不能完全，因此正常人也经常由尿排泄少量有用的抗癌物质，不过正常人能够维持得失平衡，因此体内总有足够量的抗癌物质来抑制癌细胞的形成，廖氏等人把这种天然的化学抗癌作用称之为化学监察(文献26)。正常人尿中的抗癌物质经过提炼精制后，有两种主要成份对异常的MAT有显著的抑制作用，主要是针对异常的癌蛋白质因子使其消失作用，藉此抑制的结果，异常酵素会变成正常酵素(文献28)。这两种主要成份之一是与色素结合的酸性肽类，另一则是有机酸(文献27、29)。正常酵素因为没有异常因子，所以丝毫不受这些抗癌物质的影响，这也是为什么天然的化学抗癌物质具有特异的选择性，因为有选择性，人类的健康才不致于受到影响。癌细胞经过这些精制的有效成分处理后，会被导引进行分化而变成终末分化细胞(文献28)。从酵素的研究得知，异常的甲基转移复合酵素变成正常酵素是引导癌细胞进行终末分化的一个转折点。分析细胞内AdoMet和AdoHcy的量也证实酵素的变化在癌细胞分化所扮演的重要角色。癌细胞的AdoMet量远比正常细胞为高(文献11)，因为癌细胞的MATLT比正常细胞的MATLKm值高出许多。癌细胞一旦分化变成终末分化细胞，AdoMet和AdoHcy的量同时减低很多，正好说明MATLT和SAHHLT同时失去致癌因子而变成MATL和SAHHL。
天然化学监察与癌症的形成既然人体内有天然的抗癌物质，为什么会有癌症发生？分析一下癌症患者，我们发现这些病人的绝大部分较正常人从尿排泄过多的低分子量代谢物质，持久的过量消失造成体内缺乏抗癌物质，因而无法抑制癌细胞的繁殖，终于出现临床症状。越严重的病人缺乏得越厉害(文献25、26)。很明显的这是一种恶性循环，由于某种原因造成病人过度排泄抗癌物质，因此提供机会使癌细胞生根繁殖，癌细胞繁殖的结果更促使多量的排泄，到后来完全失去监察能力，这时癌细胞可以毫不受约束地繁殖下去。可见癌症的临床病害，异常的甲基转移复合酵素是一个很重要的因素，但是天然化学监察能力的破坏也是一个很重要的因素。所以要有效的克服癌症必须要同时顾及这两种因素，即要抑制异常甲基转移复合酵素，也得减低病人过度排泄天然抗癌化学物质，这样才会收到事倍功半的效果。从尿精制的抗癌制剂，细胞分化剂[(Cell Differentia-tionAgent)简称CDA]很明显兼顾到这两种因素，病人过量排泄低分子量代谢物慢慢减少，等到病情好转也就恢复到正常人的状态(文献25)。病人之所以排泄过量低分子量代谢物质可能是发炎的结果，有发炎的症状就有过度排泄现象(文献2、3、10)。发炎的结果促使巨噬细胞产生恶病质素(cachectin)，恶病质素的生理作用导致病人过度排泄。急性发炎因为很快恢复正常，对癌症的形成没有很大关系。慢性发炎持久的影响才会帮助促成癌症，爱滋病人及B型肝炎病人到后来往往会变成癌症病人原因在此。癌细胞本身也构成慢性发炎的病源，癌细胞越繁殖，发炎的现象越厉害，过度排泄的结果也就明显。有效控制过度排泄对癌症的治疗实际上是一个重要的课题，但是完全被忽略了。已知的细胞毒药物本身会促进过度排泄(文献26)，对天然监察没有保护反而有破坏作用，不难想象细胞毒疗法的成功需要依赖把所有癌细胞消除干净，否则病人经长期细胞毒药物的破坏，没有自卫能力去抑制残余的癌细胞。相反的，从尿精制的抗癌制剂其中有效成分可以改善癌症病人的过度排泄，病人的天然化学监察能力恢复后，就可以依赖本身的自卫能力来消除残余的癌细胞，不用清除所有的癌细胞即可痊愈。这种尿精制抗癌制剂中的苯基谷氨酰胺就有改善癌症病人过度的排泄的功能。虽然这个化合物本身对异常甲基转移酵素没有作用，对癌细胞也没有直接抑制作用，但是由于能够防止过度排泄抗癌物质，对人或动物的天然化学监察能力起到保护作用，对症状较轻的癌症病人也有医疗效果(文献25)。另外，对动物的癌症形成有显著的预防作用(文献16、35)。动物细胞的癌症形成过程在细胞培养液比在动物体内容易完成(文献36、39)，因为动物有天然的化学监察能力，要一段很长的促进时期消磨这种自卫能力，癌细胞才可以繁殖起来。一般来说，像巴豆油这种发炎促进物质可以缩短促进时期，像苯基谷氨酰胺可以保护化学监察的则可预防癌症的发生。
分化辅助剂分化引导剂可以直接或间接将癌甲基转移复合酵素的异常因素消除，因而引导癌细胞进行终末分化。甲基转移复合酵素是由三个成员酵素结合而成的，我们发现各成员酵素的抑制剂往往可以增进分化引导剂消除异常因素的功能，虽然这些抑制剂本身没有明显的分化促进作用，廖氏等人把这种化合物命名为分化辅助剂(Helper Inducer)(文献32)。MAT的竞争性抑制剂如正丁酸、苯丁酸、苯醋酸等都有明显的分化帮助剂活性。一般来说分化辅助剂如苯醋酸是很容易得到，毒性又低，用于减低分化引导剂的需求量，是有医疗效益的，因为分化引导剂实在很珍贵且不容易大量制取。早期的癌症患者体内原有的分化引导剂成份还未消失太多，单单用分化辅助剂也可达到医疗效果。用以治疗脑癌尤其适当，脑部结构上比较特殊，有血脑障碍保护内在的分化引导剂成份的消失不致很快，所以单用苯醋酸这种容易通过血脑障碍的分化辅助剂就会有很好的医疗效果(文献38)。分化辅助剂之用于治疗脑癌值得推荐，因为细胞毒药物大部分不能达到脑部。
分化疗法的医疗效果由临床经验得知，分化疗法是相当值得追求的疗法。抗癌素(Antineoplastons)在1985年前，Burzynski曾经用来医治晚期癌症病人，60％的病人有好转现象，其中三分之一生命期超出五年进入无病状态(文献5、6、7)，这类药物最主要的优点是没有不良的副作用。其实所有分化治疗剂原始的医疗靶或许不尽相同，到后来仍然要透过修正异常甲基转移复合酵素达到引导癌细胞分化的结果，比如干扰素和维生素甲酸就是依赖这些药物引导癌细胞产生类似抗癌素产物来作用在异常甲基转移复合酵素而达成癌细胞的终末分化，这种类似抗癌素之产物很可能是寡腺嘌呤核苷酸(oligoisoadenylate)。干扰素对多毛白血病(文献37)和维生素甲酸对急性早幼粒细胞白血病(文献)是公认这些癌症的最好疗剂，虽然复发的问题还没有完全解决(文献1、34)。
本发明的目的在于基于癌症是一系列相当复杂的疾病，但其有一共同特征，即所有的癌细胞都具有持续不断的分裂能力，且无法进行终末分化，本发明人已经发现异常甲基转移复合酵素是构成癌症这一共同特征的最主要病因。针对这病因寻求癌症的治疗与预防，即利用正常人体本能具有抗癌能力的物质制备抗癌、防癌的药物，改变异常甲基转移复合酵素之异常性达到引导癌细胞终末分化而不再继续分裂直至死亡，且不具备不良的副作用。
本发明是这样实现的，基于人类多年采取相对下策的办法治疗癌症而效果不显著，应该把治疗的目标放在“甲基转移复合酵素“这个治本的疗法上。因为癌细胞是异常的甲基转移复合酵素促成的，用药物抑制这异常酵素，则对已发病的有治病的功效，末发病的有预防的功效，此疗法兼具上医和中医的优良疗法。由于正常人尿中具有并排泄少量可引导癌细胞进行终末分化的化学物质，本发明即是用正常人的尿进行提练精制成可以将癌细胞的异常甲基转移复合酵素改正、能引导癌细胞进行终末分化而不再继续分裂的细胞分化剂及其制剂，以达到医疗和预防的目的。本发明的制剂可以有选择地抑制异常的甲基转移复合酵素，结果癌细胞就和正常细胞一样被引导进行分化，因为正常的甲基转移复合酵素没有异常因素，所以正常细胞的生长和功能不会受到这些抗癌物质的影响，在抗癌化学药物中，这是唯一有特异选择性的，是一种顺乎自然治本疗法，而且健康人本来也是依赖这些化学物质来对抗癌症的发生。也就是说这是人类固有的抗癌方法。抗癌化学药物中很难找出可以驾乎其上的药物。
本发明的细胞分化剂的制备是首先收集具有一定肌酸酐浓度的正常人尿，经过吸附剂吸附和用有机溶剂进行萃取、回收纯化而成制剂，本发明的制剂是一种针剂，亦可制成胶囊等剂型。
本发明与已有技术相比，其优点在于本发明利用人体本能的抗癌物质制造治疗和预防癌症的药物，从根本上使癌细胞分化而不再继续分裂以达到治疗的目的，故本发明是一种治本的有效方法，而且本发明的药物没有任何不良的副作用。
图1为本发明的细胞分化剂制造流程2为本发明的细胞分化剂的凝胶过滤分析3为尿红素和维生素B2作为分化辅助剂浓度与减低指数的关系4为尿红素和维生素B2对TRNA甲基转移酵素抑制能力与其浓度的关系5为尿红素和维生素B2对分化引导剂的增进作用6为本发明的CDA-II和胸苷配合使用的抗癌作用图结合实施例进一步说明附图A.制备本发明包括尿的收集、过滤、吸附、溶剂萃取和干燥，用无热原水溶解作为CDA-II的原料药。
1.细胞分化剂的制备利用桶收集人尿，桶内放入盐酸，约每20kg人尿用1kg 1N盐酸，上述促进分化的活性至少可保持一个月不受破坏，PH值调整到2后，尿液先用尼龙布粗滤，再经常规细滤将分子量大于10000道耳者的物质除去。萃取时使用不锈钢滤斗，滤斗上放置装有吸附剂XAD-16的布袋，使用前先用2倍(v/w)的乙醇冲洗，再用2倍(v/w)的去离子水冲洗掉乙醇，重复二次。被吸附在XAD-16的物质用4倍溶量(v/w)的去离子水冲洗后，再用2倍溶量(v/w)的乙醇溶解出来。中和乙醇抽取液后，用干燥机把乙醇蒸发干净，干燥桶内温度保持在50℃以下。干燥后的物质用无热原水溶解出来作为CDA-II的原料药。
乙醇抽取后的吸附剂用2倍溶量(v/w)的去离子水冲洗后，可重复使用，一直到吸附能力减低至新吸附剂吸附能力的70％左右再更换新吸附剂，一般说，XAD-16约可重复使用200次以上。
由于人体每天排泄的肌酸酐(crcatinine)有一定量，尿中的固体浓度大约与肌酸酐成正比，故尿中有效化学物质的定量总是以肌酸酐作基础较为可靠。作为原料所收集的尿液，其肌酸酐浓度在1.2-3.7克/公升间，平均为2.4±0.6克/公升。CDA-II产率在通过吸附剂的首一百次约为0.51±0.17克/克肌酸酐，而尿的固体成分约为46.7克/克肌酸酐，所以所制得的CDA原料药之产率是固体成分的1.1％左右。
2.细胞分化剂注射液的制备CDA-II注射液的最后浓度约为50±2克/毫升，而原料药的浓度一般在250毫克/毫升以上。故原料药需进行稀释，首先将原料药用去热原水稀释后，经一系列的过滤，先用慢速滤纸过滤，再依序经1μm和0.45μm滤孔的微孔滤膜过滤，滤液用去热原水调到适当浓度，在8小时内经0.22μm滤孔的过滤器，在无菌操作室(100级净化间)内完成过滤去菌。去菌后马上灌装制成100毫升或250毫升分化剂注射液制剂。
3.细胞分化剂胶囊的制备CDA-II可以用来制成胶囊制剂，即将上述原料药经微孔滤膜过滤的过滤液再用冷冻干燥方法干燥成固体。干燥固体研成粉末后，用自动胶囊机装成胶囊制剂，并装入铝箔密封，最后用放射线灭菌。
B.本发明之细胞分化剂分析4.细胞分化剂抗癌活性分析细胞分化剂的抗癌效力乃是根据有效成分对癌细胞异常甲基转移复合酵素的抑制，因而引导癌细胞进行终末分化以至停止细胞分裂，即细胞分化剂的活性具有抑制癌异常酵素MATLT的作用，可引导HL-60癌细胞的分化，以及抑制人类乳癌细胞群的形成，这些活性的测定方法已发表(文献19，27，29)。本发明取三批CDA-II制剂分析其抗癌活性，其操作如后使用CDA-II之注射液制剂，所用剂量为1毫克/毫升。MATLT是由HL-60癌细胞制取，首先将沉淀的细胞悬浮于0.05M Tris，PH7，0.5mM MgCl2，然后用搅匀器将细胞膜打碎。酵素抽取液用高速离心法分离出来，再经纤维素层析法以KCl梯度溶液将MATLT溶解出来并予以精制(文献19)。MATLT活性的测定是在0.05毫升的反应液包括0.05M Tris，PH8.2，0.15M KCl，15mM MgCl2，5mMDTT，2mM ATP及1μM3H-CH3]甲硫胺酸，37℃反应30分钟。将反应液酸化，然后全部移至1平方英寸的磷酸纤维纸上，这些纸一起在烧杯内多次用5mM磷酸缓冲液，PH7，冲洗掉未反应的[3H-CH3]甲硫胺酸，最后测定被吸附之[3H-CH3]AdoMet的放射线，籍此决定MATLT的活性(结果见表1)。
HL-60癌细胞的终末分化按照NBT+测定方法(文献27)进行。先将HL-60细胞稀释培养，每一培养瓶置入10毫升起始细胞，其浓度为1.5×105细胞/毫升，对比样品及含CDA-II的培养瓶均经过96小时培养后，取出一小部分将细胞用离心杨沉淀下来，这些细胞用NBT试剂在37℃作用半小时后，取出一小滴放置在细胞计数器并在显微镜下计数全部细胞数及染成黑色(NBT+)的细胞数。NBT+所占的百分比即CDA-II引导分化的活性(表1)。
CDA-II抗癌活性的另一指标是对HBL-100乳癌细胞群的抑制，先将等比级数增加的乳癌细胞用生理盐水冲洗一次，然后加入约2毫升的0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA培养液，在37℃下培养10分钟。先测定细胞浓度，再取部分稀释成3×103细胞/毫升，取0.5毫升稀释液加入4.5毫升对比液或含有CDA-II的培养液在37℃下培养。五天后，将培养液倒出，用生理盐水冲洗一次，然后用甲醇固定15分钟，固定后的细胞群用20倍稀释的Giemsa染色液浸泡30分钟。倒出染色液，经水洗烘干后，在解剖镜下计数细胞群数目，籍此决定CDA-II的抗癌活性(表1)。
表1细胞分化制(CDA-II)的抗癌活性％MAT抑制％NBT+ ％乳癌细胞群抑制制剂批号0149 58 1000255 53 1000350 54 100注CDA-II制剂为注射液制剂，所用剂量浓度为1毫克/毫升。MATLT由HL-60癌细胞如前述方法经DEAE-cellulose纯化制备，活性测定也按前法(文献(19，PH60癌细胞的终末分化乃根据NBT+测定方法测定(文献27)。至于癌细胞群形成的抑制作用则采用人类HBL-100乳癌细胞的培养方法(文献29)。
5.细胞分化剂的有效成分分析将本实施例之2制得的CDA-II细胞分化剂注射液冷冻干燥，浓缩成200毫克/毫升。取5毫升浓缩液加入Bio-Gel P2的层析管柱(4.1厘米×44厘米)，然后用蒸馏水溶离，每7分钟自动收集一管，每管10毫升。完成分离后，从每支管取出25微升，加水稀释至1毫升，测定A255的吸光度。另外也从每支管取出25微升作MATLT活性抑制的测定，MATLT活性的测定是根据本实施例4所述方法。然后根据A255的吸光值把收集管分割成如图2所示的8个部分，将每一部分籍冷冻干燥把水分完全蒸干，测定干燥量以决定重量百分比分布。干燥固体则重新溶解于蒸馏水，用以测定HL-60癌细胞的分化活性，这活性用％NBT+来表示，分化活性的测定是根据本实施例4所述方法进行，其结果如图2所示。
细胞分化剂抗癌的有效成分中，最重要的当然是可以引导癌细胞分化的引导剂。其分离纯化及作用机制已发表(文献27、28、29和30)。分化引导剂有两种主要的化学成分；一为与色素结合的酸性肽类，简称PP-O，一为有机酸类，简称OA-0.79。PP-O是在如图2所示分割之第一部分，OA-0.79则在第5和第6部分。要特别说明的是细胞分化剂之分化活性的表现并不是分化引导剂单独作用所致，而往往是由于和分化辅助剂协同所表现出来的活性。分化辅助剂是细胞分化剂的主要化学成分，因分化引导剂的含量极少，且其化学结构仍属未知，因为还没有精纯到可以决定的程度。就如图2所示分化引导的活性和MATLT抑制的活性非常吻合，不过有些部分如图2的第2和第3部分，虽有明显的MATLT抑制活性，但并没有引导癌细胞分化的活性。这部分可能只有分化辅助剂而没有分化引导剂，所以不具有引导癌细胞分化的活性。
分化辅助剂是甲基转移复合酵素的单独成员酵素的抑制剂(文献32，可以协助分化引导剂将异常甲基转移复合酵素改正为正常酵素，因而促进分化引导剂的分化功能。
CDA制剂中已知为MAT抑制剂的有苯醋酸，吲噌醋酸和马尿酸。苯醋酸很可能是苯基谷氨醯胺在干燥过程时的水解产物，是分布在第6和第7部分，用C18HPLC可以测定出来，吲噌醋酸也在这部分。马尿酸则是第5部分的主要成分。这些MAT抑制剂要达到0.5减低指数(即分化引导剂有效剂量减半)的浓度各为4mM苯醋酸，8mM马尿酸和0.95mM引噌醋酸。作为分化辅助剂甲基转移酵素的抑制剂比MAT的抑制剂有效得多，前者往往只要有后者千分之一或更少的量即可达到同样的效果。CDA制剂中已知有两种甲基转移酵素的抑制剂，都具有很好的分化辅助剂活性。这两个成分是维生素B2和尿红素。维生素B2分布在图2第8部分的后半部分(文献31)，该成分再经C18HPC，可得很精纯的维生素B2，含量约为0.04％左右，尿红素是在第6和第7部分，含有尿红素的流分再经Sephadex SH管柱层析法和矽胶薄层层析法可以获得很精纯的尿红素，含量为CDA-II制剂的0.5％。
6.尿红素和维生素B2的分化辅助剂活性的测定分化辅助剂活性的测定是依据本发明人等所设计的方法(文献32)。用培养的HL-60白血癌细胞，以NBT的定量方法来测定癌细胞的分化程度。开始是将HL-60细胞稀释培养，每一培养瓶含有10毫升起始细胞液，其浓度为1.5×105细胞/毫升，每组四个培养瓶作对比，只添加维生素甲酸分化引导剂，剂量调节到可引导15％至60％之间的NBT+细胞，另加一个只加溶剂的对比瓶。维生素甲酸是溶于甲醇，但甲醇的总加入量不得超过2％，这对癌细胞的分化不会有影响。其它每组同样有四个培养瓶，但用比较低剂量的维生素甲酸，另加一个只有溶剂的对比瓶，每一组再加不同剂量的分化辅助剂。经96小时培养后，测定每一瓶的细胞数目，并按本实施例4所述方法，进行NBT测定。一般说，HL-60细胞的自然分化(即没有任何添加剂)总是低于4％。在只有分化辅助剂组的剂量范围内，细胞分化多半不会超过10％。每一瓶的NBT+数值都需要减除对比值的基数。
将剂量与NBT+之相对关系划出曲线，籍此可获得ED50值，即NBT+50％所需的分化引导剂剂量。从这些ED50值可计算出分化辅助剂的减低指数，减低指数＝有分化辅助剂的ED50/单独引导剂ED50。减低指数越低，分化辅助剂的功能越高。其结果如图3所示，维生素B2和尿红素要达到0.5减低指数的浓度分别为3.0M和1.8M，比上述的MAT抑制剂活性高出许多。
7.尿红素和维生素B3对tRNA甲基转移酵素的抑制活性
tRNA甲基转移酵素是由HL-60癌细胞制备，根据本实施例4所示的高速细胞抽取液。先将细胞抽取液调到PH5，沉淀的蛋白质用离心机分离出来，再溶于0.05M Tris，PH7.8，0.5mM MgCl2与5mM HSCH2CH2OH组成的混合液。再经过DEAD-cellulose层析法，以KCl梯度冲提液将tRNA甲基转移酵素溶离出来精制(文献20)。tRNA甲基转移酵素活性的测定在0.25毫升反应液内进行，其中包括0.05M Tris，PH7.8，0.1M，NH4Cl，0.04M NH4F，0.5mM MgCl2，5mM DTT，20微克大肠杆菌BtRNA，0.25μCi[3H-CH3]AdoMet，以及25微克酵素。反应在37℃进行3钟。其结果如图4所示，尿红素和维生素B2具有抑制tRNA甲基转移酵素的活性，不过抑制甲基转移活性的有效剂量要比分化辅助剂的有效剂量高出很多，这可能和测这些不同活性的理化环境有关，因不同的理化环境(比如盐的浓度)会影响化学物质和酵素的有效接触。尽管敏感度有相当差异，不同的甲基转移酵素的抑制剂和分有效的分化辅助剂。还发现其它甲基转移酵素的抑制剂，例如溴化乙锭和海康松(文献20)，它们和尿红素及维生素B2一样有很好的分化辅助剂活性。这两种甲基转移酵素的抑制剂要达到0.5减低指数的浓度各为0.95μM溴化乙锭和2μM海康松(文献20)，它们和尿红素及维生素B2一样有很好的分化辅助剂活性。这两种甲基转移酵素的抑制剂要达到0.5减低指数的浓度各为0.95μM溴化乙锭和2μM海康松。所以甲基转移酵素的抑制剂当作有效的分化辅助剂应该不容置疑的。
8.分化辅助剂的促进分化作用的分析分化辅助剂不但可以降低分化引导剂的有效剂量，又可促进分化程度的完全。
培养HL-60癌细胞，其培养的起始浓度为1.5×105细胞/毫升。培养瓶分成三组，每组4至5瓶，其中一瓶作为无添加剂的对比。一组加入维生素甲酸0.025到0.15μM作为对比组；另外两组加入4μM的尿红素和维生素B2。培养96小时后，作NBT测定。每个测定值均需减除无添加剂的对比基数。
其结果如图5所示，单用分化引导剂分化程度最高只能达到85％左右，如有尿红素或维生素B2帮助，则分化程度可达100％。促进分化程度的完全在医疗上可能比降低分化引导剂的有效剂量更为重要。
已知维生素甲酸作为抗癌剂，虽其疗效极佳(文献14、42)，可是不久癌细胞又会复发(文献34、1)。复发和单用分化引导剂分化不完全有关，其原因是单用分化引导剂会造成伤害，使细胞不能完成分化程序。由于分化的程度需要经过漫长的两个细胞分裂周期(文献43、44、45)，如细胞受到伤害而停顿就不能完成终末分化。异常甲基转移酵素一旦被分化引导剂修正去掉癌蛋白因素，复合酵素会分解成单独三个成员酵素，有些甲基转移酵素成单体的时候会表现分解核酸的活性而造成伤害细胞(文献18)，如伤害严重则细胞死亡，若伤害不够严重，经过一段长时间的停顿和修复且临床的维生素甲酸无法维持有效浓度时，这些修复复活的细胞就会回复原状造成复发的结果。所以分化辅助剂是分化疗法不可缺的成分，虽其重要性或许比不上分化引导剂。
细胞分化剂除了必要的分化引导剂和辅助剂外，还有另一种成分对癌症医疗也相当有帮助，即抗恶病质剂。发现苯基谷氨醯胺可以对抗癌症病人恶病质症引起的过渡排泄(文献26)；这化合物可以恢复病人化学监察本能，对早期的病人确实有医疗效果(文献26)，尤其对癌症的预防效果更明显(文献16、35)。苯基谷氨醯胺是图2第4部分的主要成分。总之，细胞分化剂有许多必要的化学成分，互相协助来达到良好的医疗作用。
9.细胞分化剂与其它抗癌化学疗剂的协助抗癌作用癌症致病的因素有多种，当然异常甲基转移复合酵素是其中很重要的病因，其它癌基因的表现也是促成症状的重要因素，虽然我们相信解决异常甲基转移复合酵素已除去了一个大害，但更相信多方面的夹击会取得更好的疗效。
癌细胞有非常活跃的甲基转移复合酵素，如单用化学药物抑制DNA合成会引起过度甲基转移，这是促成基因重复合成的原因。基因重复合成会导致抗药物细胞的形成(文献33)，这是化学疗法失败的一个很重要因素。用细胞分化剂抑制甲基转移复合酵素可以减低抗药细胞的形成，有助于癌症的治疗，事实亦证明细胞分化剂对某些抗癌药物确实有协助的治疗效果。如本发明利用CDA-II和胸苷的组合用药(图6)。
附录专业名词缩写(1)AdoHcyS-腺苷高胱胺酸(S-adenosylhomocysteine)(2)AdoMetS-腺苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine)(3)CDA细胞分化剂(cell diffentiation agent)(4)DTT二硫苏糖醇(dithiothreitol)(5)HPLC高效液相层析(high performance liquid chromatography)(6)MAT甲硫胺酸腺苷转移酵素(methionine adenosyltransferase)(7)NBT硝基兰四唑(nitroblue tetrazoliun)(8)SAHHS-腺苷高胱胺酸水解酵素(S-adenosylhomocysteine hydrolase)(9)XAD吸附剂
权利要求
1.一种引导癌细胞分化之药物剂的制备方法，其特征在于用于治疗与预防癌症，以癌细胞中异常甲基转移复合酵素为药靶的细胞分化剂及其载剂是从人尿提练精制而成。
2.根据权利要求1所说的一种引导癌细胞分化之药剂的制备方法，其特征在于药物是制成针剂、胶囊等剂型。
3.根据权利要求1所说的一种引导癌细胞分化之药剂的制备方法，其特征在于(1)收集新鲜人尿，其中肌酸酐浓度在1.2-3.7克/分升间；(2)通过吸附剂XAD-6或类似功能的吸附剂；(3)经乙醇或类似功能的有机溶剂萃取；(4)回收和纯化细胞分化剂。
4.根据权利要求1所说的一种引导癌细胞分化之药剂的制备方法，其特征在于细胞分化剂最好与胸苷合并使用。
全文摘要
本发明涉及一种治疗癌症药剂的制备。本发明是由新鲜人尿提练纯化的细胞分化剂CDA－Ⅱ。本发明揭示CDA－Ⅱ可以解除癌细胞甲基转移酵素异常状态,本发明是一种抗癌新方法,旨在去除病因,可促进癌细胞的终末分化而达医疗的显著效果。本发明药剂在治疗上有特异的选择性,且无不良副作用,其有效成分包括分化引导剂、分化辅助剂和抗恶病质剂,这些有效成分的相互协助可达最有效的疗效。CDA－Ⅱ和其它抗癌药物如胸苷联合使用,其抗癌效果更佳。
文档编号A61K9/48GK1172650SQ9610904
公开日1998年2月11日 申请日期1996年8月2日 优先权日1996年8月2日
发明者廖明征 申请人:张铭烈