抗肥胖蛋白的制作方法

专利名称：：抗肥胖蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明属于人类药物领域，特别是用于治疗肥胖症及与肥胖相关的疾病。更具体地说本发明涉及一种当施用给病人时能调节脂肪组织的抗肥胖蛋白。在美国及全世界，肥胖，特别是上体肥胖是一个普遍而严重的公共健康问题，根据最近的统计，在美国超过25％的人，在加拿大超过27％的人超重[Kuczmarski，R.J.，美国临床营养学杂杂。55495S-502S(1922)；Reeder，B.A.，等人，加拿大医学学会杂志，1462009-2019(1992)]。上体肥胖是引起人的二型糖尿病的最大危险因素，也是导致心血管疾病及癌症的危险因素。最近估计全世界范围内，在肥胖上花费的医疗费用达1500亿美元。鉴于这一问题的严重性，美国卫生局医务主任已经开始向美国社会中肥胖症日益增多的情况宣战。大部分由肥胖引起的病症与dyslipidemia，高血压，及胰岛素抗性有很大的关系。大量研究表明通过节食及体育锻炼而减轻肥胖程度后会显著地减少这些危险因素。不幸的是，这些疗法极不成功伴随着高达95％的失败率。失败的原因可能是这些疾病与导致食欲增加，对高能食品的偏好，体育活动的减少，及脂质代谢增强的遗传上内在的因子有着密切的关系。这表明遗传有这些遗传特征的人不论他们如何努力对付这种疾病，他们都有易于发胖的倾向。因此，需要一种能够治疗肥胖障碍并能在不管遗传素质如何的情况下均能使医生成功地治愈肥胖病人的医药制剂。多年来，生理学家一直认为，当哺乳动物过量进食后，脂肪过量的信息会传递给大脑而得知机体过度肥胖，从而使机体减少进食并消耗更多的能量[Hervey，G、R.，自然222629-631(1969)]。这种“反馈”模型受到了联体生活实验的支持，暗示循环激素控制肥胖。ob/ob小鼠是一种肥胖症和糖尿病模型，已知其带有一个联接到第六染色体突变上的常染色体隐性特征。最近，Zhang，Y和他的同事公开了这种疾病有关的小鼠基因的定位克隆[Zhong.Y.等自然372425-432(1994)]。该文公开了一种在脂肪织组中特异表达，编码167个氨基酸蛋白和21个氨基酸信号肽的基因。然后大鼠肥胖基因被克隆并表达[Murakami，T等，生物化学，生物物理研究通讯，209944-952(1995)]。目前推测这种显然由ob基因编码的蛋白是脂肪调节激素。由ob基因编码的这种蛋白是有药理活性的，但是它的物理性质却不合乎需要。例如，人类蛋白在药物制剂形式及生理条件下易产生沉淀并发生聚集。含有沉淀的蛋白质制剂或注射后蛋白质发生沉淀都会增加病入产生免疫反应的危险性而且会导致注射部位的疼痛。因此，有必要开发一种有药物活性而且物化稳定性有所提高的药物制剂。申请人发现所观测到的天然人类蛋白发生聚集的部分原因是蛋白质，特别是第100和138个残基的表面疏水相互作用。申请人又发现如用带电氨基酸取代这些残基位点后，ob蛋白聚集的倾向将大大减少，于是可得到一种有了很大改进的药物制剂。同时，本发明也提供了生物活性肥胖蛋白。这些制剂使病人能够战胜肥胖症并过正常生活，使他们患二型糖尿病，心血管疾病和癌症的危险性处于正常水平。本发明涉及一种如式(I)所示的蛋白质(序列鉴定号1)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleXaaAspIleSerHisThrXaaSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgXaaXaaIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(I)其中在22位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸；在28位的Xaa是谷氨酰胺或缺失；在72位的Xaa是天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸，或天冬氨酸；在73位的Xaa是缬氨酸或甲硫氨酸；所述蛋白含有至少一种如下取代情况100位的色氨酸由谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸、赖氨酸，或精氨酸所取代；138位的色氨酸由谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，或精氨酸所取代；或是它们在药用上可接受的盐。本发明进一步提供了一种治疗肥胖症及与肥胖相关疾病的方法，包括给哺乳动物服用所需的式(I)所示的蛋白质。本发明进一步提供了一种药物配方，其含有式(I)所示的蛋白质及一种或几种药用上可接受的稀释剂，载体，或赋形剂。本发明进一步提供了一种含有连接到式I蛋白质N末端上的前导序列的式(I)蛋白质。这种蛋白质有抗肥胖活性并用作制备式(I)蛋白质的中间体。本发明进一步提供了编码式(I)蛋白质或带有前导序列的式(I)蛋白质的DNA。本发明的另一个实施方案是生产式(I)蛋白质的方法，包括(a)将编码式(I)蛋白质或含有前导序列的式(I)蛋白质的DNA转入宿主细胞；(b)在蛋白质可表达的条件下培养宿主细胞；(c)回收表达的蛋白；并且，任选地，(d)用酶切除前导序列得到式(I)蛋白质。本发明进一步提供一种用于治疗肥胖症及与肥胖相关的疾病的蛋白质，以及一种制备用于治疗肥胖症及与肥胖相关的疾病的药剂的蛋白质。详细描述为了达到这里公开的和要求保护的本发明的目的，下面的术语和缩写定义如下碱基对(bP)--指DNA或RNA。缩写A，C，G，和T指的分别是DNA分子中核苷酸的5’-单磷酸形式(脱氧)腺嘌呤，(脱氧)脱嘧啶，(脱氧)鸟嘌呤，及(脱氧)胸腺嘧啶。缩写U，C，G，和T指的分别是RNA分子中核苷酸的5’-单磷酸形式尿嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤，和脑腺嘧啶。在双链DNA中，碱基对指的是A与T或C与G间的配对关系。在DNA/RNA异源双链中，碱基对指的是T(或U)与A或C与G间的配对关系。FMOC-9-芴基甲氧基碳酰的缩写。免疫反应蛋白-用来表示抗体，与亲本抗体性质相似的能够与抗原结合的抗体片段，(抗体片段是由亲本抗体中获得的)，以及单链多肽结合分子[Bird，E.R，等，PCT申请号PCT/US87/02208，国际出版号WO88/01649，1988年3月10日出版)]。质粒-一种自我复制的染色体外遗传因子。PAM-4-羟甲基苯乙酰胺甲基的缩写。PMSF-苯甲基磺酰氟的缩写。阅读框-一种核苷酸序列，由tRNA，核糖体及相关因子的翻译装置对其以三联体形式“阅读”进行翻译，一个三联体对应一种特定的氨基酸。由于每个三联体是不同的但长度相同，因此编码序列一定是多个三联体。一个碱基对的插入或缺失(称作移码突变)会导致相同的DNA区段编码两种不同的蛋白质。为确保避免这种情况，与所需多肽对应的三联体密码子必须从启始密码子开始以多个三联体的形式排列，即要保证正确的“阅读框”。重组DNA克隆载体一任何自主复制载体，包括(但不仅限于)含有一个DNA分子的质粒和噬菌体，在其中能够加入或已经加入了一个或多个插入的DNA区段。重组DNA表达载体—在其中已经结合有启动子的任何重组DNA克隆载体。复制子—控制或允许质粒或其它载体自主复制的DNA序列。TFA—三氟乙酸的缩写。转录—DNA核酸序列中的信息转移到互补RNA序列中的过程。翻译—信使RNA的遗传信息用来特异性指导多肽链的合成。Tris—-tris(羟甲基)-氨基甲烷的缩写。治疗—用来描述为战胜疾病，症状，或失调而管理并照顾病人，包括使用本发明的化合物来预防症状或并发症的发生，减轻症状或并发症，或消除疾病、症状，或失调。因此治疗肥胖症包括抑制食物的摄取，抑制体重增加，从而使有需要的病人体重减轻。载体—在细胞转化的基因操作中用来提供与合适的蛋白质对应的核酸序列的复制子，当与合适的控制序列结合时，把特异性的特征转给将要转化的宿主细胞。质粒，病毒、和细菌噬菌体是适宜的载体，因为它们本身就是复制子。用限制性内切酶和连接酶对不同来源的DNA分子进行切割并连接可以构建人工载体。载体包括重组DNA克隆载体和重组DNA表达载体。X-gal-5-溴-4氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷的缩写。按照37C、F、R、§1、822(b)(2)(1993)宣布的内容，美国专利商标局认可氨基酸缩写，除非另有说明，氨基酸均为L-构型。如上边提到的，本发明提供了式(1)所示的蛋白质51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleXaaAspIleSerHisThrXaaSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgXaaXaaIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO1)(I)其中在22位的Xaa是天冬酰胺或丝氨酸；在28位的Xaa是谷氨酰胺或缺失；在72位的Xaa是天冬酰胺，谷氨酰胺，谷氨酸，或天冬氨酸；在73位的Xaa是缬氨酸或甲硫氨酸；所述蛋白质至少含有下例取代之一100位的色氨酸被谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，或精氨酸所取代；或者138位的色氨酸被谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，或精氨酸所取代；或其是其在药物上可接受的一种盐。本发明的优选蛋白是式I所示的那些蛋白，但其中在22位的Xaa是天冬酰胺；在28位的Xaa是谷氨酰胺；在72位的Xaa是天冬酰胺或天冬氨酸；和在73位的Xaa是缬氨酸。其它的优选蛋白质是那些第100位的色氨酸被谷氨酸或天冬氨酸所取代；或者是第138位的色氨酸被谷氨酸或天冬氨酸所取代的蛋白质。特别优选的蛋白质是式1蛋白质中72位的Xaa是天冬氨酸。另外的优选蛋白质是地些第100位的色氨酸被组氨酸，赖氨酸，或精氨酸取代的氨基酸。其它如式1所示的优选蛋白质是那些第100位的色氨酸被赖氨酸或精氨酸所取代的蛋白质；或者是第138位的色氨酸被赖氨酸或精氨酸所取代的蛋白质。本发明最优选的种包括含有序列鉴定号2-12的种51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProAspAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO2)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProGluAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO3)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuGluGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO4)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProGluAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuAspGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO5)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAspValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProAspAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO6)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110SerLeuProLysThrSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO7)51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110SerLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuLysGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO8)51015MetArgValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIle202530LysThrIleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerVal354045SerSerLysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHis505560ProIleLeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGln65707580GlnIleLeuThrSerMetProSerArgAspValIleGlnIleSerAsh859095AspLeuGluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLys100105110SerCysHisLeuProGluAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeu115120125GlyGlyValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeu130135140SerArgLeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeu145SerProGlyCys(SEQIDNO9)51015MetArgValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIle202530LysThrIleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerVal354045SerSerLysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHis505560ProIleLeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGln65707580GlnIleLeuThrSerMetProSerArgAspValIleGlnIleSerAsn859095AspLeuGluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLys100105110SerCysHisLeuProAspAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeu115120125GlyGlyValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeu130135140SerArgLeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeu145SerProGlyCys(SEQIDNO10)51015MetArgValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIle202530LysThrIleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerVal354045SerSerLysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHis505560ProIleLeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGln65707580GlnIleLeuThrSerMetProserArgAsnValIleGlnIleSerAsn859095AspLeuGluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLys100105110SerCysHisLeuProGluAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeu115120125GlyGlyValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeu130135140SerArgLeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeu145SerProGlyCys(SEQIDNO11)51015MetArgValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIle202530LysThrIleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerVal354045SerSerLysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHis505560ProIleLeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGln65707580GlnIleLeuThrSerMetProSerArgAsnValIleGlnIleSerAsn859095AspLeuGluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLys100105110SerCysHisLeuProAspAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeu115120125GlyGlyValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeu130135140SerArgLeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeu145SerProGlyCys(SEQIDNO12)本发明提供了能够有效治疗肥胖症的生物活性蛋白。申请人发现蛋白质表面的疏水残基被特异取代后会改善其性质。从初级序列中无法预测这些残基。与小鼠和人的这种蛋白相比，这种含有这些取代基的蛋白质发生聚集的倾向降小且有药理活性。本发明使肥胖蛋白在高浓度时更易形式，并能提高它们的药物品质，因为它们与常用的防腐剂有较好的相容性。一般用重组技术制备权利要求中所述的蛋白质。在含有已知序列的DNA中的预先确定位点上产生取代突变的方法是公知的，例如M13引物诱变。编码抗肥胖蛋白DNA的突变不必放在阅读框外，优选的突变不会导致能够产生的mRNA二级结构的互补区域[DeBoer，H.A.等，欧洲专利出版号No.75，444A2，1983年3月30日出版]。本发明的化合物可用重组DNA技术或已知的化学方法来合成，比如液体或固相合成法，或者结合常规液体法用蛋白质片断为启始的半合成法。A、固相法可用固相肽合成法或重组法合成权利要求所述的蛋白质。多肽的，固相化学合成法的原理是现有技术中已知的并且能在普通课本中找到，如Dugas，H.和Penney，C.著的生物有机化学，Springer-Verlag，纽约，(1981)54-59。例如；可用一个PE一应用生物系统433A肽合成仪(Perkin.Elmer-应用生物系统部，Foster市，加利福尼亚)和应用生物系统公司提供的合成循环仪按照固相合成方案合成肽。叔丁氧羰基氨基酸及其它试剂)可从DE-应用生物系统公司和其它化学供应商那儿购得。双偶联方案以顺序叔丁氧羰基化学法用于甲基苄胺树脂来生产碳-末端羰基酰胺。用PAM树脂生产碳-末端酸。用预先形成的羟基苯并三唑酯来偶联精氨酸，谷氨酸，组氨酸，和甲硫氨酸。可使用如下的侧链保护精氨酸，甲苯磺酰基天冬氨酸，环己基或苯基半胱氨酸，4-甲苄基谷氨酸，环己基细氨酸，苄氧基甲基赖氨酸，2-氯苄基羰基甲硫氨酸，亚砜丝氨酸，苯甲基苏氨酸，苯甲基色氨酸，甲酰基酩氨酸，4-溴苄酯基可用溶于二氯甲烷的三氟乙酸(TFA)来去除Boc的保护。在4℃下，用具有含20％哌啶的二甲基甲酰胺的肽基树脂处理60分钟，可去除色氨酸的甲酰基。在25℃下，用具有三氟乙酸/二甲基硫醚/浓盐酸(95/5/1)的肽基树脂处理60分针，可减少甲硫氨酸的氧化。经过以上预处理后，多肽可进一步脱保护并从树脂上解离下来，该树脂加有含10％的间甲苯酚或间甲苯酚/10％的对甲苯硫酚或间甲苯酚/对甲苯硫酚/二甲基醚混合物的无水氟化氢。在0℃或0℃以下，最好在-20℃处理30分钟再接着在0℃以下处理30分钟，使肽的倾链保护基团去除并从树脂上解离下来。去除氟化氢后，用酯洗涤肽/树脂。用冰醋酸提取肽并进行冷冻干燥。用含有以梯度浓度增加的乙腈的0.1％的三氟乙酸通过反相(-18层析完成纯化工作，例如，一种2.2cm×25cmVydacTM层析柱(SeparationsGrop有限公司，Hesperia，(A)。本领域技术人员知道这种固相合成也可用FMOC策略和三氟乙酸/清除剂解离混合物来完成。B.重组体的合成权利要求所述的蛋白质也可用重组法生产。如果需要高回收率，最好选用重组法。重组法生产蛋白质的基本步骤包括a)合成的或半合成的(或从天然DNA中分离的)编码权利要求蛋白质的DNA的构建，b)以某种形式将编码序列整合到表达载体中，使适于蛋白质的单独表达或以融合蛋白质的形式表达，c)用表达载体转化适宜的真核或原核细胞，并且d)回收纯化重组法生产的蛋白质。a.基因构建合成基因在体内或体外转录和翻译会导致蛋白质的产生，这种技术是本领域公知的技术。由于遗传密码子的天然简并性，本领域技术人员会知道可以构建出大量的确定数目的编码权利要求所述蛋白质的DNA序列。在本发明的优选实践中，是由重组DNA技术来合成的。合在因的构建方案是本领域公知技术[BrownE.L，等人，酶学方法，Academic出版社，纽约，NY，68109-151(1997)]。相应于合成的权利要求所述的蛋白质基因的DNA序列可以用传统的DNA合成仪，比如应用生物系统380A和3803型DNA合成仪来合成(PerkinElmer，应用生物系统部，Foster市，加利福尼亚)。在一些实际应用中，可能需要对编码权利要求的蛋白质的序列进行修饰，掺入方便的对蛋白水解酶敏感的裂解位点，例如，在结构蛋白和信号肽间掺入，从而利于从融合蛋白构建物上控制切除信号肽。编码权利要求蛋白质的基因也可用聚合酶链式反应(PCR)来制备。模板可以是cDNA文库(CLONETECH或STRATAGENE提供的商品)或由人脂肪组织中分离的mRNA。这样的方案是本
技术领域：
所公知的。例如，可见，Maniatis，T.，等的分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)。b直接表达或融合蛋白权利要求的蛋白质既可以直接表达制取也可制备含有权利要求蛋白质的融合蛋白质，然后再用酶或化学方法裂解该融合蛋白。已知大量的肽水解酶(例如胰蛋白酶)能够切割多肽的特异性位点或着从肽的氨基或羧基末端消化肽。而且，特定的某些化学物质(如溴化氢)也能切割多肽的特异性位点。本领域技术人员将意识到必须对氨基酸序列(如果用重组法合成或半合成编码序列)进行修饰以掺入位点特异的内部裂解位点。参见，例如，Carter，D.，《蛋白质纯化从分子机制到大规模加工》的第13章，Ladisch，M.，等(编辑)美国化学学会，NashingtonD.C.(1990)。C.载体构建用标准联接技术构建含有所需编码序列和控制序列的合适的质粒。将分离的质粒或DNA片段裂解，剪裁，并按照所需质粒的要求重新连接。为了有效地翻译所需的蛋白质，人们通过用合适的限制性内切酶将构建的合成DNA序列插入任何一种适于多血症的重组DNA表达载体中。设计一种合成编码序列，使之在转录物的任一末端拥有限制性内切酶切割位点，从而便于从表达和扩增和表达质粒中分离或整合到其中。可以方便地用合成接头对分离的cDNA编码序列进行修饰，从而便于用本领域公知技术将该序列掺入到所需克隆载体中。所用的特定内切酶将取决于亲本表达载体的限制性内切酶的裂解类型。选择限制性位点从而使含有控制序列的编码序列有正确的取向，达到权利要求的蛋白质在阅读框内正确阅读和表达。一般来说，含有启动子及从与宿主细胞相匹配的种中提取的控制序列的质粒载体被用在这些宿主中。该载体一般有一个复制位点及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，转化大肠杆菌的pBR322，该质粒是从一大肠杆菌种[Bolivar，F.，等，基因295-113(1997)中提取出来的。质粒pBR322含有氨苄青霉素抗性和四环素抗性基因，因此提供了简便的鉴定转化细胞的方法。pBR322质粒及其它微生物质粒必须也含有或修饰后使之含有启动子及其它在DNA重组技术中常用的控制因素。将所需的编码序列以正确的取向插入表达载体以便从一个启动子和核糖体结合位点转录，启动子和核糖体结合位点在蛋白质表达的宿主细胞中应是有功能的。Belagaje，R.M.，等在1994年4月19日公开的美国专利No.5,304,473中描述了一个质粒是这种表达载体的一个例子，该专利的教导在这里引用作为参考。用限制性酶NdeI和BamHI可以从质粒pRB182中去除右美国专利No.5,304,473中公开的编码A-C-B前胰导素的基因。编码本发明蛋白的基因可插入到NdeI/BamHI限制性片段盒上的质粒主链中。d原核生物的表达一般来说，原核生物用于在构建用于本发明的载体中克隆DNA序列。例如，大肠杆菌K12株294(ATCCNo.31446)特别有用。其它可用的微生物菌株包括大肠杆菌B和大肠杆菌×1776(ATCCNo.31537)。这些例子仅作为描述而不是作为限制。原核生物也用于表达。可用前面提到的菌株，也可用大肠杆菌W3110(原养型的，ATCCNo.27325)，象枯草芽胞杆菌一样的杆菌，或其它肠杆菌科的，如鼠伤寒沙门氏菌和粘质沙雷氏菌，以及各种假单胞菌种。适用于原核生物宿主的启动子包括β-内酰胺酶(载体pG×2907[ATCC39344]含有复制子和β-内酰胺酶基因)及乳糖启动子系统[Chang，A.C.Y.，等.，自然，275617-624(1978)，和Goeddel，D.V.，等.，自然281544-548(1979)]，碱性磷酸酶，色氨酸(Trp)启动子系统(设计载体pATH1[ATCC37695]以便于象在色氨酸启动子控制下的trpE融合蛋白一样的开放阅读框架的表达)以及象tac启动子(由质粒pDR540ATCC-37282分离出的)一样的杂交启动子。但是，其它的核酸序列已公知的有功能的细菌启动子，使本领域技术人员能够用连接物和接头将这些启动子连接到编码该蛋白的DNA上，以提供任何所需的限制性位点。在细菌系统中所用的启动子也应含有能够连接到编码蛋白质的DNA上的SD序列。e真核生物的表达可在真核表达系统中重组生产蛋白质。可从不同的来源获取在哺乳动物细胞中控制转录的优选启动子，举例来说，这样的病毒基因组有多瘤病毒，猴病毒40(SV40)，腺病毒，逆转录病毒，乙肝病毒以及最优选的巨细胞病毒，或者来自异源哺乳动物的启动子，例如β-肌动蛋白蛋动子。可方便地获取的早晚和晚期的SV40病毒的启动子是一种含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段[oFiers，W.，等，自然，273113-120(1978)]。可由质粒pBRSV，ATCC45019获得全部的SV40基因组。人类巨细胞病毒的早期启动子可由质粒pCMBB(ATCC77177)获得。当然，来自于宿主细胞及相关物种的启动子在这里也是有用的。通过在载体中插入一个增强子序列可提高高等真核生物对编码权利要求蛋白的DNA的转录效率。增强子是DNA的顺式作用要素，通常有10～300个碱基对，在启动子上产生作用以增强其转录效率。在内含子[Banerji，J等人，细胞33729-740(1983)]及编码序列本身(Osborne，T、E、等人，分子细胞生物学41293-1305(1984)J内的转录单位的5’端[Laimins，L、A.，等人，美国科学院学报(美国)78464-468(1981)]和3’端[Lusky，M.，等人，分子细胞生物学31108-1122(1983)]，发现增强子具有相当的取向和位点的独立性。目前已知的许多增强子序列来自于哺乳动物的基因[珠蛋白，内瘤病毒，猴病毒40，脑心肮炎，弹性蛋白酶，清蛋白，甲种胎儿球蛋白；和胰导素)。但是，人们一般用来自于真核细胞病毒的启动子。例子包括SV40晚期启动子，巨细胞早期启动增强子，复制启始区下游的多瘤增强子，和腺病毒增强子。在真核生物宿主细胞中(酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人，或来自于其它多细胞组织的带核细胞)使用的表达载体也要含有转录终止所必须的序列，转录的终止会影响mRNA的表达。这些区域作为编码蛋白质的mRAN的非翻译区内的聚腺苷酰化片段而被转录。3’非翻译区也包括转录终止位点。表达载体含有一个选择基因，也叫选择性标记。哺乳动物细胞的合适的选择性标记的例子有二氢叶酸还原酶(DHFR，可从pJOD-10[ATCC68815]的BglII/HindIII限制性片段中得到)，胸苷激酶(单纯疱疹病毒胸苷激酶是在vP-5克隆(ATCC2028)的BamHI片段上)或者是可从pNN414酵母人工染色体载体(ATCC37682)获取的新霉素抗性基因。当这样的选择性标记成功地转化到哺乳动物宿主细胞中后，转染的哺乳动物宿主细胞放在选择性压力下就能存活。有两种广泛使用的不同种类的选择体系。第一种是以细胞代谢和一种在没有补充培养基时不能生长的突变细胞导为基础的。两个例子是CHODHFR-细胞(ATCCCRL-9096)和鼠LTK-细胞[L-MCTK-)ATCCCCL-2.3]。这些细胞在不添加胸苷或次黄嘌呤等营养物质的条件下不能生长。因为这些细胞缺乏对完整的核苷酸合成途径所必须的某些基因，除非在补充培养基中加入这些核苷酸，否则细胞不能存活。另一种可代替补充培养基的方法是将分别缺乏两种基因的细胞中引入一个完整的DHFR或TK基因，从而改变其生长需要。没有用DHFR或TK基因转化的单个细胞在非补充培养基中不能存活。第二类是显性选择，指的是用于任何细胞类型并且不需突变细胞系的选择方案。这种方案一般用药物抑制宿主细胞的生长。那些细胞含有的新基因可以表达具抗药性的蛋白，从而在选择过程中存活下来。例如，这种显性选择使用的药物有新霉素，[SouthernPJ.，等，分子生物遗传学杂志，1327-341(1982)]，霉酚酶[Mulligan，R.C.等，科学2091422-1427(1980)]，或潮霉素[Sugden，B.等人，分子细胞生物学，5410-413(1985)]上边给出的三个例子采用了真核控制下的细菌基因以传递对合适的药物。比如，G418，新霉素(遗传霉素)，xgpt(霉酚素)，或潮霉素的抗药性。一种对真核表达的优选质粒是pRC/CMV。pRC/CMV可以以商品形式从InvitrogenCorporation，SanDiego，CA获得。为了在构建质粒时确保选出正确序列，用连接反应混合物转化大肠杆菌K12株DH5a(ATCC31446)并通过合适的抗药性选出成功的转化子。从转化子中提取质粒，用限制酶分析并且/或用MessingJ.等人在核酸研究，9309-321(1981)中提供的方法测序。可用本发明的表达载体转化宿主细胞并且在经修饰的传统营养培养基中培养，使宿主细胞适于引入启动子，选择转化子或扩增基因。培养条件，如温度，pH值等，同那些前边用于选择宿主细胞进行表达的条件一样，而且对本领域技术人员来说是显而易见的。用上边提到的载体转化细胞的技术是本领域所公知的而且可从这些一般性参考书中找到Maniatis，T.，等人，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)，或分子生物学现代方法及附录。用于在高等真核生物中表达编码权利要求蛋白质载体的优选的适宜宿主细胞包括用SV40(COS-7，ATCCCRL-1651)转化的非洲绿猴肾细胞系；转化的人类初级胚胎肾细胞等[Graham，F.L.等人，基因病毒学杂志3659-72(1977)；Harrison，T.等人，病毒学77319-329(1977)；Graham，F.L.等人，病毒学8610-21(1978)]；幼仓鼠肾细胞[BHK-21(C-13)，ATCCCCL-10；Macpherson，I.，等人，病毒学16147-151(1962)]；中华仓鼠卵巢细胞[CHD-DHFR-CATCCCRL-9096)]，小鼠足细胞[TM4，ATCCCRL-1715；Mather.，J.P.等人，生物生殖23243-252(1980)]；非洲绿猴肾细胞(VERO76，ATCCCRL-1587)；人类颈上皮癌细胞(Hela，ATCCCCL-2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL-34)；buffalo鼠杆细胞(BRL3A，ATCCCRL-1442)；人类二倍体肺细胞(WI-38，ATCCCCL-75)；人类肝细胞癌细胞(HepG2，ATCCHB-8065)；以及鼠乳腺瘤细胞(MMT060562，ATCCCCL51)。f.酵母菌表达除了厚核和乳哺动物细胞外，象酵母菌一样的真核微生物也可用作宿主细胞。尽管有许多其它菌株可供选择。最常用的表达异源蛋白的真核微生物是面包里常用的啤酒糖酵母。例如，质粒YRp7用于在糖酵母属内的表达[ATCC-40053，Sfinchcomb，D.T.，等人，自然28239-43(1979)；Kingsman，A.J.，等人，基因7141-152(1979)；Tschumper，G.，等人，基因10157-166(1980)]。该质粒已含有色氨酸基因，从而为在色氨酸存在时不能生长的酵母突变株提供了选择标记[例如，ATCC44076或PEP4-1，Jones，E.W.，遗传学8523-33(1977)]。用于酵母宿主的合适的启动序列包括3-磷酸甘油酸启动子，可在质粒pAD12BDATCC53231上找到[Patel，A.C.，等，美国专利号No.4,935,350，1990年6月19日公开]或者其它糖酵解酶，比如烯醇化酶，可在质粒pACl(ATCC39532)上找到，从质粒pHcGAPCL(ATCC57090，57091)中提取的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，运动发酵单胞菌[Ingram，L.O.，等，美国专利号No.5,000,000，1991年3月19日公开]，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄糖异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，以及葡萄糖激酶。其它的启动子是诱导型启动子，具有通过生长条件进行转录控制的额外优点，这些启动子区是负责乙醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢相关的降解酶，存在于质粒载体pCL28×hoLHBPV[ATCC39475；Reddy，V.B.，等人，美国专利No.4,840,896，1989年6月20日公开]上的金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和利用麦芽糖和半乳糖的酶，比如，可在质粒pRY121(ATCC37658)上找到的启动子GAL1。用于在酵母中表达的合适的载体和启动子在Hitzeman，R.A.，等人的欧洲专利出版No.73,657A1，1983年3月9日出版中作了进一步的描述。质粒YepsechIlbeta(ATCC67024)上与启动子相联的酵母增强子，比如来自于啤酒糖酵母的UASGal与酵母启动子一起使用是有优势的。下面的实施例进一步说明权利要求蛋白质的制备。不能认为本发明的范围仅包括下面的实施例。实施例1载体构建序列鉴定号13的基因是由从化学合成的寡核苷酸提取的一个～220个碱基对区段和一个～240个碱基对区段装配而成的。(序列鉴定号13)1CATATGAGGGTACCTATCCAAAAAGTACAAGATGACACCAAAACACTGAT51AAAGACAATAGTCACAAGGATAAATGATATCTCACACACACAGTCAGTCT101CATCTAAACAGAAAGTCACAGGCTTGGACTTCATACCTGGGCTGCACCCC151ATACTGACATTGTCTAAAATGGACCAGACACTGGCAGTCTATCAACAGAT201CTTAACAAGTATGCCTTCTAGAAACGTGATACAAATATCTAACGACCTGG251AGAACCTGCGGGATCTGCTGCACGTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCCAC301TTGCCATGGGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGACAGTCTGGGGGGAGTCCT351GGAAGCCTCAGGCTATTCTACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGG401GGTCTCTGCAAGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTGAGCCCCGGGTGCTAA451TAGGATCC220个碱基区段从NdeI位点延伸到编码区内的220位点的XbaI位点，并从第7个重叠寡核苷酸开始装配，该寡核苷酸的长度在34个和83个碱基之间。从XbaI位点延伸到BamHI位点的240碱基对区段也是从第7个重叠寡核苷酸开始装配该寡核苷酸长度在57个碱基和92个碱基之间。为了装配这些片段，分别将7种寡核苷酸以等摩尔量混合，浓度约为每微升1～2微微摩尔。在装配前，按照试剂提供者所限定的条件，用T4DNA激酶在标准激酶缓冲液中将几乎全部的寡核苷酸在片段的5端磷酸化。将反应混合物加热到95℃并用1～2个小时的时间使其缓慢冷却到室温从而保证寡核苷酸的正确退火。于是寡核苷酸相互连接起来并用T4DNA联接酶将其转入适宜的克隆载体中，例如pUC18或pUC19。所用缓冲液及反应条件是酶的供应商所建议的。在使用前，用于220碱基对片段的载体是用NdeI和XbaI消化的，而用于240碱基对片段的载体是用XbaI消化的。连接混合物用来转化大肠杆菌DHIOB细胞(可以商品形式从LifeTechnologies购得，它也是GIBCO/BRL产品的生产商，GrandIsland，NY)，并将转化的细胞在含有100μg/ml氨苄青霉素，X-gal及IPTG的胰蛋白胨平皿。(TY，Dffco，底特律，MI)上涂平板。使隔夜后长出的菌落在含有100μg/ml的氨苄青霉素的液体TY培养基中培养并用于质粒分离及DNA序列分析。保存正确序列以用于完整基因的组装。这可以通过凝胶纯化提取220个碱基对和240个碱基对片段并将两个片段连接起来并转入表达载体中来完成，例如转入A-C-B前胰岛素已被去除且在使用前已用NdeI和BamHI消化的编码序列质粒pRB182。也可选用可被NdeI和BamHI消化的质粒pETC30(Novagen，Madison，WI)，以及可用本申请所描述的并且本
技术领域：
所公知的步骤插入基因的编码本发明蛋白质的所需DNA序列。DNA来源于用本申请描述的和本领域公知的方法组装的合成寡核苷酸。实施例2含有编码所需蛋白质的DNA序列的质粒(NRRL，No.B-21，654)是用类似于实施例1的方法制备的。该质粒被PmlI和Bsu36I消化。这些酶的识别序列分别存在于该蛋白质编码区的第275和第360个核苷酸。克隆载体不含这些识别序列。结果，用限制性内切酶PmlI和Bsu36I消化后可以看到两个片段，一个对应于载体片段，另一个对应于从蛋白质编码序列中释放出来的～85碱基对片段。这一序列被任一编码本发明取代氨基酸的DNA序列所代替。这些DNA序列是由具有互补碱基对且其末端与用PmlI和Bsu36I消化的末端相匹配的两个寡核苷酸通过化学方法合成的。将化学合成的寡核苷酸以等摩尔体积相混和(1～10/微微摩尔/微升)，加热到95℃并缓慢降温至20～25℃使之退火。退火的寡核苷酸用于标准连接反应中。连结反应产物被转化到大肠杆菌DH10B细胞中(GIBCOBRL)且将转化的细胞在含有10μg/ml四环素的TY皿上涂平板(Sigma，St.Louis，MO)。在含有10μg/ml四环素的液体TY培养基中培养隔夜后长出的菌落并且将该菌落用于质粒分离及DNA序列分析。含有正确序列的质粒被保存下来。实施例3表达质粒pHS787(序列鉴定号6的蛋白质)用与实施例1类似的方法制备的载体pHS692(40μg)在37℃下用含有20单位PmlI(新英格兰生物实验室，Beverly，MA)的“新英格兰生物实验室缓冲液1”消化2个小时。将缓冲盐液调整为“新英格兰生物实验室缓冲液3”并加入20单位Bstx.I(新英格兰生物实验室)以启始消化反应，反应需在55℃下进行2小时。消化产物用20单位的碱性磷酸酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)在37℃下处理30分钟。所得的消化产物在1％的琼脂糖凝胶中纯化且用冷挤压法分离4170碱基对片段。寡核苷酸13824(5′-TGAGGCTTCCAGGACTCCCCCCAGACTGTCCAATGTCTCCAGGCCACTGGCGTCTGGCAAGTGGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC-3′(SEQIDNO14)和13825(5′-GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCCACTTGCCAGACGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGACAGTCTGGGGGGAGTCCTGGAAGCC-3′(SEQIDNO15)在37℃下用1x激酶缓冲液，50mMTris-盐酸pH8.0，10mMMgcl2，0.5mMATP，1mMDTT，及5单位T4多核苷酸激酶(GIBCO.BRL)处理30分钟。用PmlI/BstXI使pHS692载体线性化并于16℃下使13824和13825接头在1x激酶缓冲液，0.5mMATP和1单位T4DNA连接酶(GIBCOBRL)中经过夜后连接起来。连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)(NOVAGEN)中并分析在补充有(10μg/ml四环素的TY平板上长出的菌落。分离出质粒DNA并用PE-应用生物系统370DNA测序仪进行测序。将含有所预期的NdeI至BamHI间的400个碱基对片段保存起来并称之为pHS787。实施例4表达质粒(序列鉴定号3的蛋白质)用PmlI和Bsu36I消化质粒pOJ722。5’-序列鉴定号16的序列TGAGGCTTCCAGGACTCCCCCCAGACTGTCCAATGTCTCCAGGCCACTGGCGTCTGGCAAGTGGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC与5’-序列鉴定号17的序列GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCCACTTGCCAGACGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGACAGTCTGGGGGGAGTCCTGGAAGCC退火得到合成DNA片段，将其插入到PmlI和Bsu36I位点之间。连接后，转化并进行质粒分离，通过DNA序列分析鉴定合成片段的序列。用上面提到的载体转化细胞的技术是本领域所公知的技术[Maniatis，T.，等人。分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1988)，Id.，现代分子生物学方法(1989)，及其附录]。在这里作为例子的用于本发明的优选实施例所涉及的大肠杆菌细胞的转化技术是本领域所公知的。转化的大肠杆菌宿主细胞的最佳培养条件取决于大肠杆菌宿主细胞系和所用载体的表达或克隆特性。例如，掺有热诱导启动子区的载体，比如C1857热诱导性λ-噬菌体启动子-操纵子区，从需要的培养条件的温度范围从30℃到40℃，从而诱导蛋白质的合成。本发明的优选方案中是用大肠杆菌K12RV308细胞作为宿主细胞，但是还有大量的细胞系可选用，比如，大肠杆菌K12L201，L687，L693，L507，L640，L641，L695，L814(大肠杆菌B)，但不仅限于此。在表达质粒上存在的抗生素抗性基因的选择压力下，将转化细胞在合适的培养基上涂平板。在适于宿主细胞系的温度下将培养物温育一段时间。在高水平细菌表达系统中表达的蛋白质特异性地在含有高水平过度表达蛋白质的颗粒体或包涵体中聚集[Kreuger，J.K.，等人，在《蛋白质折叠》中，Gierasch，L.M.和King，J.，编辑，美国科学发展学会出版号，89-18S，华盛顿D.C，136-142(1990)]。这些蛋白聚集物必须经溶解以达到进一步纯化并分离到所需蛋白质产物的目的。[Kreuger，J、K.，等，Supra]。用于溶解蛋白的许多技术要用象盐酸胍一样的强变性溶液或/和象尿素一样的弱变性溶液。在溶液中逐渐去除变性剂(通常用透析的方法)可使变性蛋白呈现其天然构象。蛋白质变性和折叠的特定条件是由所述蛋白质和/或特定的蛋白质表达系统所确定的。该蛋白质表达时最好有一个前导序列。本领域普通技术人员会知道有大量的前导序列可选用，但优选的前导序列是Met-R1，其中R1是除脯氨酸外的任何氨基酸或没有氨基酸，这样表达蛋白可用CathepsinC或其它合适的氨肽酶转化为要求保护的蛋白质。优选的R1是精氨酸，天冬氨酸，或略氨酸；蛋白质表达的前导序列最好用Met-Arg前导序列。有趣的是，前导序列对蛋白质的活性和稳定性并没有显著的影响。但是，最好从蛋白质上切除前导序列。因此，式Met-R1-序列鉴定号1的蛋白质可用作生物制剂，最好用作中间体。实施例5带有Met-Arg前导序列的序列鉴定号3的蛋白质在大肠杆菌中进行了表达，并用前述实施例中类似方法使蛋白分离并折叠。蛋白质溶液的pH值被降到2.8。在每毫克蛋白质中加入6-10毫单位的dDAP以切除Met-Arg前导序列(dDAP是由粘菌；Dicteosteliumdescoidium中分离到的二肽氨肽酶的缩写，该菌在Alkinson，P.R.，等人的1996年10月15日公开的美国专利No5,565,330中作了描述)。该转化反应需在室温下进行2-8小时。用高效反向层析监测反应进程。用NaOH将pH值调到8以终止反应。在7-8M尿素存在下的阳离子交换层析中和PBS中的大小排阻层析中进一步纯化des(Met-Arg)蛋白质。用大小排阻层析最后纯化后，蛋白质在PBS中被浓缩到3～3.5mg/mL。要求保护的蛋白的纯化技术是本领域公知的且包括反向层析，亲和层析，离子交换层析和大小排阻层析。要求保护的蛋白质含有两个半胱氨酸残基。因此，可形成一个二硫键使蛋白质得到稳定。本发明包括式(I)蛋白质，其中第96个半脱氨酸与第146个半胱氨酸交联，也包括没有那些没有这样的二硫键的蛋白质。优选的是，第96个半胱氨酸同第146个半胱氨酸以二硫键相连。另外，本发明的蛋白质可以二聚体，三聚体，四聚体及其它多聚体的形式存在，特别在配制时更是如此。这样的多聚体包含在本发明的范围内。本发明提供了一种治疗肥胖症的方法。该包括用1到1000μg/kg的剂量给生物用足量的抗肥胖症蛋白。优选剂量为10到100μg/kg活性化合物。一个成年人的典型每日剂量为0.5到100毫克。在应用这种方法时，式(I)化合物可以每天单剂量或每天多剂量的方式给药。这一治疗方案可能需要用药较长时间。每次用药剂量或用药总量将由医生确定而且取决于这些因素疾病的性质和严重程度，病人的年龄和一般健康状况以及病人对该化合物的耐受程度。本发明进一步提供了含有本发明化合物的药物配方。该蛋白质优选以药物上可接受的盐的形式，可以用于配制治疗肥胖症的预防性和治疗性肠胃外给药的药剂。例如，式(I)化合物可混有常规药物载体及赋型剂。权利要求的蛋白质所构成的组合物含有重量百分比为0.1到95％的活性蛋白，优选的是一种可溶性的形式，更普遍的是含有重量百分比为10～30％的活性蛋白。而且，该蛋白质可以单独给药也可以与其它抗胖肥制剂或用于治疗糖尿病的制剂一同给药。用于静脉内(i.v.)给药时，该蛋白以常用的静脉用液体通过注入的方式给药。例如，可用生理盐水，Ringer’s溶液或5％的葡萄糖溶液这样的溶液。为了制备一种无菌配方的肌肉内注射制剂，优选的是式(I)蛋白的可溶性盐形式，例如，可溶于象无致热源水(蒸馏的)，生理盐水或5％葡萄糖溶液一样的药物稀释剂中的盐酸盐并以这样的制剂给药。可将该化合物制备成一种不溶形式并在给药时悬浮于水基质中或药物上可接受的油基质中，即象油酸一样的长链脂肪酸酯中。为了保证每日多剂量使用，优选的是在配方中加人药物上可接受的防腐剂，比如烷基对羟基苯甲酸酯，特别是甲基对羟基苯甲酸酯，乙基对羟基苯甲酸酯，丙基对羟基苯甲酸酯，或丁基对羟基苯甲酸酯或氯丁醇。值得注意的是，要求保护的蛋白在酚基防腐剂的存在下，比如对甲苯酚或苯酚的存在下也是稳定的。这种在酚基防腐剂的存在下蛋白质的稳定性利于药物的运输并且增强了防腐剂的效果。应在无盐条件下制备配方从而减少配方的离子强度。以下证明了该化合物在体内治疗肥胖症的效力。生物学检测联体生活实验表明周围肥胖组织释放一种蛋白质且该蛋白质能控制正常的和肥胖小鼠的体重增加[Coleman，D.L.，Diabetologia14141-148(1978)]。因此，最相关的生物实验是通过各种给药途径注射实验药物，即用微型泵或小管进行静脉(i.v.)给药，皮下(S.C.)给药，腹膜内(i.p.)给药，然后在不同的时间段内监测食物和水的消耗，体重的增加，血浆化学或激素(葡萄糖，胰岛素，促肾上腺皮质激素，皮质酮，生长激素，T4)。合适的实验动物包括正常鼠(ICR等)及把胖鼠(ob/ob，Avy/a，KK-Ay，tubby，fat)。在本领域，一般认为肥胖症和糖尿病ob/ob鼠模型是肥胖症的表现。作为非特异性效果对照，给相同的动物注射含有或不含有类似组合物的注性试剂，或给被认为缺乏受体的动物(db/db鼠，fa/fa或cp/cp大鼠)注射活性试剂本身，并监测相同的参数。在这些模型中被证实有活性的蛋白质也会在其它哺乳动物中，特别是人体中被证明具有相似的活性。由于认为靶组织是调节食物摄入及脂肪形成的下丘脑，所以将实验药物直接注射入相似模型的脑中，例如，通过侧脑室或第三脑室(i.c.v)注入或直接注射到诸如三辐爪状骨针核，室旁核，或周围穹窿核之类的特异性下丘脑核中。可测定与上面相同的参数，或者监测已知调节摄食或代谢的神经递质的释放(例如NPY，galanin，去甲肾上腺素，多巴胺，β-内啡肽的释放)。实施例6和7中描述的典型蛋白质是根据这里提供的实施例和指导而制备的。Met-Arg标识表明该蛋白质是用加上Met-Arg前导序列后制备并检测的。实施例的蛋白质的氨基酸序列是用质谱分析和/或氨基酸分析确定的。检测时，通过二硫键交联的半胱氨酸残基使蛋白质折叠。表1-3表示该蛋白质治疗ob/ob小鼠胖肥症的能力。将分离的下丘脑组织外周灌注(perifusion)或组织浸泡系统中，在体外完成了类似的研究。在这种情况下，监测神经递质的释放或电生理的变化。实施例6在ob/ob雄生小鼠中对序列鉴定号2，3，和6的蛋白质进行检测将雄性ob/ob小鼠[Harlan有限公司，Blackthorn，英格兰]分组饲养，每组五只，并提供Purina5008食物和随意饮水饲养条件。将这些小鼠饲养在昼夜颠倒的条件下(上午900熄灯，在晚900开灯)。每天早830给小鼠称重。同时确定其对食物和水的消耗量。早晨称重后正好在熄灯前，按如下方法给药。给小鼠每日用药一次，连用4天。</tables>表1-3说明了用本发明有代表性的蛋白进行治疗的效果反应在食物消耗及累积体重变化情况。表1、序列鉴定号2对ob/ob小鼠的治疗效果反应在食物消耗及累积体重变化上的情况表2、序列鉴定号3对ob/ob小鼠的治疗效果反应在食物消耗及累积体重变化上的情况表3、序列鉴定号3对ob/ob小鼠的治疗效果反应在食物消耗及累积体重变化上的情况第1组＝对照(PBS)；第2组＝30μg/天蛋白质；第3组＝100μg/天蛋白质实施例7用动态光散射法(DLS)对聚集进行分析如下说明了本化合物的物理性质。根据所提供的材料，可从两种方法中选择一种来制备用DLS分析的溶液。从大小排阻层析的最后一步的溶液纯化可提供含浓度约为1.5毫克/毫升材料的PBS溶液并且可通过渗滤浓缩到3-5毫克/毫升或用水透析，冻干，且重配到3-5毫克/毫升。第一种方法中，用一个AmiconYM10，25-毫米的膜使约为1.5毫克/毫升的蛋白质溶液在小体积的搅拌杯(10毫升)中浓缩到大于3-5毫克/毫升。这一过程是在较冷的室温条件下完成的(约为5℃)。通过紫外吸收来确定蛋白质的浓缩并用PBS将溶液稀释到3.0毫克/毫升(不含Ca/Mg的10×PBS的10倍水稀释液，GIBCOBRL)。当适宜用冷冻干燥时，可选用第二种方法，在4℃下换3-4次水，对蛋白质溶液透析以排除水份。典型透析膜是Spectra/Por-7透析膜，分子量为2000的截断膜(SpectrumMedicalIndustries，洛杉矶，加利福尼亚)。该材料被浓缩至3到4毫克/毫升并且通常将2毫克的材料在一个5毫升的小管中冷冻干燥。用于DLS分析时，在小管中加水调整浓度到大于3.3毫/毫升或大于5毫克/毫升。一般将几个小管集中起来。通过紫外吸收的最大峰值来确定蛋白质的浓缩(一般280nm)。用水和10x的PBS(不含Ca/Mg，GIBCOBRL)将蛋白质浓缩液稀释到约3或5毫克/毫升从而获得最终的1xPBS浓缩液。用HCl/NaOH将中蛋白质浓度为3.0mg/ml或5mg/ml的1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)的pH值调至7.4且使其通过0.1μmAnotopTM-10滤膜(WhatmanInternational，Ltd.，Maidstone，英格兰)进入一DLS容器中。用带有一个Lexel氩离子激光器的BrookhavenBI900.DLS仪(BrookhavenInsrruments，Holtville，纽约)按90度角以30秒的持续时间每15分钟可测量出平均累积量粒子大小。这里使用了400μm孔的488-nm的滤膜。在37℃培养温度下用的是枯度为0.6915厘泊和折射率为1.333的溶液。用累积量法通过已测定的自动校正基线计算出光称重的平均颗粒大小。表4所示的是37C下pH值为7.4时PBS溶液中不同的抗肥胖蛋白化合物达到平均光称重颗粒大小为50nm时所需的估算时间。由对单体和高度有序的聚积体构成的双结点分布的累积量分析可确定平均光称重的颗粒大小。作为时间的函数，通过绘图范围可估算出达到50nm平均聚积大小所需的时间。在检测时，蛋白质在由二硫键交联的半胱氨酸残基处折叠。所示的人类ob蛋白及序列鉴定号18蛋白作为参考。记号“u.d.”表示不能确定而“n.d.”则表示来确定。序列鉴定号18的蛋白质的序列是51015MetArgValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIle202530LysThrIleValThrArgIleAsnAspIleSerHisThrGlnSerVal354045SerSerLysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHis505560ProIleLeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGln65707580GlnIleLeuThrSerMetProSerArgAspValIleGlnIleSerAsn859095AspLeuGluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLys100105110SerCysHisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeu115120125GlyGlyValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeu130135140SerArgLeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeu145SerProGlyCys(SEQIDNO18)表4、37℃下，pH值为7.4时，磷酸盐缓冲液(PBS)中不同的抗肥胖蛋白平均光测量颗粒大小达到50nm时估算的所需时间(分钟)。这种化合物至少在上述生物测验的一个中是具有活性的而且是抗肥胖制剂。因此，可用它们治疗肥胖症及那些与肥胖症相关的障碍。但是，这些蛋白质并不仅仅用作治疗制剂；本领域技术人员认识到该蛋白质在用作诊断时可用作抗体的产生，而且可作为动物的蛋白质饲料添加剂。而且，该化合物可用于控制哺乳动物的体重以达到美容的目的。通过控制哺乳动物的体重以改善其体形从而达到美容的目的。哺乳动物并不需要肥胖。这种美容方面的用途也构成了本发明的一部分。本发明的原理，优选的操作方案及形式已在前边说明书中作了描述。但是，这是所要保护的发明不能被认为仅限于已公开的特殊形式，因为它们应该被视为说明而不是限制。本领域的那些技术人员在不脱离本发明精神的情况下可以做出改变和更改。权利要求1.一种式(I)的蛋白质51015ValProIleGlnLysValGlnAspAspThrLysThrLeuIleLysThr202530IleValThrArgIleXaaAspIleSerHisThrXaaSerValSerSer354045LysGlnLysValThrGlyLeuAspPheIleProGlyLeuHisProIle505560LeuThrLeuSerLysMetAspGlnThrLeuAlaValTyrGlnGlnIle65707580LeuThrSerMetProSerArgXaaXaaIleGlnIleSerAsnAspLeu859095GluAsnLeuArgAspLeuLeuHisValLeuAlaPheSerLysSerCys100105110HisLeuProTrpAlaSerGlyLeuGluThrLeuAspSerLeuGlyGly115120125ValLeuGluAlaSerGlyTyrSerThrGluValValAlaLeuSerArg130135140LeuGlnGlySerLeuGlnAspMetLeuTrpGlnLeuAspLeuSerPro145GlyCys(SEQIDNO1)(I)其中第22位Xaa是天冬酰胺或丝氨酸；第28位Xaa是谷氨酰胺或无；第72位Xaa是天冬酰胺，谷氨酰氨、谷氨酸，或天冬氨酸；第73位Xaa是缬氨酸或甲硫氨酸；所述蛋白质至少有下述替代中的一个第100位色氨酸被谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，或精氨酸所替代；或者第138位色氨酸被谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，或精氨酸所替代；或者是其在药用上可接受的盐。2.权利要求1所述的蛋白质，其中第96位半胱氨酸与第146位半胱氨酸以二硫键相连结。3.权利要求2所述的蛋白质，其中第22位Xaa是天冬酰胺；第28位Xaa是谷氨酰胺；第72位Xaa是天冬酰胺或天冬氨酸；且第73位Xaa是缬氨酸。4.权利要求3所述的蛋白质，其中第100位色氨酸被谷氨酸或天冬氨酸所替代。5.权利要求2所述的蛋白质，含有选自序列鉴定号2，序列鉴定号3，序列鉴定号4，序列鉴定号5，序列鉴定号6，序列鉴定号7，和序列鉴定号8的序列。6.一种由权利要求1到5中任何一项所要求保护的蛋白质，和一个前导序列所组成的蛋白质，其中该前导序列与蛋白质的N-末端相连，或者是其药用上可接受的盐。7.权利要求6所述的蛋白质，其中前导序列是Met-R1，其中R1无或是除脯氨酸外的任一种氨基酸。8.权利要求7所述的蛋白质，其中前导序列是Met-Arg，Met-Asp，或Met-Tyr。9.权利要求8所述的蛋白质，它具有选自序列鉴定号9，序列鉴定号10，序列鉴定号11，和序列鉴定号12的序列。10.一种药用组合物，含有权利要求1到9的任一种蛋白质，或其药用上可接受的盐作为活性剂，加上一种或多种药用上可接受的稀释剂，载体或赋形剂。11.一种包含编码权利要求1到9中任意一项所要求保护的蛋白的DNA的DNA多核苷酸化合物。12.一种制备权利要求1到9中任一项所要求保护的蛋白质的方法，包括(a)用编码该蛋白质的DNA转化一种宿主细胞；(b)培养转化的宿主细胞从而使该蛋白质进行表达；(c)可选择地，酶切表达蛋白的前导序列；并且(d)回收蛋白质。13.权利要求1到9中任一项所要求保护的蛋白质，或其药用上可接受的盐，用于生产治疗肥胖症或与肥胖相关的疾病的药剂。14.权利要求1到9中任一项所要求保护的蛋白质，或其药用上可接受的盐，用于治疗肥胖症或与肥胖相关的疾病。全文摘要本发明提供了抗肥胖蛋白,给病人用药时调节脂肪组织。因此,这种制剂使病人克服肥胖障碍并能大降低Ⅱ型糖尿病,心血管疾病及癌症的危险从而能过正常人的生活。文档编号A61K38/00GK1194986SQ9712970公开日1998年10月7日申请日期1997年12月18日优先权日1996年12月20日发明者J·M·比尔斯,R·E·钱斯,J·A·霍夫曼,小R·L·米利肯申请人:伊莱利利公司