专利名称：用京尼平对生物医学材料进行化学改性的制作方法
技术领域：
本发明涉及用天然交联试剂--京尼平(genipin)对生物医学材料进行化学改性，例如胶原、脱乙酰壳多糖和血红蛋白，本发明还涉及与京尼平交联或聚合的生物适合性材料，该材料可用于生物植入物、粘合剂、伤口敷料和血液替代品。
参考文献Buchi,G.等人，J.Am.Chem.Soc.89:2776-7(1967).
Chanda,J.等人，Artif.Organs 18(10):752-7(1994).
Chandy,T.等人，Proc.South.Biomed.Eng.Conf.,14th(1995),pub.byIEEE,New York,NY.
Chandy,T.等人，Biomater.,Artif. Cells,Artif. Organs 18(1):1-24(1990).
Chang,T.M.S.等人，Biomater.Artif. Cells Immobilization Biotech.20:159-179(1992).
Fujikawa,S.等人，Biotechnol.Lett.9:697-702(1987).
Hilben,S.L.等人，Med.Prog.Technol.14(3-4):115-63(1988).
Keipert.P.E.等人，Transfusion 29:768-773(1989).
Khor,E.,Biomaterials 18(2):95-105(1997).
Kometani,T.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.57:1185-7(1993).
Li,S.T.,in Biotechnol.Polym.,Gebelein,C.G.ed..,Technomic,Lancaster,PA,1993,pp.66-81.
Oka,H.等人，ACS Symp.Series 593(Modem CountercurrentChromatography),92-106(1995).
Okada,S.等人，JP Kokai No.5-276971(1993).
Oliver,R.F.,in Biocompat.Tissue Analogs,Vol.I,Williams,D.F.,ed..,CRC Press,Boca Raton,FL,1985,pp117-34.
Olsen,R.等人，Proc.Int.Conf.Chitin Chitosan,4th(1988),Skjaak-Braek,G.et al.,eds.,Elsevier,London(1989).
Sabelman,E.E.,in Biocompat.Tissue Analogs,Vol.I,Willams,D.F.,ed..,CRC Press,Boca Raton,FL,1985,pp.27-66.
Stenzel.K.H.等人，Polym.Sci.Techn.8:109-18(1975).
Tanaka,M.等人，JP Kokai No.2-300183(1990).
背景技术：
在生物医学应用中，为达到最佳的效果通常希望进行生物分子的交联。例如，胶原构成生物组织的结构框架，其已被广泛用于制造生物替代品和其他植入结构，如血管移植物，胶原在此是细胞过滤和增殖的最佳介质。胶原片还被用作伤口敷料，其优点是对水蒸气有高度的透过性，并快速愈合伤口。未交联胶原的缺点包括抗拉强度低，而且易于被胶原酶降解。胶原性组织的固定或交联可增加机械强度，降低被胶原酶降解，并降低抗原性和免疫原性。
脱乙酰壳多糖是壳多糖的脱乙酰化衍生物，其包含游离氨基，该氨基也可被例如戊二醛交联(Jameela)，并已被用于或者被提议用于植入的药物递送装置、皮肤替代品、伤口敷料、和其他生物材料。当将脱乙酰壳多糖涂敷在其他植入材料上时，其显示出降低钙化的有益性质(Chanda)。
已使用各种交联剂对含胺的生物医学材料进行化学改性。最常见的是合成化学品，如甲醛、戊二醛、二醛淀粉、乙醇醛、氨基氰、二酰亚胺、和二异氰酸酯。其中，戊二醛快速与蛋白质反应，是最常使用者。
交联胶原所遇到的问题是在植入时会钙化，这导致植入物周围僵硬，最终降解，并重新吸收入周围组织中，以及与交联剂的毒性反应。已知戊二醛具有过敏原性，其导致职业性皮炎，而且在高于10-25ppm、在组织培养物中低至3ppm时，具有细胞毒性。
交联生物材料的另一个应用是作为血液替代品。无细胞的血红蛋白--血液替代品可用于无抗原血液输注，但在循环期间易于从四聚体转化为二聚体。高氧亲和性和短的半衰期是这种材料的另外限制。这些问题可通过用交联剂化学改性血红蛋白来克服(参见例如Chang,Keipert)。增加血红蛋白在循环中的半衰期并降低其氧亲和性可通过分子间和分子内交联来实现。但是，已发现用戊二醛进行交联可导致在血红蛋白聚合期间形成二聚体。
因此，希望提供一种适合于生物医学应用的交联剂，该交联剂具有低毒性，形成稳定的、生物适合性的交联产品，并在植入时保持其稳定性。
发明概述在一个方面中，本发明提供生物适合性的植入物或者伤口敷料。该植入物或敷料是一种包括生物适合性的、经交联的、含胺的生物分子的材料，所述生物分子选自于脱乙酰壳多糖或结缔组织，其中，该生物分子与京尼平交联。如果生物分子是结缔组织蛋白，则该蛋白优选是胶原。本发明还提供生物适合性的粘合剂，其包括生物适合性的、经交联的明胶，该明胶得自于胶原性物质，其中，所述明胶与京尼平交联。
在另一个方面中，本发明提供制造生物适合性的植入物或伤口敷料的方法。该方法包括以下步骤将包括含胺之生物分子的材料制成适合于植入物或敷料的结构，所述生物分子选自于脱乙酰壳多糖或结缔组织蛋白，然后用京尼平交联上述材料。如果所述材料包括结缔组织蛋白，则该蛋白优选是胶原。
在另一个方面中，本发明提供适合用于血液替代品的组合物，该组合物包括与京尼平交联的血红蛋白，还提供制备所述组合物的方法，其是用一定量的京尼平处理血红蛋白，以有效地交联血红蛋白。优选的是，经交联的血红蛋白具有大于1至小于约9的平均聚合度。
附图简述
图1A-H是对未交联或新组织(1A-B)、以及与戊二醛(GA)(1C-D)、环氧化物(EX-810)(1E-F)、和京尼平(1G-H)交联的组织分别在胶原酶降解之前和之后进行显微照相(×200)得到的计算机生成的图象；图2和3显示了图1之测试样品分别在胶原酶或链霉蛋白酶降解之前或之后的变性温度；图4显示了新的、戊二醛固定的、环氧化物固定的、和京尼平固定的组织在胶原酶降解之前和之后的抗拉强度；图5显示了在发育鼠模型中新的、戊二醛固定的(GA)、环氧化物固定的(EX-810)、和京尼平固定的组织在皮下植入之前(t=0)和之后(t=1周；t=4周)的变性温度；图6显示了图5之样品在植入之前和之后的抗拉强度；图7显示了图5之样品在植入之前和之后的钙含量；图8A-8D是对在(A)对照培养基和添加有(B)1ppm戊二醛、(C)5ppm环氧化物和(D)1000ppm京尼平的培养基中培养的细胞进行显微照相(×100)得到的计算机生成的图象；图9A-9H是对植入前的(A)新组织、(B)戊二醛固定的组织、(C)环氧化物固定的组织、和(D)京尼平固定的组织，(E)植入后1周时回收的新组织，植入后12周时回收的(F)戊二醛固定的组织、(G)环氧化物固定的组织和(H)京尼平固定的组织进行扫描电子显微照相(×1500)得到的计算机生成的图象；
图10A-C是对植入后12周时回收并用苏木紫和曙红染色的(A)戊二醛固定的组织、(B)环氧化物固定的组织、(C)京尼平固定的组织进行显微照相(×200)得到的计算机生成的图象；和图11显示了聚合和未聚合的血红蛋白的HPLC色谱图。
发明详述Ⅰ、定义除非另有说明，以下术语具有以下意思。
“京尼平”是指如结构式Ⅰ所示的天然化合物以及其立体异构体和它们的混合物。
“胶原性材料”或“胶原性物质”是指大部分由胶原构成的材料，例如结缔组织，其适合于制造生物替代品、植入物、移植物、或伤口敷料。
“生物植入物”是指插入在或者移植在身体组织上并保持一段时间的生物医学装置，如持续释放药物装置、血管或皮肤移植物、或者替代品。
“交联血红蛋白”是指包含分子内交联的血红蛋白而且交联存在于四聚体分子的单个链之间的血红蛋白，和/或四聚体分子连接在一起的分子间交联血红蛋白或多聚血红蛋白。
“聚合度”是指在交联血红蛋白中连接在一起的血红蛋白分子的数量。例如，Hb2是指通过分子间交联连接在一起的两个血红蛋白单元；它们也可是分子内交联的。Ⅱ、京尼平的制备和性质京尼平具有以下结构Ⅰ，其是存在于果实(Gardenia jasmindides Ellis)中的环烯醚萜苷。其可从结构Ⅱ的母化合物京尼平苷得到，后者可从例如在Oka、Okada、或Kometani描述的天然物质中分离出来。京尼平是京尼平苷的糖苷配基，其可通过氧化、还原和水解(Tanaka)或者通过酶解(Fujikawa)由京尼平苷制备。另外，外消旋京尼平可合成制备，例如根据Buchi的方法。
虽然结构Ⅰ显示了京尼平的天然构型，但是根据本发明，京尼平的任何立体异构体或者京尼平之立体异构体的混合物也可用作交联剂。
京尼平具有低的急性毒性，在鼠中的LD50i.v.是382mg/k。因此，比戊二醛和许多其他常用合成交联剂的毒性低得多。
如以下所述，京尼平对于体内生物医学应用的生物材料处理是一种有效的交联剂，如替代品和其他植入物、伤口敷料、和血液替代品。Ⅲ、用京尼平交联生物结构化合物交联的生物化合物优选包括结缔组织蛋白如胶原和弹性蛋白，或者从这些蛋白得到的材料，如明胶，其是通过水解胶原或胶原性组织得到的。其他含胺的结构化合物如脱乙酰壳多糖也可用京尼平处理，来制备生物适合性的交联材料。
用或不用交联将此等材料、特别是胶原制成医疗装置如生物替代品、皮肤和血管移植物、以及伤口敷料的方法在现有技术中是众所周知的。例如参见“Prosthetic and Biomedical Devices”,Kirk-OthmerEncyclopedia of Chemical Science&Technology,John Wiley&Sons,1995中的讨论，其他参考文献见Hilbert、Khor、Li、Oliver、Sabelman、和Stenzel。脱乙酰壳多糖在此等应用中的参考文献例如参见Chandy(1990,1995)、Jameela、和Olsen。
提供阻断血流和支持血液凝固的生物适合性的表面，京尼平交联的胶原性组织由此也可用于体内稳态。通过用一定量的京尼平交联由水解胶原或者水解处理含胶原组织而得到的明胶，可制备生物适合性的粘合剂，所述量应有效地产生所希望的粘性。
交联胶原性组织时，如实施例1所述，对于6×6cm的组织片，京尼平的有效量约为200ml的5％溶液。所用交联剂的量取决于所希望的交联密度。类似地，交联明胶或脱乙酰壳多糖时，可用常规的实验来测定对于最终产品之希望性质来说是合适的试剂量。
如以下所述，京尼平固定的胶原性组织对于胶原酶或链霉蛋白酶具有高度的耐受性，而且在皮下植入物实验中证实了它们的生物适合性。以下部分描述了与京尼平交联的胶原组织样品的性质，包括酶耐受性、机械性质的保持、以及低毒性，并与用其他常规试剂交联的样品进行比较。
A、对降解酶的稳定性为确定用各种交联剂处理的胶原性纤维的稳定性，如以下实施例1所述，用所述试剂处理组织样品，经受胶原酶或链霉蛋白酶的降解作用，然后检查。
图1A-H是对未交联或新组织(1A-B)、以及戊二醛固定的(1C-D)、环氧化物固定的(1E-F)、和京尼平固定的(1G-H)的组织分别在胶原酶降解之前和之后进行显微照相得到的计算机生成的图象。降解后，新组织崩解成碎片(图1B)。相反的是，戊二醛固定的和京尼平固定的组织的胶原纤维结构在胶原酶降解后仍保持不变(图1D和1H)，而环氧化物固定的组织的胶原纤维仅观察到轻微的崩解(图1F)。
用Perkin Elmer差示扫描热量计(Model DSC7,Norwalk,Connecticut,USA)测量各测试样品的变性温度。图2和3给出了上述测试样品分别在胶原酶和链霉蛋白酶降解之前和之后的变性温度。由于新(未交联)组织样品已完全崩解，没有测定其在胶原酶或链霉蛋白酶降解之后的变性温度。如图中所示，京尼平固定的组织的变性温度下降(＜2％)低于戊二醛固定的和环氧化物固定的组织的下降(3-10％)。
京尼平固定的组织还表现出优异的抗拉强度保持。在体外降解作用之前和之后从各测试样品中切取组织条用于抗拉强度测定。使用InstronUniversal Testing Machine(Model 4302)在50mm/min的恒定速度下通过单轴测量来确定组织条的应力-应变曲线。图4显示了新的、戊二醛固定的、环氧化物固定的、或者京尼平固定的组织在胶原酶降解之前和之后的拉伸应力测量结果。降解后，新组织的拉伸应力记录为零，这也是因为该样品完全崩解。如图所示，京尼平固定的组织的拉伸应力下降最小(＜1％)，明显低于戊二醛固定的和环氧化物固定的组织的下降(分别为31％和25％)。
上述结果表明，京尼平固定的胶原性组织具有与戊二醛固定的组织类似的热稳定性和抗拉强度，而且它们在用胶原降解酶处理时仍保持抗拉强度和热稳定性，明显大于戊二醛和环氧化物固定的组织。
B、皮下植入时的稳定性1、短期研究(4周)使用发育鼠模型进行皮下植入研究，以评估在用京尼平交联的植入的心包组织中的稳定性(变性温度和抗拉强度的变化)和钙沉积浓度。还测试了新(未交联)的、戊二醛固定的、和环氧化物固定的组织。
如实施例2所述制备组织样品。在6周龄的雄性Wistar鼠中进行皮下植入研究，植入物在植入后1周和4周时回收。
植入后1周时，新样品通常薄于经交联的样品，并在4周时完全被降解。在第4周时，在京尼平固定的样品中观察到宿主组织薄层，但在戊二醛或环氧化物固定的样品中没有观察到。根据这个标准，京尼平固定的样品是最具有生物适合性的。
如以上所述，测定样品在植入之前和之后的变性温度和抗拉强度。如图5所示，京尼平固定的样品和戊二醛固定的样品的变性温度是相似的，而且明显高于环氧化物固定的样品的变性温度。这说明在京尼平固定的和戊二醛固定的组织中有更高的交联密度。在所有情况下，在植入后的四周时几乎都没有观察到变性温度下降。
如图6所示，京尼平固定的样品的抗拉强度在所有阶段都优于环氧化物固定的样品。植入前和植入后1周时，京尼平固定的样品和戊二醛固定的样品的抗拉强度是相似的。但是在植入后4周时，京尼平固定的样品的抗拉强度大大高于戊二醛固定的样品。
图7显示了在植入期间沉积的钙量，其是通过实施例3中所述的原子吸收光谱法测定的。如该图所示，对于京尼平和环氧化物固定的样品，钙沉积是非常类似的，而且在1周时，低于未交联的样品。在1周时，戊二醛固定的样品中的钙沉积量大大高于另外两个固定样品，但在第4周时类似。
以上结果表明，与京尼平交联的胶原性组织具有与戊二醛交联的组织类似或更优异的稳定性和生物适合性，而无戊二醛和相关化合物的毒性。
2、长期研究(12周)如上述短期研究所述，将新(未交联)的、戊二醛固定的、环氧化物固定的、和京尼平固定的猪心包无菌样品皮下植入在麻醉情况下的发育鼠模型(6周龄雄性Wistar)中。每个研究组中取一个样品，将四个样品植入在动物模型的上背部；再从每个研究组中取一个样品，将这四个样品按相反顺序植入在下背部。各测试样品约为0.5cm宽、2cm高。各排中的测试样品次序按动物轮换。植入的样品在手术后的第1周(n=4)、4周(n=4)和12周(n=8)时回收。
在回收时，对各回收的样品进行检测和照相。注意到，经回收的新组织明显薄于戊二醛、环氧化物和京尼平固定的对应样品。在手术后的第4周时，发现8个植入的新组织样品中有6个完全降解，而其他两个新样品被宿主组织吸收。相反的是，戊二醛、环氧化物和京尼平固定的组织在整个研究期间都保持完整。
用扫描电子显微镜(SEM)检查各回收样品的表面形态。用于SEM检查的样品首先用2％戊二醛之0.1M二甲胂酸钠溶液(pH7.4)固定，然后用1％四氧化锇进行后固定。接着，样品在一系列浓度的乙醇溶液中脱水，用二氧化碳进行临界点干燥，最后用金膜溅射。用Hitachi ModelS-800扫描电子显微镜进行检查。
图9A和9E显示了对植入前和手术后1周时回收的新组织进行SEM显微照相得到的计算机生成图象。如图9E所示，在手术后1周时回收的新组织已完全崩解。与植入前的对应物(分别为图9B和9D)相比，在手术后12周时回收的戊二醛和京尼平固定的组织略有降解。环氧化物固定的组织(图9G对9C)的降解程度高于戊二醛和京尼平固定的对应物。
用于光学显微镜的样品在10％磷酸盐缓冲的甲醛中固定至少3天，然后用于病理组织学检查。在病理组织学检查中，经固定的样品嵌入在石蜡中，切片厚度为5μm，然后用苏木紫和曙红(H&E)染色。各测试样品的染色切面用光学显微镜(Nikon Microphoto-FXA)检查组织炎性反应，并用100 ASA Kodachrome胶片照相。
对在手术后12周时回收的经戊二醛、环氧化物、和京尼平固定的组织进行显微照相，并由此得到计算机生成的图象，见图10(A-C)所示。应注意到，由于完全降解，没有对此时回收的新组织进行显微照相。京尼平固定的组织的炎性反应明显低于戊二醛和环氧化物固定的对应物，这表明京尼平固定的组织的优异生物适合性，因为其明显更低的毒性(见以下部分C)。
如实施例3所述，用原子吸收分析法测定各回收样品的钙含量。新组织、戊二醛固定的、环氧化物固定的、和京尼平固定的组织在植入前以及在手术后第1、4、和12周回收时的钙含量数据见表1，其以μg钙每mg干组织重量表示。应注意的是，在手术后第4和12周时回收的新(未交联)组织没有得到数据，这是因为它们完全降解。如该表所示，在该研究中，在植入前的样品与各种植入时间时回收的样品之间没有观察到钙含量的显著差异。
表1植入前和不同植入时间时的钙含量(μg钙/mg干组织重量)
数据以平均值±标准偏差表示*N/A由于组织完全降解没有得到数据C、细胞毒性研究用于该研究中的细胞是从正常新生儿的包皮得到的人包皮成纤维细胞。将细胞在3.5cm直径的petri培养皿(105细胞每个皿)中于添加有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories,Logan,UT,USA)的Dulbecco改进eagle培养基(DMEM,Gibco430-2800 EG,GrandIsland,NY,USA)中培养。细胞培养物保持在经加湿的培养箱中24小时，该培养箱的温度为37℃，并有在空气中的10％CO2。
用在DMEM中的京尼平(Challenge Bioproducts Co.,Taichung,Taiwan)替代培养基，其浓度为0(空白)、10、100、或1000ppm(μg/ml)。还测试戊二醛和环氧化物(乙二醇二缩水甘油醚，DenacolEX-810,Nagase Chemicals,Ltd.,Osaka,Japan)，浓度为1、5、或10ppm。
培养24小时后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，用没有任何测试交联剂的新DMEM培养基替换培养基。最后，另外培养细胞两周。在此期间，更换一次培养基。
图8A显示了对经上述培养但没有任何测试交联剂的人成纤维细胞的对照培养物进行显微照相得到的计算机生成的图象。如该图所示，在petri培养皿中观察到的细胞都是融合的。图8B-8D显示了对在添加有不同交联剂的培养基中培养的人成纤维细胞进行显微照相得到的计算机生成的图象，各交联剂的浓度如下1ppm戊二醛(8B)、5ppm环氧化物(8C)、和1000ppm京尼平(8D)。
在添加有戊二醛的培养基(图8B)中的细胞密度是最低的，在经环氧化物处理的培养基中略高一些。这两个都低于对照培养基中的。相反的是，虽然京尼平的使用浓度更高，但在添加有京尼平的培养基(图8D)中见到的细胞密度明显高于添加有戊二醛或环氧化物的培养基中的。该结果表明京尼平的细胞毒性明显低于戊二醛和环氧化物的毒性。Ⅳ、血红蛋白的交联该部分所述的结果表明，与京尼平聚合的血红蛋白具有稳定的四聚体结构，而且分子量分布在长期储存时仍保持不变。
在交联用作血液替代品的血红蛋白时，希望得到由2-9个单元构成的血红蛋白寡聚物，同时使过度聚合的血红蛋白(＞9个单元和＞500KDa)及高铁血红蛋白的形成最小化。在本发明中，所进行的研究是确定几个因素对用京尼平处理血红蛋白得到的产品分布的影响。如以下所述，这些因素包括(a)反应时间、(b)血红蛋白浓度、(c)京尼平/血红蛋白摩尔比、(d)反应温度、(e)缓冲液pH、和(f)添加作为淬灭剂的赖氨酸。
对于各反应，先用CO气体清洗血红蛋白，以降低反应期间高铁血红蛋白的形成。如以下实施例3所述，用HPLC分析产品分布。
A、反应时间在pH7.0和4℃下于2-48小时内观察产品分布，其中，血红蛋白浓度为14g/dl，京尼平浓度为15mM。如表2所示，在12小时时，Hb1(未聚合的血红蛋白)的浓度降低至60.15％，而高铁血红蛋白仅从14.98％增加至18.81％。在超过15小时时，观察到过度聚合的血红蛋白(＞500KDa)，所希望的交联血红蛋白增加最少，而高铁血红蛋白却快速增加。因此，在此条件下最佳反应时间是约12-15小时。
表2在不同反应时间时的分子量分布和高铁血红蛋白的形成
*Hbn交联的血红蛋白单元数量*Met Hb高铁血红蛋白*初始高铁血红蛋白百分数是15.69％B、血红蛋白浓度京尼平浓度、pH、和反应温度与上述部分A相同。发现10-14g/dl范围内的血红蛋白浓度对于聚合反应是合适的。如果浓度低于10g/dl，所希望的交联血红蛋白(＜500KDa)随血红蛋白的浓度增加而增加，但反应速率较慢。如果浓度高于14g/dl，如表3所示，过度聚合的血红蛋白和高铁血红蛋白都增加。
表3不同血红蛋白浓度时分子量分布和高铁血红蛋白的形成
*Hbn交联的血红蛋白单元数量*Met Hb高铁血红蛋白*初始高铁血红蛋白百分数是10.08
C、京尼平/血红蛋白比血红蛋白浓度(14g/dl)、温度或pH不变。发现京尼平/血红蛋白的最佳摩尔比在6/1-9/1范围内。在低于6/1的摩尔比时，反应速率非常低，而且聚合血红蛋白的产量低。如表4所示，高于9/1的摩尔比没有增加所希望的聚合血红蛋白，但也没有产生更高浓度的高铁血红蛋白和过度聚合的血红蛋白。
表4不同京尼平/血红蛋白摩尔比时分子量分布和高铁血红蛋白的形成
*Hb血红蛋白*Hbn交联的血红蛋白单元数量*Met Hb高铁血红蛋白*初始高铁血红蛋白百分数是22.18％D、缓冲液pH对于此系列反应，温度为4℃，反应时间为15小时，血红蛋白和京尼平的浓度分别为10g/dl和15mM(摩尔比7/1)。使用磷酸氢钾(0.05M,pH4.0)、磷酸钠(0.001M,pH9.0)、硼酸钠(0.01M,pH9.0)、和碳酸钠/碳酸氢钠(0.19M/0.18M)的水溶液分别制备pH为5.5、7.5、和9.5的缓冲液。如表5所示，中性和碱性pH对于血红蛋白的聚合是有利的。
表5不同pH值时分子量分布和高铁血红蛋白的形成
Hbn交联的血红蛋白单元数量*Met Hb高铁血红蛋白*初始血红蛋白百分数是17.12％E、反应温度对于该系列反应，血红蛋白和京尼平的浓度都不变，将pH调节为7.0。使用4-40℃范围内的温度，结果见表6。如该表所示，更高的温度诱发更高的血红蛋白聚合度。在30-40℃时，60-65％的未聚合血红蛋白在2小时内反应。但是，更高的温度也增加了过度聚合之血红蛋白和高铁血红蛋白以及细菌产物的形成。合适的温度在4-20℃之间。
表6不同反应温度时分子量分布和高铁血红蛋白的形成
Hbn交联的血红蛋白单元数量*Met Hb高铁血红蛋白*初始高铁血红蛋白百分数是10.08％F、添加作为终止剂的赖氨酸赖氨酸通常用作蛋白交联反应的终止剂。同时进行两个聚合反应，并在14.5小时时向其中一个添加赖氨酸。血红蛋白和京尼平的浓度分别为14g/dl和15mM，反应时间为15小时，反应温度保持在4℃。如表7所示，赖氨酸可有效地使聚合反应骤停，并降低过度聚合之血红蛋白的浓度。
表7赖氨酸淬灭剂对血红蛋白聚合反应中分子量分布和高铁血红蛋白形成的影响
*Hbn交联的血红蛋白单元数量*Met Hb高铁血红蛋白*初始高铁血红蛋白百分数是12.08％实施例以下实施例是用于说明而不限制本发明。实施例1交联胶原性组织对降解酶的稳定性使用从屠宰场得到的新鲜猪心包作为原料。取出后立即将组织样品转移至冷盐水中，并用于固定。用磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)缓冲5％京尼平溶液，用该溶液交联生物组织。在37℃下进行处理3天。固定后，用去离子水冲洗生物组织60分钟。随后在37℃下用70％乙醇溶液消毒已固定的组织7天。用戊二醛固定的和环氧化物固定的组织作为对照。固定时用0.625％戊二醛溶液。环氧试剂为4％的乙二醇二缩水甘油醚(DenacolEX-810,Nagase Chemicals,Ltd.,Osaka,Japan)溶液。
用光学显微镜检查各测试样品在胶原酶或链酶蛋白酶降解之前和之后的胶原纤维结构变化。测试样品固定在10％甲醛溶液中，并用于组织学检查。在组织学检查中，在降解之前和之后用苏木紫和曙红染色各测试样品的切面。
用Perkin Elmer差示扫描热量计(Model DSC7,Norwalk,Connecticut,USA)测定各测试样品的变性温度。结果描述如上，并示于图2和3中。从体外降解之前和之后的各测试样品中切取组织条，用于测定抗拉强度。使用Instron Universal Testing Machine(Model4302)在50mm/min的恒定速度下通过单轴测量来测定组织条的应力-应变曲线。结果描述如上，并示于图4中。实施例2皮下植入研究使用如上所述的新鲜猪心包作为原料。冲洗样品，并进行清理以除去血管和脂肪，然后用京尼平(5％溶液)、环氧化物(4％的DenacolEX-810,Nagase Chemicals,Ltd.,Osaka,Japan)或戊二醛(0.625％溶液)在37℃下固定3天。对于6×6cm猪心包，各情况所用的溶液的量约为200ml。环氧化物溶液用0.21M碳酸钠/0.02M碳酸氢钠(pH10.5)缓冲，而戊二醛和京尼平溶液用0.01M磷酸盐缓冲盐水(pH7.4,SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)缓冲。经固定的心包用一系列的乙醇溶液消毒约5小时，所述乙醇溶液的浓度逐渐增加(20％-75％)，最后用无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗数次。
在一只处于麻醉下的6周龄雄性Wistar鼠身上进行皮下植入研究。在植入后第1和4周时回收植入物。如实施例1所述测定变性温度和抗拉强度，并用原子吸收光谱测定钙浓度。结果如以上所述，并示于图5-7中。实施例3植入的组织样品中钙含量的测定冻干经回收的组织样品24小时，然后称重。将冻干的样品浸没在6N盐酸溶液(约3mg冻干组织/3ml 6N盐酸)中，接着在微波水解系统(MDS-2000,CEM Co.,Matthews,NC,USA)中水解45分钟。最后，用5％氯化镧之3N盐酸溶液稀释经水解的样品。用原子吸收光谱仪(Mode1 AA-100,Perkin Elmer Inc.,Norwalk,Conn.,USA)测定各测试样品中的钙含量。实施例4血红蛋白的聚合在4℃下用一氧化碳清洗血红蛋白溶液1小时，然后在该溶液中添加京尼平。反应时间、浓度、温度和pH如上所述进行变化。使用高效色谱在TSK3000SW硅胶过滤柱上(流动相溶剂0.1M磷酸盐缓冲液，0.3M氯化钠，pH=7；流速=0.8ml/min；检测器在410nm和280nm)分析分子量分布(交联度)和高铁血红蛋白的百分数。典型曲线见图11。
权利要求
1.一种生物适合性的植入物或伤口敷料，其包括生物适合性的、交联的、含胺的生物分子，所述生物分子选自于脱乙酰壳多糖或结缔组织蛋白，其中，所述生物分子与京尼平交联。
2.如权利要求1所述的植入物或伤口敷料，其中，所述生物分子是结缔组织蛋白。
3.如权利要求2所述的植入物或伤口敷料，其中，所述结缔组织蛋白是胶原。
4.如权利要求1所述的植入物或伤口敷料，其中，所述生物分子是脱乙酰壳多糖。
5.一种生物适合性的粘合剂，其包括生物适合性的、交联的、得自于胶原性物质的明胶，其中，所述明胶与京尼平交联。
6.一种制备生物适合性的植入物或伤口敷料的方法，其包括将包含含胺之生物分子的材料制成适合于所述植入物或敷料的结构，所述生物分子选自于脱乙酰壳多糖或结缔组织蛋白，然后使所述材料与京尼平交联。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述材料包括结缔组织蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述结缔组织蛋白是胶原。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述材料包括脱乙酰壳多糖。
10.一种适用于血液替代品的组合物，其包括与京尼平交联的血红蛋白。
11.如权利要求10所述的组合物，其中，所述交联血红蛋白具有大于1至小于约9的平均聚合度。
12.一种制备交联血红蛋白的方法，其包括用一定量的京尼平处理血红蛋白，所述量应有效地交联所述血红蛋白。
13.如权利要求12所述的方法，其中，用一定量的京尼平处理所述血红蛋白，所述量应有效地使所述血红蛋白的平均聚合度在大于1至小于约9之间。
全文摘要
本发明描述了生物适合性的、经交联的材料,其适合用作植入物、伤口敷料、和血液替代品。该材料是如下制备的:用一种天然交联剂——京尼平交联生物物质,如胶原、脱乙酰壳多糖、或血红蛋白。该交联剂的毒性比常规使用的试剂的毒性低得多,而且所述经交联的产品具有良好的热和机械稳定性以及生物适合性。
文档编号A61L27/36GK1236324SQ97199454
公开日1999年11月24日 申请日期1997年11月4日 优先权日1996年11月5日
发明者李昭仁, 林景宽, 宋信文 申请人:嘉年生化产品有限公司