专利名称：新的诺文葛耳缩合反应产物,其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明系有关新的诺文葛耳缩合反应产物，其制备方法及其应用。尤其是药物学和分析方面的应用。进而阐明了诺文葛耳缩合反应产物与生物分子的结合物。
Feigl(Z.Anal.Chem,74(1928),380-386)(分析化学杂志，(1928)卷74,380-386页)曾发表论文说明可以用对-二甲氨基亚苄基绕丹宁检验银。另外，Escobar Godoy与Guiraum Perez曾描述(化验师(Analyst)111(1986)1297-1299)将吡哆醛衍生物即(Z)亚吡哆基(pyridoxyliden)绕丹宁用于银的光谱定量分析。
本发明的目的在于制备新的化合物，尤其是制药和分析方面有用途的新化合物。为此目的合成了化合物(3):(Z)-5’-O-膦酰基-亚吡哆基绕丹宁。该化合物乃是维生素B6辅酶吡哆醛-5’-磷酸酯(1)的衍生物。化合物(3)的制备是通过在诺文葛耳缩合反应中将化合物(1)与合成的杂环化合物绕丹宁(2)相互反应来进行的(参见Kesel等，四面体通讯(Tetrahedron)52(18,11.1996),14787-14800)。
上述化合物(3)可命名为(Z)-5-[[5-羟基-6-甲基-3-[(膦酰氧基)-甲基]-4-吡啶基]亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。化合物(3)中绕丹宁部分能与生物分子(例如单链核酸)结合。带电荷的磷酸根赋予良好的水溶性。
化合物(3)经(Z/E)-立体异构化产生(E)-同分异构体(4)。
这种顺/反-结构重排可经紫外线(波长为254纳米和/或366纳米)照射而产生。
在偶极的非质子传递溶剂，例如吡啶或二甲亚砜中，本来是黄色的化合物(3)可作为红色的3-吡啶醇盐(5)以游离酸的形式存在。
吡哆醛-5’-磷酸酯绕丹宁(Z)-5’-O-膦酰基-亚吡哆基绕丹宁化合物(3)为黄色而其单钠盐是深红色，后一化合物的结构可经伦琴射线分析阐明。化合物(3)的钠盐以半十七水合物(8.5水合物)的形式结晶，其存在形式为(Z)-立体异构体(6)。化合物(3)的单钠盐，即化合物(6)经紫外线照射同样产生顺/反结构重排而产生红色的(E)-立体异构体(7)。
化合物(3)的衍生物可通过在OH基团上与C12-C18脂肪酸酰氯反应而获得。
本发明还进一步涉及通式(8)的化合物。
其中X1,X2与X3分别独立地选自O,S与NR5；Y是O或S；Z是CR5或N；R1,R2,R3,R4,R5分别独立地选自任意取代基；R6选自任选地取代的烃基和O,n是零或是1，及其盐类例如碱金属盐，碱土金属盐，或是铵盐，水合物或者立体异构体，但条件是该化合物不应是亚吡哆基绕丹宁。
在结构式为(8)的化合物中X1优选为O。X2优选为NR5，其中R5为氢或者是C1-C4的烷基，尤其优选氢。X3优选是S,Y优选是S,E优选是CR5,其中R5为氢或者是C1-C4烷基，尤其优选氢。
取代基R1至R4本身可以是任意取代基，只要其与整个分子结构相容即可。
必要时基团R1与R2或/及R3与R4间可以桥接。取代基R1至R4的具体实例是氢，卤素、羟基，胺及任选地取代的烷基例如C1至C6-烷基，氨基烷基，羟基烷基或者是烷氧基等等。特别优选R1至R4取代基中至少有一个基团含有生理条件下带有负电荷的基团，例如酸基如磷酸根，羧酸根或者磺酸根等。
式(8)所代表的化合物特别优选涉及(Z)-5-O-膦酰基亚吡哆基绕丹宁(3)，及其盐类、水合物或者立体异构体。
本发明的另一主题是制备式(8)的化合物的方法，其特征在于将式(9)化合物在诺文葛耳缩合反应中与式(10)化合物反应。
式(9)与(10)中X1,X2,X3,Y,Z,R1至R5和R6如化合物(8)中所定义。该反应优选在合适溶剂或溶剂混合物中，以大致等摩尔比的式(9)式(10)化合物来进行。温度优选是从室温至溶剂的回流温度。
化合物(8)具备惊人的药学活性。因此，本发明的另一主题是药物组合物，该组合物作为有效成分包含如前所定义的化合物(优选不考虑权利要求1中的放弃)，以及任选的制药学上常用的添加剂、助剂，载体或者稀释物等。
根据本发明的化合物最重要的应用是治疗传染性疾病，例如病毒感染或寄生虫引起的疾病，霉菌引起的疾病或者是细菌性疾病。特别优选用于治疗由带鞘病毒如嗜肝细胞DNA病毒(Hepadnaviren)，疱疹病毒，或者是逆转录病毒(Retroviren)引起的病毒性疾病如艾兹病。
本发明化合物也被证实适用于治疗其他类型的病毒如流行性感冒病毒或乳头状瘤病毒等所引起的疾病。
对治疗寄生虫病如利什曼虫病或者是疟原虫病或锥虫病等本发明的化合物也同样很有效。这些化合物最适合用于艾兹病治疗。特别是与其他药剂(如AZT或DDI)配合进行联合治疗。
此外本发明化合物可用于治疗肿瘤疾病例如白血病，特别是T-细胞性白血病，皮肤癌如皮肤恶性黑瘤或者是皮肤出血性多发性特发性肉瘤等等。令人惊讶的是本发明化合物能够对癌细胞显示选择性细胞毒性作用，而对正常细胞则无该毒性作用。
上述化合物(8)还具有调节免疫系统功能从而适用于治疗自身免疫性疾患诸如多发性硬化症，阿尔茨海默氏病、红斑狼疮，重症肌无力，慢性关节炎、Ⅰ型糖尿病等，还可以治疗各种类型的神经变性疾病。
化合物(8)还可以例如作为维生素B6拮抗物治疗与维生素B代谢紊乱有关的疾病。
该化合物还可以治疗与酶催反应紊乱有关的疾病。本发明化合物对Caspasensystem的酶促反应起效应物，例如活化剂、抑制剂或是调节剂作用，尤其是可用作一氧化氮合成酶的抑制剂。
已经发现的事实还包括该化合物(8)影响T-淋巴细胞的肿瘤坏死因子-α(TNFα)的分泌功能。化合物(8)还可以结合细胞的CD38受体从而抑制艾兹病毒的gp41与细胞受体间的结合。以这种方式CD38的信息传导通路被中断这导致抑制合体细胞形成，一氧化氮的释放，因细胞程序死亡引起的T-细胞死亡，和个别细胞的溶解作用(Einzelzellysis)。
本发明化合物可以其本身用于治疗方面的用途，本发明化合物还可以作为与多价金属离子的螯合物或作为与生物分子例如核酸、蛋白质、脂类或脂肪酸等形成的非共价或/及共价结合物来使用。
按照本发明用于治疗的药物组合物的剂型可以例如是乳膏、软膏、针剂或口服液还可以是脂质体形式或片剂、糖衣丸或胶囊等剂型。用药的途径可以是局部或全身用药，局部或口服或经注射等方式用药，剂量可在很大幅度内变化，例如从0.01微克至1毫克每公斤体重，因具体疾病和用药方式而异。
还需要指出的是本发明化合物可用作检测试剂。其一方面可以放射性的，例如用3H、14C、32P或35S-等标记的衍生物的形式使用。优选是以未标记的形式使用。因为本发明化合物具强的着色或萤光特性，从而可在生物体系中简便检测。本发明所提出的化合物尤其适用于例如在诊断分析中鉴定生物分子例如单链核酸。本发明化合物还适用于结构分析例如蛋白质或核酸的序列分析。
这些化合物还适用于电致变色应用，例如作为分子数字式开关物质或pH值、温度或溶剂指示剂等等。
本发明的化合物或其衍生物还适合作为离子或者有机化合物等的吸附剂或基于其强的颜色和可逆的颜色变化而可用于装饰应用。在这方面尤其可提及的有该化合物的碱土金属盐类例如镁或者钙盐，其是以凝胶形式存在的。
本发明化合物其它的应用领域还有毫微技术(Nanotechnologie)，其中例如通过激光系统激发的单个发射萤光的染料分子或生物分子的衍生物可借助敏感的测试系统诸如CCD-摄像机或雪崩测试仪和光学技术，在薄层板上、在膜、细胞、液滴或在毛细管等中被检测或者定位。单个分子定位的其它可能途径是微型芯片(Minichip)上的光扫描近场显微术(Raster-Nahfeld-Mickroskopie)、聚丙烯酰胺凝胶中的同焦点显微术，例如核酸的双向或多向凝胶电泳法分析。
最后本发明还涉及化合物(8)的衍生物，这些衍生物通过水解降解而产生并且例如具有结构式(11),(12)或(13)。
以上结构式中X1,X2,X3,Y,Z,R1-R4、R5与R6如化合物(8)中所定义。
下面以实施例和附图进一步说明本发明
图1表示本发明的化合物(3)可使细胞免受艾兹病病毒的感染；图2图示化合物(3)的合成反应所伴随的水解反应的副产物。
实施例1．化合物(3)的制备方法粗产品的制备方法称取2-硫代-4-噻唑烷酮(绕丹宁)(M=133.18克/摩尔，n=28.76毫摩尔)3.83克并于一圆底烧瓶(带有回流冷凝管，容积为50毫升)中以150毫升的无水乙醇使其溶解。向上述圆底烧瓶中再加入7.63克的吡哆醛-5’-磷酸酯的单水合物(M=265.16克/摩尔；n=28.78毫摩尔)。后加入的化合物在低温时几乎不溶解。
上述圆底烧瓶内的反应物在水浴中并在搅拌下回流加热，吡哆醛-5’-磷酸酯单水合物开始渐渐溶解并依次呈现黄色、橙色，接着形成红色的悬浮液。沸腾二十分钟后经回流冷凝管加入150毫升水，因为该悬浮液开始喷涌。继续加热十分钟，致使反应产物(红色)析出并导致喷涌。然后在冷冻室(-18℃)中冷却不超过二小时。
粗产品的加工吸滤橙色的反应产物，用母液转移，并用100毫升的冰冷无水乙醇冲洗。将产品于干燥器中经无水氯化钙真空干燥。
产量9.85克橙黄色的粗产品(Z)-5-[[5-羟基-6-甲基-3-[(膦酰氧基)-甲基]-4-吡啶基]-亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。产物含有原料、副产物，虽经真空干燥仍含有乙醇和水份。
通过离子交换再沉淀纯化粗产品取9.85克的粗产品放入一圆底烧瓶(2000毫升容量)中再加入610毫升水使之悬浮。搅拌的同时少量多次地加入于室温(22℃)下的无水碳酸氢钠[n(NaHCO3)=238.10毫摩尔]的饱和溶液[β(NaHCO3)=100mg/ml]200毫升。至此溶液呈红色。将该溶液用238.10毫升(等于238.10毫摩尔)的1.0M盐酸滴定。再搅拌所得混合物15分钟。结束滴定(pH2)时反应物由红色转为黄色，析出酸(3)。吸滤化合物(3)并进行干燥(气压4毫巴、温度70℃，时间24小时)。再次干燥化合物(3)，条件油泵真空，气压0.001毫巴、室温。产量8.70克(83％，基于总合成)黄色无定形粉末(Z)-5-[[5-羟基-6-甲基-3-[(膦酰氧基)-甲基]-4-吡啶基]-亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。纯度重量计＞96％(1H-NMR)化合物(3)的分析包括1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR光谱，RP-18HPLC，快原子轰击质谱(FAB-MS)，红外光谱、紫外光谱和荧光光谱，下面列举对化合物(3)分析所得典型的数据。C11H11N2O6PS2,M=362.31g/mol.F.198℃-201℃(分解，未校正).FAB MS(MH+berechnet für m/z 362.99):m/z (rel.lnt.)363.0(12.0％,MH+),227.4(18.1％),270.4(8.7％),171.2(8.3％),282.4(7.1％),267.1(2.8％),283.4(2.1％),265.1(1.5％).1H NMR(TFA-d):δ2.91(s,3H,2′-CH3),5.42(d,|3J(31P,1H)|=8.0Hz,2H,5′-CH2-OPO3H2),7.76(s,1H,4′-CH),8.47(s,1H,6-CH).1H NMR(DMSO-d6):δ2.42(s,3H,2′-CH3),4.89(d,|3J(31P,1H)|=8.0Hz.2H,5′-CH2-OPO3H2),7.55(s,1H,4′-CH),7.84(s,1H,6-CH).1H NMR(吡啶-d5):δ2.72(s,3H,2′-CH3),5.62(d,|3J(31p,1H)|=7.5Hz,2H,5′CH2-OPO3H2),8,36(s,1H,4′CH),8,53(s,1H,6-CH).13C NMR,BB-entkoppell(TFA-d):δ16.83(s,2′-CH3),65.75(s,5′-CH2-OPO3H2),121.04,122.13(2s,C-4′),133.34(s,C-6),136.85,136.91(2s,RR′C-SR″),138,54(s,C-5),142.05(s,C-4),147.64(s,C-2),153.03(s,C-3),171.93(s,C=O),193.39(s,C=S).31P NMR(TFA-d):δ-4.24(s,R-OPO3H2).FT IR.(KBr):3430(v N-H,m),1713(v HN-C=O,s),1213(v P=O inRO(HO)PO2-,s),1046(v C=Sin S-CS-N,s),1024(v P=Oin RO(HO)PO2-,s).UV/VIS(H2O):λmax.1=232nm[A(1％/1cm)=373],λmax.2=308nm[A(1％/1cm)=271],λmax.3=353nm[A(1％/1cm)=413],λmax.4=454nm[A(1％/1cm)=227].US/VIS(MeOH):λmax.1=291nm[A(1％/1cm)=245],λmax.2=347nm[A(1％/1cm)=489].UV/VIS(DMSO):λmax=518nm[A(1％/1cm)=98].荧光激发光谱(ex)和荧光发射光谱(em)(DMSO)λem=575nm:λex.max.1=355m,λex.max.2=397nm,λex.max.3=451nm,λex.max.4=467nm,λex.max.5=483nm,λex.max.6=493nm,λex.max.7=518nm；λex=490nm:λex.max.=575nm.荧光激发光谱(ex)和荧光发射光谱(em)(吡啶)λem=575nm:λex.max.1=451nm,λex.max.2=467nm,λex,max.3=471nm,λex.max.4=483nm,λex.max.5=493nm,λex.max.6=518nm；λex=490nm:λex.max.=575nm.
2．化合物(6)的制备方法2.1取化合物(3)363毫克(相当于1.0毫摩尔)与20毫升0.10M氢氧化钠溶液(相当于2.00毫摩尔氢氧化钠)混合，再加入10.0毫升的无水乙醇，并将溶液冷却(温度为-18℃)24小时，吸滤细针状结晶。产量340毫克(63％)的红色的(Z)-5-[[3-羟基-2-甲基-5-[(膦酰氧基)甲基]-4-吡啶基]亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮-单钠盐-半十七(81/2)水合物(6)在元素分析前将化合物(6)在干燥活塞中干燥(水射流泵真空，气压0.1毫巴，温度70℃，时间为两天)，而得到深红色(Z)-5-[[5-羟基-6-甲基-3-[(膦酰氧基)甲基]-4-吡啶基]亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮-单钠盐-半五(21/2)水合物(6)2.2取干燥化合物(3)8.70克(相当于24.00毫摩尔)与氢氧化钠溶液(0.1摩尔浓度)240.0毫升(相当于24.00毫摩尔的氢氧化钠)混合之后向其中掺入124.00毫升的乙醇。这个混合物于-18℃保存24小时。然后过滤得到红色的沉淀物。得到7.55克73％的化合物(6)。
熔点205℃-208℃(分解，未校正)。
C11H10N2Na O6PS2o 21/2 H2O,M=429,33g/mol的计算值C30.77％H3,52％N6,52％，实测值C30,97％H3,43％N6,35％.FTIF(Kbr):3277(vO-H水，m，宽)，1700(vHN-C=O,w),1229(vP=O于RP(HO)PO2中，s),1198(v HN-C=S,s),1090(v C=S于S-CS-N中，s),973(vP-O-C于P-O-CH2-芳基中，2)。
3．单链核酸的鉴定方法本发明的化合物(3)与(6)可以同位素标记(例如3H,14C,32P或者35S)的形式作为探针应用于单链核酸的鉴定。
此外，化合物(3)/(6)可应用于单链DNA的萤光检测。(E)-立体异构体4在二甲亚砜中发射萤光，但是(Z)-立体异构体在水中呈现弱得多的萤光。在(E)立体异构体4结合于单链DNA上时，可通过在用DMSO萃取后出现的荧光来鉴定单链DNA。所采用的激发波长为420至500纳米。于二甲亚砜或吡啶中的发射波长为575纳米。
已证实的是化合物3,4和6与单链脱氧核糖核酸非共价缔合。这种非共价结合可通过紫外线(波长254或/及366纳米)辐射而光化学确定。其中化合物3和4与胸腺嘧啶-核碱基-甲基光化学反应，同时分解出H2S。
4．抑制一氧化氮合成酶的同功酶本发明的化合物(6)可抑制神经元、内皮和免疫性/可诱导的一氧化氮合成酶(NOS)的同功酶。其抑制常数(IC50)分别是61.25μM(对于nNOS),50μM(对于eNOS和iNOS)。这些常数按照如下方法测定，即在使用由CHO细胞分离出的重组人NOS同功酶的情况下，通过测定由(3H)精氨酸向(3H)瓜氨酸的转化来进行测定。
5．核酸的双向电泳法本发明的化合物(3)不论经放射性标记与否均可用于单链核酸的双向电泳分离。其中第一向是根据核酸分子的电荷差别，第二向则根据分子大小而分离核酸。化合物(3)与核酸之间的结合方式可以是缔合或共价结合。
6．医疗方面的用途本发明的化合物(3)或其衍生物作为药剂对于感染病原体的繁殖过程的影响特别有效，例如在宿主中的繁殖过程中出现一个中间阶段即“单链脱氧核糖核酸”的病原体(例如逆转录病毒、疤疹病毒或嗜肝细胞性病毒)。
6.1对艾兹病病毒(HIV)的抑制骨髓样HUT78细胞分别在不同情况下(在不存在或者分别存在1.87毫摩尔与0.187毫摩尔化合物(3)的情况下)使之受到HIV的感染。HIV的检验方法分光光度法检测p24抗原。如图1所示按照本发明即以化合物(3)处理过的细胞中检测不到p24，但对照组则从第七天开始出现p24抗原。
6.2治疗疱疹病病例男，十七岁，患有唇疤疹，经使用化合物(3)的乳剂(橄榄油/水)(约1毫克/毫升)治疗，处理方式局部涂抹。
结果数小时后可见患处皮肤全面好转。
6.3治疗流行性感冒病例男，51岁，患有病毒性流行性感冒，口服使用数滴化合物(3)的水/二甲亚砜溶液(约1微克/毫升)。经一个晚上症状即消失。
7．温度/溶剂-指示剂化合物(3)的(Z/E)-立体异构对温度(热致变色)和对溶剂表现依赖性(溶剂化显色)。因此，化合物(3)可用作温度指示剂或/及溶剂指示剂。
8．数字式开关功能本发明的化合物(3)和(4)的(Z/E)-立体异构对电场的设立表现依赖性(电致变色)。因此化合物(3)可用作数字式开关元件，这是由于化合物(3)较之化合物(4)具有不同的萤光光谱特性，例如当使用激光(波长480纳米)进行激发时。若将化合物(3)置于电场则可转化为化合物(4)并因此在480纳米激发后出现直至575纳米的萤光发射。
9．维生素B6-拮抗本发明的化合物(3)在新陈代谢中可起辅酶吡哆醛-5’-磷酸酯的拮抗剂的作用，因为化合物(3)与该辅酶所需的酶相结合，因此化合物(3)可抑制肿瘤细胞生长。
10．控制细胞繁殖本发明的化合物(3)可局部施用于皮肤肿瘤(恶性黑色素瘤，皮肤出血性多发性特发性肉瘤)以用于控制细胞繁殖/化学疗法/细胞郁滞期疗法(Cytostasetherapie)，任选结合紫外线照射疗法，或/及用于其他种类的皮肤病(特点是细胞分裂速度过快，如牛皮癣)以控制细胞繁殖。
本发明的化合物(3)与复制活性的单链脱氧核糖核酸部分的结合可通过紫外线辐射而光化学确定并导致局部有限的细胞毒性。
11．结构分析本发明的化合物(3)基于其颜色和萤光特性以及其可与生物分子如蛋白质的结合性而可应用于结构分析，例如用于蛋白质的氨基酸序列分析或脱氧核糖核酸的序列分析。
12．检测水解副产物利用质谱研究合成化合物(3)时因水解作用而出现副产物。
各有关化合物见图2。
权利要求
1．式(8)的化合物
结构式中X1,X2,X3相互独立地选自O,S和NR5；Y表示O或者S；Z表示CR5或者N；R1,R2,R3,R4,R5相互独立地选自任意的取代基；R6选自任选地取代的烃基和O，且n是零或者1，及其盐类、水合物和立体异构体，条件是该化合物不是亚吡哆基绕丹宁。
2．权利要求1的化合物，其中X1为O。
3．权利要求1或2的化合物，其中X2为NR5。
4．根据前述权利要求任一项的化合物，其中X3为S。
5．根据前述权利要求任一项的化合物，其中Y为S。
6．根据前述权利要求任一项的化合物，其中Z为CR5。
7．根据前述权利要求任一项的化合物，其中取代基R1-R4之一包含带负电荷基团。
8．根据前述权利要求任一项的化合物，其选自式(3)的(Z)-5[[5-羟基-6-甲基-3-[(膦酰氧基)-甲基]-4-吡啶基]-亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮及其盐类、水合物以及立体异构体。
9．式(8)化合物的制备方法其特征在于，在诺文葛耳缩合反应中将式(9)化合物与式(10)化合物反应，
其中X1,X2、X3、Y、Z、R1-R5和R6如权利要求1中所定义。
10．根据权利要求8的化合物的制备方法其特征在于，在诺文葛耳缩合反应中将吡哆醛-5’-磷酸酯与绕丹宁反应。
11．药物组合物，其特征在于，它包含根据权利要求1-8之一项的化合物作为活性成份以及任选的制药学上常用的添加剂，助剂、载体和稀释物。
12．根据权利要求1-8之一项的化合物的应用，用于制备治疗传染性疾病、肿瘤和自身免疫疾病的药物组合物。
13．根据权利要求12的应用，用于制备抗病毒剂。
14．根据权利要求13的应用，用于制备治疗由嗜肝细胞性病毒、疱疹病毒或逆转录病毒引起的病毒感染的药物。
15．根据权利要求1-8之一项的化合物的应用，用于制备治疗与维生素B代谢紊乱相关的疾病的药物组合物。
16．根据权利要求1-8之一项的化合物的应用，用于制备治疗与免疫系统功能紊乱相关的疾病的药物组合物。
17．根据权利要求1-8之一项的化合物的应用，用于制备治疗与酶催反应紊乱相关的疾病的药物组合物。
18．根据权利要求17的应用，用作一氧化氮合成酶的酶催活性的效应物。
19．根据权利要求1-8之一项的化合物用作检测试剂的应用。
20．根据权利要求19的应用，用于生物分子的鉴定。
21．根据权利要求20的应用，用于单链核酸的鉴定。
22．根据权利要求1-8之一项的化合物的应用，用于电致变色应用。
23．根据权利要求1-8之一项的化合物与生物分子的结合物。
24．式(11)、(12)或(13)的根据前述权利要求之一项的化合物的衍生物
其中X1、X2、X3、Y、Z、R1-R4、R5和R6如权利要求1中所定义。
全文摘要
本发明系有关新的诺文葛耳缩合反应产物,其制备方法及其应用,尤其是药物学和分析方面的应用。此外还公开了诺文葛耳缩合反应产物与生物分子的结合物。本发明的特征在于式(3)化合物。
文档编号A61P37/00GK1236369SQ97199496
公开日1999年11月24日 申请日期1997年11月7日 优先权日1996年11月7日
发明者安德里斯·约翰尼斯·凯塞尔, 沃尔特·欧伯苏尔 申请人:常和